免疫應(yīng)答的引發(fā)的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及使用恒定鏈連接的抗原的引發(fā)免疫應(yīng)答的技術(shù)和方法，當(dāng)這些用于引發(fā)使用任何合適疫苗的后續(xù)加強(qiáng)免疫接種時(shí)。
【專利說明】免疫應(yīng)答的引發(fā)
[0001] 本申請(qǐng)是國際申請(qǐng)日為2009年11月20日、國際申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/DK2009/050310、進(jìn) 入國家階段的申請(qǐng)?zhí)枮?00980154924. 4、發(fā)明名稱為"免疫應(yīng)答的引發(fā)"的PCT申請(qǐng)的分案 申請(qǐng)。
[0002] 本申請(qǐng)中引用的所有專利和非專利參考文獻(xiàn)在此通過引用整體并入。

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0003] 本發(fā)明涉及使用恒定鏈連接的抗原的引發(fā)免疫應(yīng)答的技術(shù)和方法（當(dāng)這些用于引 發(fā)使用任何合適疫苗的后續(xù)加強(qiáng)免疫接種時(shí))。

【背景技術(shù)】
[0004] 疫苗接種是給受試者施用抗原材料(疫苗)，以便產(chǎn)生對(duì)疾病或狀況的免疫。當(dāng)用 于刺激免疫應(yīng)答時(shí)，抗原被稱為免疫原，并且該過程被稱為免疫接種。疫苗接種涉及一種或 多種免疫原的施用，這可以以幾種形式施用。
[0005] 疫苗接種要求實(shí)體免疫應(yīng)答的建立。由感染或疫苗接種激活的免疫應(yīng)答依賴于幾 種細(xì)胞類型例如T、B和抗原呈遞細(xì)胞，以及幾種不同分子主要是抗原、MHC分子、T和B細(xì) 胞受體及許多其他的相互作用。
[0006] 常規(guī)疫苗或第一代疫苗基于被殺死或減毒的致病菌株。這些通常具有減少的傳染 力，并且它們通常是無足夠的免疫原性的，導(dǎo)致來自疫苗接種的不充分保護(hù)。
[0007] 基于來自致病生物的個(gè)別抗原蛋白質(zhì)的第二代疫苗或亞單位疫苗的開發(fā)已揭示 純肽或碳水化合物趨于是弱免疫原。
[0008] DNA疫苗或第三代疫苗具有誘導(dǎo)較廣泛范圍的免疫應(yīng)答類型的能力，但維持在人 中具有低免疫原性的潛在缺點(diǎn)。
[0009] 對(duì)于所有類型的疫苗，疫苗接種程序面對(duì)關(guān)于增加疫苗效力的未滿足需要，以克 服上述局限性且提供在疫苗接種過程中刺激免疫系統(tǒng)的更經(jīng)濟(jì)方法。
[0010] 本發(fā)明目標(biāo)在于通過提供用于增加疫苗效力的解決方案來解決與疫苗的低免疫 原性相關(guān)的問題。
[0011] 本發(fā)明目標(biāo)在于通過提供用于引發(fā)免疫應(yīng)答的解決方案來解決與疫苗的低免疫 原性相關(guān)的問題。
[0012] 本發(fā)明因此涉及用核酸構(gòu)建體引發(fā)免疫系統(tǒng),所述核酸構(gòu)建體包括MHC II類結(jié)合 的恒定鏈/CD74 (本文被稱為恒定鏈或Ii)或其變體，且編碼至少一種抗原蛋白質(zhì)或所述抗 原蛋白質(zhì)的片段，隨后為后續(xù)加強(qiáng)疫苗接種，以增加所述疫苗的效力。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。
[0014] 本文呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示使用包括恒定鏈或其變體的核酸構(gòu)建體開發(fā)引發(fā)-加強(qiáng)方 案并不間單。
[0015] 令人驚訝的是，本發(fā)明公開了可以改變來自恒定鏈的Ii-KEY(包括LRMK氨基酸殘 基）和/或Ii-CLIP結(jié)構(gòu)域的部分，而不減少所述免疫引發(fā)的效應(yīng)。
[0016] 不充分地解決這個(gè)問題的現(xiàn)有技術(shù)參考文獻(xiàn)在下文討論： WO 2007/062656 (Holst等人）涉及開發(fā)改良DNA疫苗，以這樣的方式刺激免疫應(yīng)答， 所述方式增加應(yīng)答的動(dòng)力學(xué)，同時(shí)伴隨擴(kuò)大且改善應(yīng)答。Holst等人發(fā)現(xiàn)抗原與恒定鏈的融 合通過⑶4+T細(xì)胞獨(dú)立機(jī)制顯著增強(qiáng)隨后的抗病毒⑶4+和⑶8+T細(xì)胞應(yīng)答。
[0017] Holmes 等人（J Clin Oncol. 2008, Jul 10 ;26 (20) :3426-33)描述了 Ii-key 雜 合肽疫苗的首次人I期試驗(yàn)，其中Ii-key包括LRMK 4氨基酸序列，恒定鏈蛋白質(zhì)的中心部 分。
[0018] Kallinteris 等人的發(fā)現(xiàn)（Expert Opin. Biol. Ther. 2006,6 (12): 1311，1321) 也涉及利用包括LRMK氨基酸的Ii-key部分用于增強(qiáng)疫苗效力。
[0019] US 2008/0095798 (Humphreys等人)公開了用于增加疫苗針對(duì)病原體的效力的方 法，通過首先用包括所述Ii-key肽的LRMK殘基的Ii-Key雜合肽構(gòu)建體引發(fā)受試者的免疫 系統(tǒng)，并且隨后施用針對(duì)病原體的疫苗以加強(qiáng)在引發(fā)步驟中產(chǎn)生的免疫應(yīng)答。
