一種驗證釀酒酵母Mbp1基因影響細胞形態(tài)的方法
【專利摘要】一種驗證釀酒酵母Mbp1基因影響細胞形態(tài)的方法，包括如下步驟：首先通過PCR反應構建Mbp1基因敲除組件，然后將該敲除組件分別轉化釀酒酵母兩種配型的單倍體細胞，并通過單倍體復倍得到敲除Mbp1基因的釀酒酵母突變菌株釀酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5，最后根據(jù)突變菌株細胞形態(tài)的變化來驗證Mbp1基因功能，若突變菌株細胞形態(tài)發(fā)生變化，則確定所述Mbp1基因與細胞形態(tài)相關。在分析細胞形態(tài)時，本發(fā)明采用流式細胞儀對細胞體積變化進行分析，具有快速簡單、耗時短和可大批量操作的優(yōu)點，對于快速鑒定和挖掘工業(yè)釀酒酵母菌株表型相關基因資源有重要意義。CCTCC M 20144092014.09.11
【專利說明】-種驗證釀酒酵母Mbp1基因影響細胞形態(tài)的方法

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術領域】，具體是一種驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài) 的方法。

【背景技術】
[0002] 根據(jù)用途及來源的不同，釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)分為模式菌株和 工業(yè)菌株，模式菌株的基因信息、遺傳背景較為清楚，有多種遺傳標記可以選擇，一般只是 作為實驗室研究的對象或工具；工業(yè)菌株一般是從自然界中篩選獲得的、對人們生活或生 產有價值的菌株，其遺傳信息不明了，沒有遺傳標記，對其進行改造或研究的難度較大。為 了更好地應用工業(yè)釀酒酵母菌株，亟需鑒定和挖掘工業(yè)釀酒酵母菌株的基因的功能。
[0003] 釀酒酵母Mbpl基因編碼Mbplp蛋白，該蛋白與Swi6p組成轉錄復合物MBF。MBF 是轉錄抑制因子[deBruinRAM,KalashnikovaTI，ChahwanC，etal.Constraining Gl-specifictranscriptiontolateGlphase:theMBF-associatedcorepressor Nrmlactsvianegativefeedback[J].Molecularcell, 2006,23(4) :483_496]。研究發(fā) 現(xiàn)，白色念珠菌（Candidaalbicans)在敲除Swi4基因和Swi6基因后會形成假菌絲，但單 獨敲除Mbpl不會出現(xiàn)假菌絲[HusseinB,HuangH,GloryA，etal.Gl/Stranscription factororthologuesSwi4pandSwi6pareimportantbutnotessentialforcell proliferationandinfluencehyphaldevelopmentinthefungalpathogenCandida albicans]。敲除釀酒酵母Mbpl基因對釀酒酵母細胞形態(tài)，如假菌絲形成是否有影響尚無 報道。
[0004] 基因敲除是指一種遺傳工程基因修飾技術，針對某個感興趣的遺傳基因，通過一 定的基因改造過程，令特定的基因功能喪失，并研究可能進一步對相關生命現(xiàn)象造成的影 響，進而推測該基因的生物學功能。目前構建基因敲除組件常用的方法是融合PCR。融合 PCR需要分別擴增出目標基因特定位點的上下游同源臂以及選擇性標記基因，然后再通過 一步或兩步PCR反應才獲得基因敲除組件。融合PCR方法不僅費時費力，且融合效率低。
[0005] 釀酒酵母的細胞有兩種生活形態(tài)，單倍體和二倍體。單倍體的生活史較簡單，通過 有絲分裂繁殖。在環(huán)境壓力較大時通常會死亡。二倍體是酵母的優(yōu)勢形態(tài)，可以通過簡單 的有絲分裂繁殖，但在外界條件不佳時能進入減數(shù)分裂，生成一系列單倍體的孢子。單倍 體的交配類型有兩種，即a型和a型，這兩種單倍體可以交配，重新形成二倍體。單倍體 酵母是a型還是a型，由單個基因座MAT所決定。MAT有一對等位基因MATa和MATa，它 們的片段大小不一樣，根據(jù)片段大小即可驗證單倍體酵母是屬于a型還是a型。直接對二 倍體菌株進行基因改造，得到的只是顯性突變，隱性突變會被漏掉。所以最好是先制備單倍 體，對單倍體進行改造，再將單倍體突變子通過有性交配恢復為二倍體，從而獲得二倍體突 變株。
[0006] 現(xiàn)有技術中，通常采用光學顯微鏡分析細胞體積，該方法繁瑣、需要用肉眼觀察、 容易產生誤差，不利于批量分析。


