細(xì)胞移植用臨床治療級(jí)真皮多能干細(xì)胞規(guī)模化制備培養(yǎng)方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了臨床治療級(jí)真皮多能干細(xì)胞的培養(yǎng)、篩選、擴(kuò)增技術(shù)，這些瓶頸一直是生物學(xué)干細(xì)胞領(lǐng)域研究熱點(diǎn)和難點(diǎn)，目前利用基底膜顯著黏附特性進(jìn)行分離純化，采用三維培養(yǎng)擴(kuò)增手段獲得。該發(fā)明適合依賴(lài)擴(kuò)增貼壁型細(xì)胞并提供三維高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)系統(tǒng)進(jìn)行目標(biāo)細(xì)胞水平的篩選與分離。高模擬體內(nèi)貼附環(huán)境，體外培養(yǎng)成體(胚胎皮膚)干細(xì)胞的生物細(xì)胞新培養(yǎng)技術(shù)。高模擬底物所在環(huán)境黏附篩選培養(yǎng)目標(biāo)真皮多能干細(xì)胞，具有高傳代能力，高增殖能力，并可在體外環(huán)境下形成分化全層真皮結(jié)構(gòu)。篩出免疫原性細(xì)胞安全獲得免疫逃逸，延長(zhǎng)移植時(shí)間增加組織工程臨床應(yīng)用，促進(jìn)創(chuàng)面愈合與皮膚疾病提供了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)臨床治療級(jí)細(xì)胞的解決方案。
【專(zhuān)利說(shuō)明】細(xì)胞移植用臨床治療級(jí)真皮多能干細(xì)胞規(guī)?；苽渑囵B(yǎng)方 法 一、【技術(shù)領(lǐng)域】：
[0001] 本發(fā)明屬于生物干細(xì)胞技術(shù)，組織工程領(lǐng)域。涉及一種體外構(gòu)建高模擬體內(nèi)貼附 環(huán)境分離篩選，皮膚干細(xì)胞的培養(yǎng)、擴(kuò)增技術(shù)。獲得臨床治療級(jí)真皮多能干細(xì)胞應(yīng)用于組織 工程皮膚構(gòu)建技術(shù)中的活性種子干細(xì)胞。
[0002] 二、【背景技術(shù)】介紹：
[0003] 皮膚是人體最大的器官，參與抵御生物入侵、紫外線輻射以及防止水分丟失、調(diào)節(jié) 體溫維持個(gè)體外貌等方面起著十分重要的生理作用，其是人體免疫系統(tǒng)組成的重要的一部 分，而皮膚細(xì)胞是構(gòu)成這器官的基本單元，皮膚細(xì)胞基礎(chǔ)研究領(lǐng)域是揭示皮膚健康、發(fā)育、 預(yù)防、治療的重要科研途徑。
[0004] 細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix,ECM)廣泛存在于細(xì)胞間隙的基本填充成分， 是細(xì)胞新陳代謝、生長(zhǎng)、繁殖、分化、表達(dá)、傳遞、互惠所依賴(lài)的極其重要場(chǎng)所。早期研究學(xué)者 認(rèn)為.外基質(zhì)只是一種組織內(nèi)、細(xì)胞外的單純的支持結(jié)構(gòu)。Hauschka和Konigsberg在1966 年研究發(fā)現(xiàn)填充組織間隙的膠原與促進(jìn)成肌細(xì)胞轉(zhuǎn)化肌管的現(xiàn)象。并在兩年之后，得以證 明學(xué)者們才對(duì)這種穩(wěn)定外物質(zhì)微環(huán)境有了新的認(rèn)識(shí)和思考。
[0005] Hay在11年后報(bào)道了 ECM對(duì)胚胎發(fā)育過(guò)程具有重要的誘導(dǎo)作用。ECM影響細(xì)胞行 為的現(xiàn)象得以關(guān)注并進(jìn)行廣泛的研究，但是并沒(méi)有成型的理論基礎(chǔ)佐證ECM與細(xì)胞的密切 關(guān)系。直到1982年有學(xué)者提出證明并建立ECM與細(xì)胞骨架和核基質(zhì)之間"動(dòng)態(tài)互惠"的模 型。在這個(gè)模中，ECM分子與細(xì)胞表面受體互相作用，然后把信號(hào)通過(guò)細(xì)胞膜傳導(dǎo)進(jìn)入細(xì)胞 漿中，引起從細(xì)胞骨架到細(xì)胞核的一系列變化，引起某些特定基因的表達(dá)。
[0006] 并證明這些基因的表達(dá)產(chǎn)物又可以反過(guò)來(lái)對(duì)ECM發(fā)生作用，今天的許多研究證實(shí) 了這個(gè)模型的合理性，并且證明細(xì)胞和ECM相互作用直接參與了細(xì)胞的黏附、生長(zhǎng)、游走、 分化和程序性死（凋亡）的過(guò)程；外基質(zhì)參與調(diào)節(jié)細(xì)胞因子、生長(zhǎng)因子的活性；還能夠直接 激活、啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制。由于這種對(duì)細(xì)胞的調(diào)節(jié)和對(duì)信號(hào)的傳導(dǎo)作用。因此，我們 必須充分了解細(xì)胞外基質(zhì)的化學(xué)的、物理的、生物學(xué)性質(zhì)和功能及其在組織的形成和修復(fù) 中的作用，才能更好地應(yīng)用這些生物材料構(gòu)建成為組織接受，乃至模擬組織完善再生的"生 物構(gòu)架"。我們建立的高擬細(xì)胞外基質(zhì)材料利用的恰是反向理論，指導(dǎo)我們深入開(kāi)展對(duì)ECM 的認(rèn)識(shí)，同時(shí)也反作用得到我們可利用的干細(xì)胞，這種研究模式促進(jìn)學(xué)科前行及發(fā)展。