[0020]


【發(fā)明內(nèi)容】
本發(fā)明顯示用核酸構(gòu)建體引發(fā)免疫系統(tǒng),所述核酸構(gòu)建體包括至少一種MHC II類結(jié)合 的恒定鏈/CD74 (本文被稱為恒定鏈或Ii)或其變體，且編碼至少一種抗原蛋白質(zhì)或所述抗 原蛋白質(zhì)的片段，隨后為后續(xù)加強(qiáng)疫苗接種增加所述疫苗的效力。
[0021] 根據(jù)本發(fā)明的疫苗可以涉及致病性抗原或癌抗原。
[0022] 令人驚訝的是，本發(fā)明公開了 Ii-KEY結(jié)構(gòu)域(包括LRMK氨基酸殘基）和/或 Ii-CLIP結(jié)構(gòu)域的部分可以從恒定鏈中部分置換或省略，而不降低所述引發(fā)的作用。
[0023] 因此，本發(fā)明已解決了通過采用二步引發(fā)-加強(qiáng)方案的疫苗接種而產(chǎn)生的充分 刺激免疫應(yīng)答的問題，由此首先用包括恒定鏈或其變體的核酸構(gòu)建體引發(fā)免疫系統(tǒng)，隨后 為以這樣的方式使用任何類型的合適疫苗的后續(xù)加強(qiáng)免疫接種，所述方式增加應(yīng)答的動(dòng)力 學(xué)，同時(shí)伴隨擴(kuò)大且改善應(yīng)答。特別地，在此可提供用于直接、特異和快速刺激免疫系統(tǒng)的 新型系統(tǒng)，以便改善所有動(dòng)物例如人的疫苗接種方案。
[0024] 這個(gè)問題通過在權(quán)利要求中表征的本發(fā)明的實(shí)施方案得到解決。通過本發(fā)明，發(fā) 現(xiàn)用基于Ii鏈的核酸構(gòu)建體的引發(fā)顯著增加在用疫苗后續(xù)加強(qiáng)后的抗原特異性CD8 + T細(xì) 胞、⑶4+ T細(xì)胞和/或B細(xì)胞生成。
[0025] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼與 至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈 或其變體，其中所述核酸構(gòu)建體能夠引發(fā)免疫系統(tǒng)，以增強(qiáng)在受試者中施用后續(xù)疫苗后的 免疫接種。
[0026] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼 與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定 鏈或其變體，其中通過在受試者中施用后續(xù)疫苗，所述核酸構(gòu)建體能夠引發(fā)免疫接種。
[0027] 在一個(gè)實(shí)施方案中，在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中包括的恒定鏈可以由其野生型序列 加以改變，而不減少Ii的效應(yīng)。
[0028] 因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，包括LRMK氨基酸殘基的Ii-KEY結(jié)構(gòu)域已通過缺失或置 換例如突變加以改變。
[0029] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，Ii-CLIP結(jié)構(gòu)域的部分已通過缺失或置換例如突變加以改 變。Ii-CLIP結(jié)構(gòu)域可以具體地通過將在位置91和99上的甲硫氨酸置換為丙氨酸而改變； 這令人驚訝地增加 MHCII呈遞。
[0030] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，Ii可以具體地通過缺失Ii的前17個(gè)氨基酸而改變；這令 人驚訝地增加記憶應(yīng)答。
[0031] 由此可見這些改變各自可以分開或組合發(fā)生。
[0032] 在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)用于引發(fā)針對(duì)病毒、微生物例如細(xì)菌或寄生蟲的疫苗的免 疫應(yīng)答時(shí)，在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中包括的恒定鏈由其野生型序列加以改變。
[0033] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)用于引發(fā)癌癥疫苗或針對(duì)異常生理學(xué)應(yīng)答的疫苗的免疫 應(yīng)答時(shí)，在本發(fā)明的核酸構(gòu)建體中包括的恒定鏈可以由或不由其野生型序列加以改變。 [0034] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，用于引發(fā)免疫應(yīng)答的核酸構(gòu)建體和用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答的后 續(xù)疫苗的至少一個(gè)部分是等同的。引發(fā)物和加強(qiáng)物（booster)的所述至少一個(gè)等同部分可 以是Ii或其變體、抗原肽或抗原肽的部分、或遍在的輔助T細(xì)胞表位。
[0035] 同樣本發(fā)明的一個(gè)目的是提供包括如本文詳述的核酸構(gòu)建體的遞送媒介物 (vehicle)，其中所述遞送媒介物是基于RNA的媒介物、基于DNA的媒介物/載體、基于脂質(zhì) 的媒介物、基于聚合物的媒介物或病毒衍生的或DNA或RNA媒介物。