【發(fā)明內容】

[0007] 為了快速挖掘工業(yè)釀酒酵母菌株的基因資源，本發(fā)明提供一種驗證釀酒酵母Mbpl 基因影響細胞形態(tài)的方法。本方法敲除單倍體的Mbpl基因后進行單倍體復性，得到敲除 Mbpl基因的二倍體突變菌株釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,通過釀酒酵 母細胞形態(tài)的變化來判斷Mbpl基因是否與細胞形態(tài)相關。在分析細胞形態(tài)時，為了解決采 用光學顯微鏡分析細胞體積存在的繁瑣、容易產生誤差的問題，本發(fā)明采用流式細胞儀對 細胞體積變化進行分析，當細胞流通過流式細胞儀時，流式細胞儀發(fā)出的激光照射細胞而 發(fā)生散射，前向角散射（FSC)光與細胞的體積大小有關，并且FSC的強度與細胞大小成正 t匕。該方法具有快速簡單、耗時短和可大批量操作的優(yōu)點。本發(fā)明驗證了Mbpl基因影響釀 酒酵母細胞形態(tài)。證實了只敲除Mbpl基因的釀酒酵母會形成假菌絲，而現(xiàn)有技術中發(fā)現(xiàn)只 敲除Mbpl基因的白色念珠菌不會形成假菌絲。
[0008] 本發(fā)明構建敲除組件時，在引物中引入與Mbpl基因上下游同源以及與選擇性標 記基因互補的序列，即正向引物：與Mbpl基因上游同源的序列-選擇性標記基因正向引物； 反向引物：與Mbpl基因下游同源的序列-選擇性標記基因反向引物。通過一次PCR即可獲 得Mbpl基因敲除組件，即Mbpl基因上游同源臂-選擇性標記基因-Mbpl基因下游同源臂。 因為引物太長，本發(fā)明中敲除組件構建成功的關鍵是縮短退火時間，提高退火溫度。由于退 火溫度過高會使PCR效率過低，所以采用降落PCR這一簡易的方法進行優(yōu)化。降落PCR設 計多循環(huán)反應的程序，以使相連循環(huán)的退火溫度越來越低。由于開始時的退火溫度選擇為 高于估計的Tm值，隨著循環(huán)的進行，退火溫度逐漸降到Tm值，并最終低于這個水平，用于確 保第一個引物_模板雜交事件發(fā)生在最互補的反應物之間，即那些產生目的擴增產物的反 應物之間。
[0009] 本發(fā)明的技術方案如下：一種驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，包括 如下步驟：首先通過PCR反應構建Mbpl基因敲除組件，然后將該敲除組件分別轉化釀酒酵 母兩種配型的單倍體細胞，并通過單倍體復倍得到敲除Mbpl基因的釀酒酵母突變菌株釀 酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,最后根據(jù)突變菌株細胞形態(tài)的變化來驗證 Mbpl基因功能，若突變菌株細胞形態(tài)發(fā)生變化，則確定所述Mbpl基因與細胞形態(tài)相關。
[0010] 所述釀酒酵母為野生型二倍體工業(yè)釀酒酵母。
[0011] 所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指是否形成假菌絲。
[0012] 所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指細胞體積是否發(fā)生變化，所述細胞體積是否發(fā) 生變化是通過流式細胞儀進行分析。
[0013] 所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指單菌落形態(tài)是否發(fā)生變化。
[0014] 所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指SDS和剛果紅是否抑制菌株生長。
[0015] 所述敲除Mbpl基因的釀酒酵母是指首先敲除單倍體的Mbpl基因，然后通過單倍 體復倍獲得敲除Mbpl基因的二倍體釀酒酵母。
[0016] 本發(fā)明的釀酒酵母（Saccharomycescerevisiae)菌株LC5,該菌株已經(jīng)于2014 年9月11日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學保藏中心），保藏號為：CCTCCM 2014409。地址：中國武漢武漢大學，郵政編碼：430072。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：
[0018] 1、證實了Mbpl基因影響工業(yè)釀酒酵母細胞形態(tài)。
[0019] 2、證實了只敲除Mbpl基因的釀酒酵母會形成假菌絲，而現(xiàn)有技術中發(fā)現(xiàn)只敲除 Mbpl基因的白色念珠菌不會形成假菌絲。
[0020] 3、采用流式細胞儀對細胞體積變化進行分析，具有快速簡單、耗時短和可大批量 操作的優(yōu)點。
[0021] 4、本發(fā)明對于快速鑒定和挖掘工業(yè)釀酒酵母菌株表型相關基因資源有重要意義。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0022] 圖1為本發(fā)明實施例中以PUG為模板擴增敲除組件，其中，F(xiàn):正向引物，A:Mbpl 基因上游同源臂，C:KanMX基因5'端互補序列，R:反向引物，B:Mbpl基因下游同源臂，D: KanMX基因3'端互補序列。
[0023] 圖2為本發(fā)明實施例中敲除組件的瓊脂糖凝膠電泳圖，其中，M:DNA分子量 marker, 1 :敲除組件。
[0024] 圖3為野生型菌株和突變菌株的單菌落形態(tài)。
[0025] 圖4為野生型菌株和突變菌株的單細胞形態(tài)。
[0026] 圖5為野生型菌株和突變菌株在剛果紅平板上的菌落形態(tài)。
[0027] 圖6為野生型菌株和突變菌株在SDS平板上的菌落形態(tài)。