[0007] 皮膚干細(xì)胞在正常皮膚組織中含量極少，干細(xì)胞公認(rèn)是一種在體內(nèi)具有無(wú)限更新 能力，且可分化形成相應(yīng)全層組織分化細(xì)胞，體外培養(yǎng)具有長(zhǎng)期生長(zhǎng)潛能并可形成無(wú)限克 隆。是愈合修復(fù)創(chuàng)面，皮膚更新代謝再生的重要參與者。但由于目前缺乏理想篩選方法，對(duì) 干細(xì)胞進(jìn)行篩選及鑒定方法報(bào)道較少。
[0008] 三、皮膚干細(xì)胞名稱(chēng)概述
[0009] 1981 年 Potten 提出，皮膚干細(xì)胞（skin stem cell)。表皮干細(xì)胞（epidermal sten cell，ESC)或角脫干細(xì)胞（Keratinocyte stem cell，KSC);真皮干細(xì)胞（dermis stem cell)、或真皮多能干細(xì)胞（dermal multipotent sten cell)或稱(chēng)為皮膚前體細(xì)胞 (skin-derived precursor)ο
[0010] 真皮間充質(zhì)細(xì)胞又叫真皮多能干細(xì)胞，來(lái)源于發(fā)育早期的中胚層和外胚層，具有 廣泛的分化潛能，可向多種中胚層和外胚層來(lái)源的組織細(xì)胞分化。近年來(lái)發(fā)現(xiàn)，這類(lèi)細(xì)胞廣 泛存在于成熟個(gè)體的多種組織中，并已證實(shí)問(wèn)充質(zhì)干細(xì)胞存在于骨髓、肌肉、大腦、骨膜等 組織中。真皮多能干細(xì)胞在體外培養(yǎng)時(shí)能分化成神經(jīng)元、神經(jīng)纖維、肌肉、脂肪等多種細(xì)胞。 [0011] 真皮多能干細(xì)胞存在于真皮層內(nèi)。其數(shù)量較少，周?chē)┝己茫瑺I(yíng)養(yǎng)豐富、所處微 環(huán)境具有優(yōu)異性；在損傷或生長(zhǎng)刺激等因素下可增殖，具有慢周期性；具有未分化細(xì)胞的 特征；自我更新增殖能力強(qiáng)；體外克隆能力突出等優(yōu)勢(shì)細(xì)胞特征。創(chuàng)傷修復(fù)的再生重建重 要愈合干性細(xì)胞。
[0012] 四、真皮多能干細(xì)胞概述
[0013] 真皮中多能干細(xì)胞的研究起步較晚，對(duì)于它的生物學(xué)認(rèn)識(shí)目前才剛剛開(kāi)始，因而 真皮多能干細(xì)胞目前尚未統(tǒng)一定義。但現(xiàn)在的研究結(jié)果證實(shí)，這種間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源的真 皮多能干細(xì)胞在成體內(nèi)參與皮膚的再生與修復(fù)過(guò)程.且皮膚創(chuàng)傷后造成的微環(huán)境對(duì)真皮 多能干細(xì)胞具有一定的調(diào)控作用，這可能是由于創(chuàng)傷后皮膚局部因子發(fā)生改變，促進(jìn)了真 皮多能干細(xì)胞的遷移分化，從而加速了創(chuàng)傷的修復(fù)。因而，有人推測(cè)干細(xì)胞與微環(huán)境之間的 相互作用是其參與修復(fù)的生理基礎(chǔ)（Watt、Van、史春夢(mèng)等.Shi等，2004)。真皮中多能干細(xì) 胞可作為真皮修復(fù)細(xì)胞的來(lái)源細(xì)胞，在毛囊和非毛囊的真皮中都有分布，但目前對(duì)其在真 皮內(nèi)的具體定位尚不清楚。但越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在毛囊的毛乳頭及毛囊真皮鞘中， 有具克隆性生長(zhǎng)的成體干細(xì)胞分布，這些細(xì)胞具有一定的分化潛能，而在毛乳頭中富含更 多的真皮多能干細(xì)胞（Jahoda等，2003 ;Legue等· 2005)。
[0014] 由于真皮多能干細(xì)胞相對(duì)易于獲得，同時(shí)能進(jìn)行多向分化，從而它在自體干細(xì)胞 基因治療方面有廣闊的基礎(chǔ)及臨床研究前景。
[0015] 五、真皮多能干細(xì)胞的特點(diǎn)
[0016] Toma等的研究結(jié)果表明，利用添加表皮生長(zhǎng)因子（EGF)和堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因 子（bFGF)的培養(yǎng)液對(duì)分離得到的真皮多能干細(xì)胞進(jìn)行體外培養(yǎng)，可形成球形克隆。目前的 資料顯示，真皮多能干細(xì)胞可在體外進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)，并能傳20代以上，具有強(qiáng)的增殖能力。 大量的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示=TGF-β抑制皮膚基底層角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖，但可促進(jìn)成纖維細(xì)胞 的生長(zhǎng)增殖。Yoko等研究證實(shí)在真皮多能干細(xì)胞的體外培養(yǎng)中添加 TGF-β，在保證細(xì)胞特 性穩(wěn)定的前提下，可進(jìn)一步促進(jìn)真皮多能干細(xì)胞的增殖，TGF-β在真皮多能干細(xì)胞的增殖 過(guò)程中具有一定的作用。