[0036] 在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述遞送媒介物包括脂質(zhì)體的形成、生物可降解聚合物 微球體的形成、核酸構(gòu)建體包被到膠體金顆粒上或摻入病毒衍生的DNA或RNA載體內(nèi)。
[0037] 在另外一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述核酸構(gòu)建體或所述遞送媒介物借助于針注射、 基因槍、射流注射（jet injection)、電穿孔、超聲或水動(dòng)力遞送進(jìn)行施用。
[0038] 因此，本發(fā)明的一個(gè)方面是提供通過包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體刺激免疫應(yīng)答 的方法，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地 連接的至少一種恒定鏈或其變體。
[0039] -個(gè)進(jìn)一步目的提供刺激在這些中的任何或這些中的任何的任何部分內(nèi)編碼的 核酸構(gòu)建體或蛋白質(zhì)的細(xì)胞內(nèi)散布的裝置（means)。
[0040] 本發(fā)明的另外一個(gè)目的是提供如由本文描述的核酸構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白質(zhì)。
[0041] 本發(fā)明的一個(gè)進(jìn)一步方面是提供識(shí)別由本文描述的核酸構(gòu)建體編碼的嵌合蛋白 質(zhì)的抗體。
[0042] 本發(fā)明的一個(gè)方面是提供用于改善疫苗效力的方法，其包括施用如本文詳述的核 酸構(gòu)建體。
[0043] 與本發(fā)明特別相關(guān)的是包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼與至少一種 抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體， 其適合于引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0044] 本發(fā)明的另外一個(gè)方面是提供部分試劑盒（kit in parts),所述試劑盒包括如本 文描述的核酸構(gòu)建體連同施用所述核酸構(gòu)建體的醫(yī)療器械或其他裝置，和/或合適疫苗， 和另外關(guān)于如何使用部分試劑盒的說明書。
[0045] 因此可見本發(fā)明提供了通過給動(dòng)物施用如本文下文詳述的核酸構(gòu)建體用于加強(qiáng) 動(dòng)物中的免疫應(yīng)答的方法。
[0046] 本發(fā)明涉及下列內(nèi)容： "權(quán)利要求1. 一種核酸構(gòu)建體，其包括編碼下述的序列： a. 與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體， b. 至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段， 其中所述核酸構(gòu)建體用于癌癥疫苗的引發(fā)，和/或所述恒定鏈或其變體不包括前17個(gè) 氨基酸，和/或所述恒定鏈或其變體不包括KEY區(qū)域的LRMK氨基酸殘基，和/或所述恒定 鏈包括CLIP區(qū)域的變體； 2. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其用作用于刺激免疫應(yīng)答的引發(fā)物，從而增加后續(xù) 施用的疫苗的效力； 3. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是生物特異性的； 4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是人源 的； 5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的至少一個(gè) 區(qū)域、肽或結(jié)構(gòu)域加入、去除或置換所述至少一種恒定鏈的區(qū)域、肽或結(jié)構(gòu)域； 6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域 的LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)由其他氨基酸殘基置換； 7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域 的LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)由丙氨酸置換； 8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域 的LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)是缺失的； 9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的CLIP區(qū)域 在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由其他氨基酸殘基置換； 10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的CLIP區(qū) 域在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由丙氨酸置換； 11. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的前17個(gè) 氨基酸是缺失的（A17Ii); 12. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述恒定鏈包括與來自另一種蛋 白質(zhì)的三聚結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)的氨基酸殘基編號(hào)50 - 118; 13. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈或其片段引 起以⑶4+ T細(xì)胞依賴性和/或不依賴性方式的MHC-I和/或MHC-II依賴性免疫應(yīng)答； 14. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述 蛋白質(zhì)或肽的抗原片段選自：致病性生物、癌癥特異性多肽和與異常生理學(xué)應(yīng)答相關(guān)的蛋 白質(zhì)或肽； 15. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中來自致病性生物的所述至少一種 抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段選自包括下述的病原體：病毒、微生物和寄 生蟲； 16. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述 蛋白質(zhì)或肽的抗原片段來自哺乳動(dòng)物生物，優(yōu)選人病原體； 17. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述 蛋白質(zhì)或肽的抗原片段來自癌癥特異性多肽； 18. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述 蛋白質(zhì)或肽的抗原片段來自選自下述的癌癥特異性多肽：HPV衍生的病毒癌基因 E5、E6、E7 和 LI ;存活素、Bcl-XL、MCL-1 和 Rho-C ; 19. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述 蛋白質(zhì)或肽的抗原片段是與權(quán)利要求14 - 18所述抗原中的任何至少85%等同的抗原肽 或蛋白質(zhì)； 20. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中在所述恒定鏈或其變體和所述抗 原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段之間的操作接頭選自：直接連接或由間隔區(qū)介 導(dǎo)的連接； 21. 根據(jù)權(quán)利要求20的核酸構(gòu)建體，其中所述操作接頭是間隔區(qū)； 22. 根據(jù)權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體，其中所述間隔區(qū)編碼關(guān)于MHC II類分子的至少 一個(gè)輔助表位； 23. 根據(jù)權(quán)利要求21的核酸構(gòu)建體，其中所述間隔區(qū)編碼至少一個(gè)蛋白酶切割位點(diǎn)； 24. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種恒定鏈與至少2種抗原 蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接； 25. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中使得所述構(gòu)建體能夠表達(dá)的啟動(dòng) 子在所述至少一種可操作地連接的恒定鏈或其變體和至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋 白質(zhì)或肽的抗原片段編碼序列前； 26. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述啟動(dòng)子選自組成型啟動(dòng)子、 誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、生物特異性啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子和細(xì)胞類型特異性啟動(dòng)子、CMV啟動(dòng) 子、SV40啟動(dòng)子和RSV啟動(dòng)子； 27. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其包括與抗原呈遞和/或細(xì)胞內(nèi)散布 有關(guān)的基因； 28. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其包括編碼佐劑的基因； 29. -種遞送媒介物，其包括根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體； 30. 根據(jù)權(quán)利要求29的遞送媒介物，其中所述媒介物選自：基于RNA的媒介物、基于 DNA的媒介物/載體、基于脂質(zhì)的媒介物、基于聚合物的媒介物和病毒衍生的DNA或RNA媒 介物； 31. 根據(jù)權(quán)利要求30的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物是聚乙二醇化的載體或媒 介物； 32. 根據(jù)權(quán)利要求30的遞送媒介物，其中所述基于脂質(zhì)的媒介物是脂質(zhì)體； 33. 