【具體實施方式】
[0028] 下面結合附圖和實施例對本發(fā)明的技術方案作進一步說明。
[0029] 以下實施例所涉及實驗材料如下：
[0030] 菌株和質粒：工業(yè)釀酒酵母菌株由廣西科學院生物科學與技術研究中心篩選獲 得；質粒PSH65和PUG6分別購自寶賽生物科技有限公司。
[0031] 試劑盒和試劑：TIANprepMiniPlasmidKit購自天根生化科技（北京）有限公 司，rTaq酶等PCR相關試劑購自TaKaRa公司，其它試劑為進口分析純或國產產品。
[0032] 下述實施例中的方法，如無特別說明，均為常規(guī)方法。
[0033] 以下實施例所涉及引物如表1所示。
[0034] 表1引物序列表
[0035]

【權利要求】
1. 一株釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae)菌株LC5,其特征在于，該菌株已經(jīng)于 2014年9月11日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（武漢大學保藏中心），保藏號為：CCTCC M 2014409。
2. -種驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于，包括如下步驟：首 先通過PCR反應構建Mbpl基因敲除組件，然后將該敲除組件分別轉化釀酒酵母兩種配型的 單倍體細胞，并通過單倍體復倍得到敲除Mbpl基因的釀酒酵母突變菌株，最后根據(jù)突變菌 株細胞形態(tài)的變化來驗證Mbpl基因功能，若突變菌株細胞形態(tài)發(fā)生變化，則確定所述Mbpl 基因與細胞形態(tài)相關。
3. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述釀酒酵母為野生型二倍體工業(yè)釀酒酵母。
4. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指是否形成假菌絲。
5. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指細胞體積是否發(fā)生變化，所述細胞體積是否發(fā)生變化是 通過流式細胞儀進行分析。
6. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指單菌落形態(tài)是否發(fā)生變化。
7. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述突變菌株細胞形態(tài)的變化是指SDS和剛果紅是否抑制菌株生長。
8. 根據(jù)權利要求1所述的驗證釀酒酵母Mbpl基因影響細胞形態(tài)的方法，其特征在于：所述敲除Mbpl基因的釀酒酵母是指首先敲除單倍體的Mbpl基因，然后通過單倍體復倍獲 得敲除Mbpl基因的二倍體釀酒酵母。
【文檔編號】C12Q1/02GK104342378SQ201410482298
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年9月19日 優(yōu)先權日:2014年9月19日
【發(fā)明者】陳小玲, 張穗生, 羅貞貞, 陸琦, 吳仁智, 陳英 申請人:廣西科學院