[0017] 在添加一定的因子（如地塞米松、維生素 C、維A酸等）的分化誘導(dǎo)體系中培養(yǎng)，真 皮多能干細(xì)胞可向骨樣細(xì)胞、軟骨樣細(xì)胞、脂肪樣細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞進(jìn)行分化，具有多向分 化潛能（Dyce等，2004)。Gorio等將分離的大鼠真皮多能干細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增后，再自體 移植入受損的脊索內(nèi).60?90d后觀察到移植的細(xì)胞依然存活，且分化為具有膠質(zhì)細(xì)胞及 神經(jīng)元細(xì)胞標(biāo)志分子的細(xì)胞。研究結(jié)果表明，真皮多能干細(xì)胞可能具有異質(zhì)性，含有一類(lèi)小 體積但功能更為原始的細(xì)胞群，人們利用基因芯片方法檢測(cè)到真皮多能干細(xì)胞表達(dá)多種不 同細(xì)胞類(lèi)型的特定轉(zhuǎn)錄因子，包括骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌肉等，這可能是其多向分化潛能的 分子基礎(chǔ)。
[0018] 六、真皮多能干細(xì)胞的分離及鑒別
[0019] 對(duì)真皮多能干細(xì)胞多采用貼壁篩選的方法進(jìn)行分離，同時(shí)利用這一方法并結(jié)合相 對(duì)特異標(biāo)識(shí)分子、增殖活性、分化潛能等幾方面對(duì)真皮多能干細(xì)胞加以鑒定。
[0020] 目前常根據(jù)特異性表面分子標(biāo)識(shí)物和無(wú)限更新分化能力有無(wú)的特點(diǎn)來(lái)鑒別干細(xì) 胞?，F(xiàn)在對(duì)真皮多能干細(xì)胞的研究并未發(fā)現(xiàn)特異的表面標(biāo)識(shí)物，但它能表達(dá)CD90、CD59、 CD44等表面分子，特別在于真皮多能干細(xì)胞可表達(dá)表達(dá)nes-tin，而與真皮成纖維細(xì)胞不 同的是它不表達(dá)波形絲蛋白，也無(wú)膠原分泌功能。
[0021] 真皮多能干細(xì)胞在有毛區(qū)和無(wú)毛區(qū)的真皮中均有分布。史春夢(mèng)等通過(guò)貼壁法分離 培養(yǎng)了大鼠和人包皮的真皮多能干細(xì)胞，表現(xiàn)出多能分化潛能，經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨細(xì)胞及脂 肪細(xì)胞分化。近年來(lái)，國(guó)外學(xué)者也通過(guò)干細(xì)胞培養(yǎng)基，分離培養(yǎng)了不同年齡段的人體真皮多 能干細(xì)胞克?。黄湓隗w外培養(yǎng)的克隆數(shù)、增殖能力的大小以及其分化能力，受年齡的影響。 目前雖對(duì)真皮多能干細(xì)胞的研究剛剛起步，但已有研究表明其在組織工程、基因治療及細(xì) 胞治療等方面具有潛在的應(yīng)用前景。
[0022] 七、傳統(tǒng)篩分方法介紹
[0023] 因?yàn)槠つw干細(xì)胞對(duì)基底膜有較強(qiáng)的粘附性，對(duì)細(xì)胞胞外基質(zhì)的粘附速度要比其它 類(lèi)型細(xì)胞快得多，所以利用該種特性進(jìn)行培養(yǎng)篩選。目前傳統(tǒng)的皮膚干細(xì)胞篩選如下闡 述：
[0024] 方法一（3T3滋養(yǎng)層法）：人類(lèi)皮膚細(xì)胞體外培養(yǎng)研究已有一個(gè)世紀(jì)的歷史背景， 建立體外擴(kuò)增培養(yǎng)體系于1975年由學(xué)者Rheinwald和Green所設(shè)計(jì)3TS-J2小鼠胚胎瘤的 成纖維細(xì)胞株3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞，并用γ射線致死劑量照射，防止干細(xì)胞受到異種物種的影 響。滅活3T3滋養(yǎng)層細(xì)胞作為培養(yǎng)皮膚細(xì)胞的滋養(yǎng)層能促進(jìn)皮膚細(xì)胞篩選的貼附和生長(zhǎng)， 并具有未被論證的接觸性抑制成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)的功能。實(shí)驗(yàn)室所選用的、功能較穩(wěn)定的各 亞系但還不能完全排除對(duì)它的顧慮，還需繼續(xù)觀察和探索有效的替代方法。Green研究這種 方法的3T3雖然它是一個(gè)異種的具有問(wèn)變性質(zhì)的細(xì)胞，有不少實(shí)驗(yàn)室曾試圖用其他措施予 以取代，但至今為止，它的效果在各種方法中仍是最有效的，繼續(xù)被廣泛應(yīng)用。從第1例臨 床應(yīng)用至令已近30年，尚未發(fā)現(xiàn)因它而造成的不良后果。
[0025] 方法二（纖維蛋白原及凝血酶底物法）=Graziella P學(xué)者研究用纖維蛋白原及凝 血酶作為基質(zhì)分離皮膚細(xì)胞；
[0026] 方法三（IV型膠原黏附法）Jone PH等利用上述方法從成人包皮或尸體皮經(jīng)消 化，利用IV型膠原做底物基質(zhì)分離皮膚細(xì)胞，所選用底物為異種膠原，存在不同種屬的污 染可能性，并且底物昂貴，不適合產(chǎn)業(yè)化規(guī)?；蜷L(zhǎng)期培養(yǎng)，適合試驗(yàn)性小劑量研究；
[0027] 方法四（流式細(xì)胞儀篩選法）：學(xué)者Van Rossum麗j與Kaur P等從人小塊活檢 組織中得到角朊細(xì)胞，利用整合素標(biāo)記異性標(biāo)志物利用流式細(xì)胞儀分離干細(xì)胞，選用方法 復(fù)雜且技術(shù)要求高，大體應(yīng)用integrinii 1，細(xì)胞黏附分子CD49,增列細(xì)胞核抗原（PCNA)等 多種標(biāo)記進(jìn)行特征分離，雖然干細(xì)胞得以篩選，但是會(huì)留有標(biāo)記物標(biāo)記滯留干細(xì)胞無(wú)法有 效去除，存在是否影響干細(xì)胞增殖、分化、變異性等。此方法適合標(biāo)記鑒定測(cè)定干細(xì)胞，并不 適合臨床應(yīng)用的干細(xì)胞富集方法；