根據(jù)權(quán)利要求30的遞送媒介物，其中所述基于聚合物的媒介物由選自下述的陽 離子聚合物DNA載體形成：聚乙烯亞胺（PEI)、聚乙二胺和聚丙胺樹狀聚體、聚烯丙胺、陽離 子右旋糖酐、殼聚糖、陽離子蛋白質(zhì)(聚賴氨酸、魚精蛋白和組蛋白）、陽離子肽、多肽、脂多 糖和多糖； 34. 根據(jù)權(quán)利要求33的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物是生物可降解聚合物微球 體； 35. 根據(jù)權(quán)利要求30的遞送媒介物，其中所述遞送媒介物包括將所述核酸構(gòu)建體包 被到膠體金顆粒上； 36. -種用于施用根據(jù)權(quán)利要求29 - 35中任一項(xiàng)的遞送媒介物的方法，其中所述施 用選自針注射、基因槍、射流注射、電穿孔、超聲和水動(dòng)力遞送； 37. -種用于施用根據(jù)權(quán)利要求29 - 35中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體的方法，其中所述施 用選自針注射、基因槍、射流注射、電穿孔、超聲和水動(dòng)力遞送； 38. -種細(xì)胞，其包括如權(quán)利要求1 - 28中任一項(xiàng)中定義的核酸構(gòu)建體； 39. -種嵌合蛋白質(zhì)，其包括至少一種可操作地連接的恒定鏈或其變體和至少一種抗 原蛋白質(zhì)或肽，編碼其的序列如通過權(quán)利要求1 - 28中任一項(xiàng)中的核酸構(gòu)建體中的任何 定義的； 40. -種抗體，其可以識(shí)別如權(quán)利要求39中定義的嵌合蛋白質(zhì)； 41. 根據(jù)權(quán)利要求40的抗體在用于檢測(cè)所述抗體與之結(jié)合的蛋白質(zhì)的測(cè)定中的用 途； 42. -種組合物，其包括編碼下述的核酸序列： a. 與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體， b. 至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段； 43. -種用作藥物的組合物，其包括編碼下述的核酸序列： a. 與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體， b. 至少一種多肽； 44. 根據(jù)權(quán)利要求42和43中任一項(xiàng)的組合物，其包括如權(quán)利要求1 - 28中任一項(xiàng) 中定義的核酸構(gòu)建體； 45. 根據(jù)權(quán)利要求42 - 44中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包括至少2種載體； 46. -種組合物，其包括根據(jù)權(quán)利要求39的至少一種嵌合蛋白質(zhì)，如通過權(quán)利要求1 -28中任一項(xiàng)中的核酸構(gòu)建體中的任何定義的； 47. 根據(jù)權(quán)利要求42 - 46中任一項(xiàng)的組合物，其中所述組合物包括佐劑； 48. -種部分試劑盒，其包括： a. 包括根據(jù)權(quán)利要求1 - 28中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體的組合物， b. 用于施用所述組合物的醫(yī)療器械或其他裝置， c. 關(guān)于如何使用所述部分試劑盒的說明書； 49. 根據(jù)權(quán)利要求48的部分試劑盒，其中所述試劑盒包括第二種活性成分； 50. 根據(jù)權(quán)利要求49的部分試劑盒，其中所述第二種活性成分是合適疫苗； 51. -種用于增加疫苗效力的方法，其包括步驟： a. 提供根據(jù)權(quán)利要求1 - 28中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體、或根據(jù)權(quán)利要求42 - 47中 任一項(xiàng)的組合物， b. 通過施用步驟a)的核酸構(gòu)建體或組合物引發(fā)受試者的免疫系統(tǒng)，從而刺激所述受 試者中的免疫應(yīng)答，和 c. 通過施用合適疫苗加強(qiáng)步驟b)的免疫應(yīng)答； 52. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中用于引發(fā)免疫應(yīng)答的所述核酸構(gòu)建體的至少一部 分和用于加強(qiáng)所述免疫應(yīng)答的所述疫苗是等同的； 53. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述等同部分是所述抗原肽或蛋白質(zhì)的部分； 54. 根據(jù)權(quán)利要求52的方法，其中所述等同部分是遍在輔助T細(xì)胞表位； 55. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是MHC-I依賴性的； 56. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是MHC-II依賴性的； 57. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是MHC-I和MHC-II依賴性的； 58. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是T細(xì)胞依賴性的； 59. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是CD4+ T細(xì)胞依賴性的； 60. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是CD4+ T細(xì)胞不依賴性的； 61. 