[0028] 方法五（異種成纖維懸浮篩選法）：學(xué)者Hagar B利用DMEM、低鈣離子鼠成纖維細(xì) 胞條件培養(yǎng)液作為培養(yǎng)基，不用滋養(yǎng)層細(xì)胞。但有研究報(bào)導(dǎo)表皮干細(xì)胞與基底膜脫離可誘 發(fā)進(jìn)入分化周期，分化為過(guò)渡性擴(kuò)充細(xì)胞，據(jù)猜想皮膚細(xì)胞與基底膜的高粘附性有可能是 維持皮膚細(xì)胞控制分化特性的可能條件。所以如果不利用滋養(yǎng)層，有可能長(zhǎng)期培養(yǎng)過(guò)程中 皮膚細(xì)胞分化引起后續(xù)研究的不可控發(fā)展；
[0029] 方法六（同體成纖維貼附篩選法）：學(xué)者金巖等利用參考改進(jìn)學(xué)者Hagar B和 Dunnwald鼠成纖維細(xì)胞，改成供體預(yù)先體外擴(kuò)增的成纖維細(xì)胞為附著底物作為滋養(yǎng)層，培 養(yǎng)同體皮膚細(xì)胞，但是專(zhuān)利并沒(méi)有明確如何制備滋養(yǎng)層平皿的詳細(xì)步驟，鋪皿周期短，成纖 維貼壁力低，篩選反復(fù)PBS清洗純化過(guò)程會(huì)損失部分培養(yǎng)的目標(biāo)貼附成功的成纖維細(xì)胞， 從而降低目標(biāo)干細(xì)胞的得率，皮膚細(xì)胞理論上具有同體同原性，另一技術(shù)問(wèn)題在于，兩種細(xì) 胞在共有同一培養(yǎng)環(huán)境應(yīng)考慮培養(yǎng)液的復(fù)雜性，兩種細(xì)胞可能出現(xiàn)競(jìng)爭(zhēng)性的生長(zhǎng)增殖抑制 等現(xiàn)象，后續(xù)分離皮膚細(xì)胞存在技術(shù)難度，并不能優(yōu)于現(xiàn)有的六中常見(jiàn)方法，建議其可把此 方法改成復(fù)方加入其它覆皿效果好黏附行為比較大的其它篩選物同用增加目標(biāo)細(xì)胞得率， 或滅活成纖維鋪皿層細(xì)胞。
[0030] 方法七（甲基纖維素培養(yǎng)皿貼附篩選法）：國(guó)外學(xué)者利用添加甲基纖維素，用含 2% B27的DMEN/F12進(jìn)行真皮多能干細(xì)胞培養(yǎng)。甲基纖維素易被微生物破壞而腐敗，并且 該方法制備培養(yǎng)基溶液粘度加大不利于細(xì)胞自由伸展擴(kuò)增。影響相鄰細(xì)胞間的融合物質(zhì)交 換如營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，氣體交換等，諸多不確定不利因素。并且該無(wú)機(jī)材料不被機(jī)體吸收代謝，培 養(yǎng)過(guò)程中引入不易清除，不適于臨床治療級(jí)細(xì)胞要求。
[0031] 綜上所述，真皮多能干細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外基質(zhì)的黏附強(qiáng)快速特性，體外篩選培養(yǎng)的人 真皮多能干細(xì)胞得以在國(guó)內(nèi)外方法特異性快速發(fā)展。而真皮多能干細(xì)胞生物學(xué)性能，可 以做到增進(jìn)功能、本發(fā)明避免潛在有害基因及對(duì)真皮多能干細(xì)胞污染，在基礎(chǔ)科研、臨床治 療、干細(xì)胞研究方向、皮膚再生損傷修復(fù)、高擬組織工程皮膚的構(gòu)建方面等均有歷史時(shí)期的 重要不可取代的指導(dǎo)意義。
[0032] 八、組織工程皮膚背景介紹
[0033] 再生組織工程細(xì)胞建立系工作始于本世紀(jì)（Harrison 1907, Carrel 1912)，指導(dǎo) 引領(lǐng)著生物學(xué)，臨床醫(yī)學(xué)材料等各大銜接領(lǐng)域，成為重要的基礎(chǔ)科學(xué)之一。組織構(gòu)建和細(xì)胞 體外培養(yǎng)是至關(guān)重要的課題。從供體捐獻(xiàn)者活體取組織，模擬體內(nèi)生理環(huán)境等系列特定體 外微環(huán)境體系，進(jìn)行孵化培養(yǎng)、使得組織細(xì)胞健康生長(zhǎng)。
[0034] 組織工程皮膚建立早期應(yīng)用于修復(fù)燒傷和潰瘍以及其它皮膚損傷領(lǐng)域，麻省總醫(yī) 院的John F. Burke與MIT的Yannas I.V.合作，制備首次人工皮膚替代物。但是這種組織 皮膚替代物并不與細(xì)胞生物學(xué)相關(guān)，隸屬于組織工程皮膚支架材料學(xué)范疇。隨著細(xì)胞生物 學(xué)的基礎(chǔ)學(xué)科發(fā)展，人們開(kāi)始整合兩大學(xué)科，共同協(xié)作解決創(chuàng)傷皮膚修復(fù)構(gòu)建，真正的含活 性細(xì)胞組織工程皮膚在哈福大學(xué)Honward Green與MIT的Eugenen Bellhe合作完成。早 期定制皮膚移植救治取得了生物學(xué)醫(yī)學(xué)介矚目關(guān)注。
[0035] 20世紀(jì)80年代初期支架材料被FDA許可上市，由膠原網(wǎng)格組成的復(fù)合皮膚移植材 料被創(chuàng)造出來(lái)，內(nèi)層為牛膠原和硫酸軟骨素構(gòu)成，外層為硅膠樹(shù)脂，創(chuàng)面移植后內(nèi)層與創(chuàng)面 接觸被緩慢降解，數(shù)周后硅樹(shù)脂層移除，清創(chuàng)后覆蓋自體移植皮膚，覆蓋物被臨床所接受。
[0036] MIT的科學(xué)家Bellhe把材料學(xué)和生物學(xué)完美結(jié)合創(chuàng)造了組織工程皮膚并建立了 世界上第一家組織工程再生公司（Organogenesis Inc)，是科學(xué)界商人的典范。這家活性組 織工程皮膚先驅(qū)引領(lǐng)公司仍然是在人工皮膚市場(chǎng)占有率最高的組織工程公司之一。
[0037] 1997年通過(guò)美國(guó)FDA批準(zhǔn)上市的第一個(gè)組織工程產(chǎn)品由Advanced Bionhealing 公司生產(chǎn)的TransCyte。用于燒傷創(chuàng)面修復(fù)治療。該產(chǎn)品屬于膠原支架材料種植滅活性 的纖維細(xì)胞，成為商業(yè)化的第一個(gè)"異體無(wú)活性細(xì)胞組織工程真皮療法"。Dermagraft和 Integra以及Organogenesis Inc制造的Apligraf也獲得FDA批準(zhǔn)，利用新生兒包皮經(jīng)生 物學(xué)體外培養(yǎng)活性細(xì)胞，制備的組織工程皮膚，用于潰瘍皮膚和大面積燒傷再生治療。該產(chǎn) 品是嚴(yán)格意義上具有類(lèi)皮膚組織工程人工皮膚，含活性4?8傳代的細(xì)胞并具有完整表皮 真皮細(xì)胞構(gòu)建在組織工程支架之上可降解全層人工皮膚。并且部分剔除減少朗格漢斯細(xì) 胞，降低了受體的免疫排斥反應(yīng)，無(wú)活性的死亡細(xì)胞經(jīng)過(guò)創(chuàng)面組織液及相關(guān)體液因子代謝 的作用被分解可用于創(chuàng)面修復(fù)的小分子片段基礎(chǔ)營(yíng)養(yǎng)愈合物質(zhì)被創(chuàng)面吸收利用。這種產(chǎn)品 制成后置于_70°C保存，37°C迅速?gòu)?fù)蘇，復(fù)蘇后有50%的活性細(xì)胞具有活性，活性維持5天 通過(guò)快遞郵寄到指定的醫(yī)療部門(mén)。
[0038] 這些產(chǎn)品的市場(chǎng)準(zhǔn)入引領(lǐng)了嶄新的再生醫(yī)學(xué)組織工程皮膚時(shí)代開(kāi)創(chuàng)。
[0039] 基于國(guó)內(nèi)國(guó)際組織工程人工皮膚現(xiàn)狀，建立組織工程皮膚干細(xì)胞-高擬體內(nèi)細(xì)胞 外基質(zhì)，基質(zhì)附著體外篩選方法設(shè)計(jì)首例含有表皮干細(xì)胞與真皮多能干細(xì)胞的全層組織工 程人工皮膚產(chǎn)業(yè)化產(chǎn)品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0040] 1. -種用于篩選和培養(yǎng)真皮多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基組合，
[0041] 配制培養(yǎng)液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 B40. 5? I X 1(T4/L、維生素 Cl?3 μ g/ml、胰島素2?4ug/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、維生素 Cl? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml。
[0042] 配制培養(yǎng)液B :滅活胎牛血清80ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 維生素 B40. 5 ?I X 1CT4/L、霍亂霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰島素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF)5?40ng/ml、 氫化可的松〇. 3yg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12(l : 1)定容到SOOmLPH?. 2? 7. 4。
[0043] 配制培養(yǎng)液C :滅活胎牛血清60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、 維生素 B40. 5 ?I X 10 4/L、膜島素 4 ?6 μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGFlO ?18ng/ml、牛 腦垂體提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF) 15?40ng/ml、氫化可的松0. 3 μ g/ 1111、商用培養(yǎng)基01^]?與商用培養(yǎng)基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
[0044] 2. -種制備高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處 理；b)脫細(xì)胞處理；優(yōu)選地，還進(jìn)一步包括將消毒或經(jīng)脫細(xì)胞處理的皮膚進(jìn)一步進(jìn)行低溫、 脫水、輻照滅菌處理；更優(yōu)選地步驟b)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶-非離子表面活 性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液法。