根據(jù)權(quán)利要求51的方法，其中所述免疫應(yīng)答是CD8+ T細(xì)胞依賴性的； 62. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 61中任一項(xiàng)的方法，其包括步驟： a. 提供根據(jù)權(quán)利要求42 - 47中任一項(xiàng)的至少一種組合物， b. 給受試者施用所述至少一種組合物至少一次用于動(dòng)物的治療或預(yù)防； 63. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 62中任一項(xiàng)的方法，其中所述組合物施用于最可能是給定感 染的接受器的區(qū)域； 64. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 63中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是人； 65. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 63中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是哺乳動(dòng)物； 66. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 63中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是雪貂； 67. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 63中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是魚； 68. 根據(jù)權(quán)利要求51 - 63中任一項(xiàng)的方法，其中所述受試者是鳥。"。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0047] 圖1 :用基于Ii鏈的裸露DNA疫苗的DNA引發(fā)。
[0048] 圖2 :在Ii序列中結(jié)構(gòu)域和測(cè)試的突變的定位。
[0049] 圖3 :Ii顯著增加 SIINFEKL/H-2kb OVA衍生表位的細(xì)胞表面呈遞。
[0050] 圖4 :Ii僅以順式工作。
[0051] 圖5 :N末端缺失和置換不影響Ii刺激能力。
[0052] 圖6 :C末端缺失和置換不影響Ii刺激能力。
[0053] 圖7 :僅N和C末端缺失降低Ii刺激能力。
[0054] 圖8 =Ad-IiGP和Ad-GP疫苗的劑量應(yīng)答。
[0055] 圖 9 :Ad-GP、Ad-IiGP 和 Ad-IiCLIPGP 作用于 MHC II 類呈遞的比較。
[0056] 圖 10 :Ad-GP、Ad-IiGP、Ad-GPLamp-l 和 Ad-Ii Λ 17GP 在體內(nèi)時(shí)間過程研究中的比 較。
[0057] 圖 11 :Ad-GP、Ad-IiGP、Ad-Ii Λ 17GP、Ad-IiKEYGP、Ad-IiCLIPGP、Ad-Iil-117GP 和 Ad-Iil-199GP在體內(nèi)應(yīng)答中的比較。
[0058] 圖12 =Ad-GP能夠引發(fā)后續(xù)Ad-IiGP加強(qiáng)。
[0059] 圖13 =Ad-IiGP不能引發(fā)后續(xù)Ad-GP或Ad-IiGP加強(qiáng)。
[0060] 圖14 :Ad-GP和AdIi-Gp疫苗的劑量應(yīng)答。
[0061] 圖15 :與包括殘基50 - 215的恒定鏈變體（Ii50-215)偶聯(lián)的甘露糖受體，與腺病 毒纖維蛋白質(zhì)進(jìn)一步偶聯(lián)。
[0062] 定義 腺病毒：一組包含雙鏈DNA的病毒。腺病毒可以進(jìn)行遺傳修飾，使得其不能復(fù)制或條件 性不能復(fù)制。以這種形式，作為腺病毒構(gòu)建體或腺病毒載體，它們可以用作基因遞送媒介物 用于疫苗接種或基因療法。
[0063] 腺病毒纖維蛋白質(zhì)：來自腺病毒的任何血清型的纖維蛋白質(zhì)。它還稱為腺病毒纖 維結(jié)或具有異源結(jié)插入片段的腺病毒纖維結(jié)。
[0064] 佐劑：其與施用的免疫原決定簇/抗原/核酸構(gòu)建體的混合物增加或以其他方式 修飾對(duì)于所述決定簇的免疫應(yīng)答的任何物質(zhì)。
[0065] 氨基酸：任何合成或天然存在的氨基羧酸，包括在肽和多肽包括在體內(nèi)合成的蛋 白質(zhì)和酶中存在的任何氨基酸，從而包括氨基酸的修飾。術(shù)語氨基酸在本文中與術(shù)語"氨基 酸殘基"同義使用，其意欲包含如所述已與至少一個(gè)其他種類例如2、例如3、例如超過3個(gè) 其他種類反應(yīng)的氨基酸。通用詞氨基酸包括天然和非天然氨基酸，其中任何可以以"D"或 "L"異構(gòu)形式存在。氨基酸可以縮寫為'aa'。
[0066] 抗體：免疫球蛋白分子和免疫球蛋白分子的活性部分?？贵w是例如完整免疫球蛋 白分子或其保留免疫學(xué)活性的片段。
[0067] 抗原：可以與克隆分布的免疫受體（T細(xì)胞或B細(xì)胞受體）結(jié)合的任何物質(zhì)。通常 是肽、多肽或多聚體多肽?？乖瓋?yōu)選能夠引發(fā)免疫應(yīng)答。
[0068] 加強(qiáng)：通過加強(qiáng)物注射（shot)或劑量來加強(qiáng)是給予免疫試劑例如疫苗的一次或 多次另外劑量，在用于引發(fā)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)的初始劑量后一段時(shí)間給予，以維持或增強(qiáng)通 過相同（同源）或另一種(異源）免疫試劑的先前劑量引發(fā)的免疫應(yīng)答。