[0045] 3.權(quán)利要求2所述方法，其中冷酶交聯(lián)劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷 消12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，PH在7. 20?7. 40之間，交聯(lián)4?6h，超 純水或注射用水沖洗8?10次。
[0046] 4.權(quán)利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法是：0. 1? 0· 25%中性蛋白酶與0· 01?0· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用 24 ?48h。
[0047] 5.權(quán)利要求2所述方法，其中絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0. 01? 0·02%EDTA含0·6?0·8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0·2?0·5%SDS 溶液，室溫下作用30?60min)。
[0048] 6.權(quán)利要求2所述方法，其中胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是：0. 25?0. 40%胰蛋白酶 和0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯(lián)液中交聯(lián)4?6h。交聯(lián) 后用超純水或注射用水沖洗8?10次。
[0049] 7.由權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。
[0050] 8.權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)或者權(quán)利要求7所述的 高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)在篩選皮膚干細(xì)胞中的用途。
[0051] 9. 一種利用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合和權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基 質(zhì)篩選和培養(yǎng)真皮多能干細(xì)胞的方法，包括：
[0052] a)制備真皮多能干細(xì)胞懸液：取材，消化，用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液A終止消 化，剝離表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集細(xì)胞混懸液。離心后加入培養(yǎng)液A養(yǎng) 液；
[0053] b)真皮多能干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)：將權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)加入 權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液B，加入步驟a)制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標(biāo)真皮多能干細(xì)胞 貼壁粘附于高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)；
[0054] c)消化富集傳代培養(yǎng)：消化，離心后加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培 養(yǎng)。
[0055] 優(yōu)選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細(xì)胞，免疫逃逸方法可以為射線法、 低溫凍融法

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0056] 圖1高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)制備流程
[0057] 圖2細(xì)胞篩選培養(yǎng)
[0058] -、高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)種類(lèi)
[0059] (涉及的皮膚均為器官捐獻(xiàn)，包皮環(huán)切皮膚、以及醫(yī)療救治過(guò)程中植皮取皮廢棄皮 膚組織）
[0060] 1. 1其特征在于：針對(duì)本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體 內(nèi)真皮層作為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚真皮多能干細(xì)胞篩選分離和體外培 養(yǎng)的方法，并使獲得的高純度真皮多能干細(xì)胞。
[0061] 1.2其特征在于：針對(duì)本發(fā)明技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀，本發(fā)明的目的是提供一種高擬體 內(nèi)全層皮膚作為為細(xì)胞外基質(zhì)為篩選貼附，成體或胚胎皮膚皮膚干細(xì)胞篩選分離和體外培 養(yǎng)的方法，并使獲得的高純度皮膚干細(xì)胞。皮膚細(xì)胞包括：（真皮多能干細(xì)胞、毛囊干細(xì)胞、 表皮干細(xì)胞、及其它皮膚附件附屬相關(guān)的干細(xì)胞及皮膚相關(guān)細(xì)胞）。
[0062] 這種篩選分離和體外培養(yǎng)的方法，獲得的真皮多能干細(xì)胞細(xì)胞克服以上傳統(tǒng)七種 方法的缺陷。
[0063] 發(fā)明屬生物成體（胎兒）干細(xì)胞細(xì)胞【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及真皮多能干細(xì)胞的分離與培 養(yǎng)方法。方法特征包括：同體表皮、真皮、全層脫細(xì)胞表皮底物預(yù)備；同體真皮細(xì)胞的分離； 利用高擬體內(nèi)附著基質(zhì)真皮多能干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)。目前用該法在體外已穩(wěn)定培養(yǎng)傳代 超過(guò)20?30 (代），經(jīng)體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)該細(xì)胞無(wú)細(xì)胞毒，具有強(qiáng)的增殖能力，并可以形成成 熟的全層分化真皮層結(jié)構(gòu)為有關(guān)皮膚干細(xì)胞在科研、教學(xué)及臨床的應(yīng)用起到不可估量的作 用，同時(shí)孕育著巨大學(xué)術(shù)方向與社會(huì)效益和經(jīng)濟(jì)效益。通過(guò)此種方法理論基礎(chǔ)推進(jìn)我國(guó)其 他干細(xì)胞的學(xué)術(shù)基礎(chǔ)建立。
[0064] 二、高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)構(gòu)成：
[0065] 經(jīng)分析含有多種膠原并包含IV型、其中I型膠原含量最大（I與III型膠原的比 例為10 : 1)，同時(shí)還保留了完整的基底膜結(jié)構(gòu)。
[0066] 三、高擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)底物孔隙率與黏附表面特征：
[0067] 高擬底物電鏡觀察，測(cè)定表皮黏附的底物組織再生的基底膜孔隙直徑為32? 145um，促進(jìn)黏附真皮組織再生底物基底膜多孔孔隙直徑為72?191 μ m。這種孔隙率所購(gòu) 建的空間黏附表面均有利干細(xì)胞黏附附著生長(zhǎng)、增殖、分化。
[0068] 通過(guò)以上制備方法；有效的保留了皮膚細(xì)胞外基質(zhì)的微觀構(gòu)架和完整的基底膜結(jié) 構(gòu)，其主要成分包括各型膠原、彈性蛋白、蛋白多糖及糖胺多糖等不溶性基質(zhì)成分，可為真 皮干細(xì)胞等快速粘附、表皮干細(xì)胞、增殖擴(kuò)展提供有力的支持。因此，高擬底物是目前最理 想的組織工程皮膚干細(xì)胞篩選的解決方案。
[0069] 四、皮膚干細(xì)胞高擬擬體內(nèi)細(xì)胞基質(zhì)制備具體實(shí)施步驟與方法：
[0070] 一、包括以下兩個(gè)步驟種方法：
[0071] 步驟一：皮膚消毒處理過(guò)程：取供體皮膚包括以下（胚胎皮膚、成體包皮外板、頭 皮、腋下皮膚、及軀干皮膚均可）含表皮真皮結(jié)構(gòu)的斷層皮膚，剪切成組織塊浸泡在生理鹽 水稀釋含〇. 05?0. 1 %苯扎溴銨溶液中10?15min，消毒處理，用無(wú)菌生理鹽水反復(fù)沖洗 殘余苯扎溴銨。
[0072] 步驟二：低溫-60?-80°C冷凍干燥，真空度達(dá)到20?llOpa，脫去組織塊90? 95%以上水分，取出密封與真空包裝，經(jīng)輻照25?60KGY劑量滅菌。終品可以在室溫中保 存長(zhǎng)達(dá)5年。啟動(dòng)只需浸泡37°C，PBS液或下面所述營(yíng)養(yǎng)液復(fù)蘇15?30min即可應(yīng)用，浸 泡延長(zhǎng)至10?12h效果更佳。使用后并且應(yīng)用去細(xì)胞漂洗液（見(jiàn)下方法中相應(yīng)提及適合 的脫細(xì)胞液）脫細(xì)胞處理、再經(jīng)過(guò)上述過(guò)程永生反復(fù)使用的特點(diǎn)。
[0073] 1 :步驟二【具體實(shí)施方式】：
[0074]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于篩選和培養(yǎng)真皮多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基組合， 配制培養(yǎng)液A :滅活胎牛血清40?60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白5?15 μ g/ml、維生素 B40. 5? 1X1(T4/L、維生素 C1?3μ g/ml、胰島素2?4μ g/ml、霍亂霉素2. 5?4. 5u/L、維生素 C1? 3μg/ml、EGF5?25ng/ml、氫化可的松0.4μg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM/F12(3:l)定容到 500ml〇 配制培養(yǎng)液B :滅活胎牛血清80ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、維 生素 B40. 5 ?1XKTVL、霍亂霉素 2. 5 ?3. 5u/L、胰島素 4 ?6μ g/ml、EGF5 ?25ng/ml、 bFGFlO?18ng/ml、牛腦垂體提取物（ΒΡΕ) 1?3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF)5?40ng/ml、 氫化可的松〇. 3yg/ml、商用培養(yǎng)基DMEM與商用培養(yǎng)基F12(l : 1)定容到δΟΟπιΚΡΗ?. 2? 7. 4。 配制培養(yǎng)液C :滅活胎牛血清60ml、轉(zhuǎn)鐵蛋白6?17 μ g/ml、腺苷10?25mg/ml、維生 素 B40. 5 ?1 X 10 4/L、膜島素 4 ?6ug/ml、EGF5 ?25ng/ml、bFGF10 ?18ng/ml、牛腦垂體 提取物（ΒΡΕ) 2?3mg/L、干細(xì)胞生長(zhǎng)因子（SCF) 15?40ng/ml、氫化可的松0. 3 μ g/ml、商用 培養(yǎng)基〇1^]?與商用培養(yǎng)基？12(1:1)定容到50〇1111。？!17.2?7.4。