[0069] 載體：抗原與之偶聯(lián)以幫助誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的實(shí)體或化合物。
[0070] 嵌合蛋白質(zhì)：由核苷酸序列編碼的遺傳改造蛋白質(zhì)，所述核苷酸序列通過將2種 或更多種完整或部分基因或一系列(非）隨機(jī)核酸剪接在一起制備。
[0071] 補(bǔ)體：其作用于"補(bǔ)充"抗體工作的復(fù)雜系列的血液蛋白質(zhì)。補(bǔ)體破壞細(xì)菌，產(chǎn)生 炎癥，且調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)。
[0072] 細(xì)胞因子：生長(zhǎng)或分化調(diào)節(jié)劑，在本文中非限定使用，并且不應(yīng)限制本發(fā)明和權(quán)利 要求的解釋。除細(xì)胞因子外，粘附或輔助分子或其任何組合可以單獨(dú)或與細(xì)胞因子組合采 用。
[0073] CTL :細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞。表達(dá)⑶8連同T細(xì)胞受體，且因此能夠響應(yīng)由I類分 子呈遞的抗原的T細(xì)胞亞組。
[0074] 遞送媒介物：由此核苷酸序列或多肽或兩者可以從至少一種介質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)到另一種介 質(zhì)的實(shí)體。
[0075] 片段：用于指出核酸或多肽的非全長(zhǎng)部分。因此，片段自身也分別是核酸或多肽。
[0076] 異源加強(qiáng)或引發(fā)-加強(qiáng)：其中用于加強(qiáng)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)不同于先前用于引發(fā)免疫 應(yīng)答的物質(zhì)。
[0077] 同源加強(qiáng)或引發(fā)-加強(qiáng)：其中用于加強(qiáng)免疫系統(tǒng)的物質(zhì)與先前用于引發(fā)免疫應(yīng)答 的物質(zhì)相同。
[0078] 個(gè)體：鳥、哺乳動(dòng)物、魚、兩棲類或爬行類包括人類的任何物種或亞種。
[0079] 恒定鏈：與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和后續(xù)細(xì)胞區(qū)室中的MHC II分子結(jié)合且穩(wěn)定其的整合膜蛋白 質(zhì)糖蛋白。此處術(shù)語恒定鏈涵蓋所有天然存在或人工生成的與人恒定鏈具有特定相似性的 全長(zhǎng)或片段化的同源基因和蛋白質(zhì)。恒定鏈在本文中縮寫為Ii。
[0080] 分離的：與本文公開的核酸、多肽或抗體結(jié)合使用的'分離的'指已鑒定且從其天 然的、一般的細(xì)胞環(huán)境的組分中分離和/或回收的那些。本發(fā)明的核酸、多肽和抗體優(yōu)選是 分離的，并且本發(fā)明的疫苗和其他組合物優(yōu)選包括分離核酸、多肽或分離抗體。
[0081] MHC :主要組織相容性復(fù)合物，存在MHC的2個(gè)主要亞類，I類和II類。
[0082] 裸露DNA:不與組蛋白結(jié)合的DNA;通常是低甲基化和富含CpG的DNA。裸露DNA 可以是環(huán)狀或線性的，例如環(huán)狀質(zhì)粒。
[0083] 核酸：傳送遺傳信息的核苷酸鏈或序列。就本發(fā)明而言，核酸可以是脫氧核糖核 酸（DNA)或下述中的任何：核糖核酸（RNA)、鎖核酸（LNA)、肽核酸（PNA)、嵌入核酸（INA)、 扭曲嵌入核酸（TINA)、己糖醇核酸（HNA)、阿糖核酸（ANA)、環(huán)己烷核酸（CNA)、環(huán)己烯基 核酸（CeNA)、甘油核酸（GNA)、蘇糖基核酸（TNA)、缺口 -聚體（Gap-mers)、混合-聚體 (Mix-mers)和嗎啉代類物質(zhì)（Morpholinos)。
[0084] 核酸構(gòu)建體：遺傳改造的核酸。一般包括幾種元件例如基因或其片段、啟動(dòng)子、增 強(qiáng)子、終止子、多聚腺苷酸尾、接頭、多聚接頭、操作接頭、多克隆位點(diǎn)（MCS)、標(biāo)記、終止密碼 子、其他調(diào)節(jié)元件、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)或其他。
[0085] 操作接頭：以保證核酸或多肽的生物加工的方式使核酸構(gòu)建體或(嵌合）多肽的2 個(gè)部分結(jié)合在一起的核苷酸或氨基酸殘基序列。
[0086] 病原體：疾病的特異性成因劑，特別是生物劑例如病毒、細(xì)菌、朊病毒或寄生蟲，其 可以引起對(duì)其宿主的疾病，也被稱為傳染劑。
[0087] 肽：限定序列且由酰胺鍵連接的多個(gè)共價(jià)連接的氨基酸殘基。該術(shù)語與寡肽和多 肽類似地使用。天然和/或非天然氨基酸可以通過肽鍵或通過非肽鍵連接。術(shù)語肽還包含 通過化學(xué)或酶催化反應(yīng)引入的翻譯后修飾，如本領(lǐng)域已知的。該術(shù)語可以指多肽變體或片 段。