2. -種制備高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)的方法，包括以下步驟：a)取材及皮膚消毒處理；b) 脫細(xì)胞處理；優(yōu)選地，還進(jìn)一步包括將消毒或經(jīng)脫細(xì)胞處理的皮膚進(jìn)一步進(jìn)行低溫、脫水、 輻照滅菌處理；更優(yōu)選地步驟b)的脫細(xì)胞方法選自冷酶交聯(lián)劑法、酶-非離子表面活性 劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法、絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法或胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液法。
3. 權(quán)利要求2所述方法，其中冷酶交聯(lián)劑法是：加入0. 1?0. 25%蛋白酶冰浴冷消 12?48h。用含0. 25%戊二醛磷酸緩沖溶液，PH在7. 20?7. 40之間，交聯(lián)4?6h，超純 水或注射用水沖洗8?10次。
4. 權(quán)利要求2所述方法，其中酶-非離子表面活性劑-絡(luò)合劑聯(lián)合法是：0. 1?0. 25% 中性蛋白酶與〇· 01?〇· 02% EDTA，TritonX-100(0. 3?0· 6% )溶液，室溫下作用24? 48h。
5. 權(quán)利要求2所述方法，其中絡(luò)合劑加鹽-陰離子表面活性劑法是：0. 01?0. 02% EDTA含0. 6?0. 8mol/L氯化鈉溶液，37°C下作用12?24h，后用（0. 2?0. 5% SDS溶液， 室溫下作用30?60min)。
6. 權(quán)利要求2所述方法，其中胰酶聯(lián)合EDTA交聯(lián)液是：0. 25?0. 40 %胰蛋白酶和 0. 02?0. 04%EDTA(1 : 2)，37°C快速消化10?60min。交聯(lián)液中交聯(lián)4?6h。交聯(lián)后用 超純水或注射用水沖洗8?10次。
7. 由權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)。
8. 權(quán)利要求2-6所述任一方法制備的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)或者權(quán)利要求7所述的高擬 體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)在篩選皮膚干細(xì)胞中的用途。
9. 一種利用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)基組合和權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)篩 選和培養(yǎng)真皮多能干細(xì)胞的方法，包括： a) 制備真皮多能干細(xì)胞懸液：取材，消化，用權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液A終止消化，剝 離表皮收集皮片，置消化液配制B或C中，收集細(xì)胞混懸液。離心后加入培養(yǎng)液A養(yǎng)液； b) 真皮多能干細(xì)胞的篩選及培養(yǎng)：將權(quán)利要求7所述的高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)加入權(quán)利 要求1所述的培養(yǎng)液B，加入步驟a)制備的細(xì)胞懸液，培養(yǎng)，清洗，目標(biāo)真皮多能干細(xì)胞貼壁 粘附于高擬體內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)，加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液c進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)； C)消化富集傳代培養(yǎng)：消化，離心后加入權(quán)利要求1所述的培養(yǎng)液C進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)。 優(yōu)選地，免疫逃逸方法處理取材前皮膚或獲得細(xì)胞，免疫逃逸方法可以為射線法、低溫 凍融法。
【文檔編號(hào)】C12N5/074GK104263699SQ201410482325
【公開(kāi)日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年9月19日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月19日
【發(fā)明者】朱寧文, 王凌儀 申請(qǐng)人:江蘇華億細(xì)胞組織工程有限公司