[0088] 藥物載體：也稱為賦形劑或穩(wěn)定劑，在采用的劑量和濃度下對(duì)暴露于其的細(xì)胞或 個(gè)體是無毒的。通常生理學(xué)上可接受的載體是PH緩沖的水性溶液。生理學(xué)上可接受的載 體的例子包括緩沖液例如磷酸鹽、檸檬酸鹽和其他有機(jī)酸；抗氧化劑包括抗壞血酸；低分 子量(小于約10個(gè)殘基）多肽；蛋白質(zhì)例如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物例 如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸例如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖 和其他碳水化合物包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑例如EDTA ;糖醇例如甘露糖醇或山 梨糖醇；成鹽抗衡離子例如鈉；和/或非離子表面活性劑例如TWEEN?、聚乙二醇（PEG)和 PLURONICS?。
[0089] 多個(gè)：至少2個(gè)。
[0090] 引發(fā)：用例如DNA初始引發(fā)免疫系統(tǒng)，以使免疫應(yīng)答集中于所需免疫原。
[0091] 引發(fā)-加強(qiáng)：用例如DNA初始引發(fā)免疫系統(tǒng)，以使免疫應(yīng)答集中于所需免疫原，并 且用疫苗隨后加強(qiáng)免疫應(yīng)答，導(dǎo)致由所述疫苗誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答中的增加。
[0092] 啟動(dòng)子：RNA聚合酶在其上結(jié)合以起始通過一種或多種附近結(jié)構(gòu)基因的信使RNA 轉(zhuǎn)錄的DNA鏈中的結(jié)合位點(diǎn)。
[0093] 信號(hào)肽：決定蛋白質(zhì)在細(xì)胞中的最終定位的短氨基酸序列，也被稱為分選肽。
[0094] 合適疫苗：用于根據(jù)本發(fā)明使用的任何疫苗，能夠加強(qiáng)通過初始引發(fā)刺激的免疫 應(yīng)答，特征在于用于引發(fā)免疫應(yīng)答的核酸構(gòu)建體和用于加強(qiáng)免疫應(yīng)答的后續(xù)疫苗的至少一 個(gè)部分是等同的。引發(fā)物和加強(qiáng)物的所述至少一個(gè)等同部分可以是Ii或其變體、抗原肽或 抗原肽的部分、或遍在的輔助T細(xì)胞表位。
[0095] 表面活性劑：能夠減少它溶解于其中的液體的表面張力的表面活性試劑。表面活 性劑是包含其為親水的極性基團(tuán)和其為疏水的非極性基團(tuán)，并且通常由脂肪鏈組成的化合 物。
[0096] 疫苗：能夠在動(dòng)物中誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的物質(zhì)或組合物：在該正文中也被稱為免疫原 性組合物。免疫應(yīng)答是在生物中誘導(dǎo)記憶的免疫應(yīng)答(體液/抗體和/或細(xì)胞免疫應(yīng)答)， 導(dǎo)致傳染劑由二次而不是初次應(yīng)答對(duì)抗，從而減少其對(duì)宿主生物的影響。本發(fā)明的疫苗可 以作為預(yù)防和/或治療藥物給予。組合物可以包括下述中的一種或多種：一種或多種抗原、 包括與Ii可操作地連接的一種或多種抗原的核酸構(gòu)建體、載體、佐劑和藥物載體。
[0097] 變體：給定參考核酸或多肽的'變體'指這樣的核酸或多肽，其展示出與所述參考 核酸或多肽的一定序列同源性/同一性程度，但不等同于所述參考核酸或多肽。
[0098] 結(jié)構(gòu)域、區(qū)域和基序在本文中可以互換使用。
[0099]

【具體實(shí)施方式】 本發(fā)明涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽 編碼序列可操作地連接的恒定鏈或其變體。核酸構(gòu)建體用于引發(fā)免疫應(yīng)答，以加強(qiáng)后續(xù)加 強(qiáng)疫苗接種的效應(yīng)。
[0100] 免疫應(yīng)答 疫苗可以在預(yù)防上使用：它們?cè)趯?shí)際感染發(fā)生前給予；或在治療上使用：其中它們引 發(fā)或加速對(duì)已在體內(nèi)的病原體的免疫應(yīng)答。2種疫苗接種方法要求實(shí)體免疫應(yīng)答的建立。 通過感染或疫苗接種激活的免疫應(yīng)答依賴于幾種細(xì)胞類型例如T、B和抗原呈遞細(xì)胞，以及 幾種不同分子主要是抗原、MHC分子、T和B細(xì)胞受體及許多其他的相互作用。
[0101] 抗原是在抗原呈遞細(xì)胞的表面上由MHC分子呈遞的肽片段?？乖梢允峭庠?的，即致病性來源，或源于生物自身，所謂的自體或自身抗原。MHC分子是由特異性染色體 區(qū)域編碼的多態(tài)基因家族的代表，所述特異性染色體區(qū)域稱為"主要組織相容性復(fù)合物" ("major histocompatibility complex")，因此為MHC。存在2類MHC分子，MHC I類（MHC-I) 和 MHC II 類（MHC-II)。
[0102] T輔助細(xì)胞通過由MHC II類（MHC-II)分子呈遞的抗原刺激，所述MHC-II分子位于 抗原呈遞細(xì)胞的表面上。MHC-II分子在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中合成。在合成過程中，它們以阻止MHC-II 分子負(fù)載有自體或自身抗原的方式與恒定鏈（Ii)組合。MHC-II分子通過恒定鏈中的信號(hào) 序列轉(zhuǎn)運(yùn)至在特異性細(xì)胞區(qū)室中的細(xì)胞表面。隨著區(qū)室通過加工其內(nèi)含物而成熟，它從溶 酶體發(fā)展到晚期內(nèi)體(在與內(nèi)吞囊泡融合后）到MHC II類區(qū)室（MIIC)。內(nèi)吞囊泡包含外源 抗原，即蛋白酶解切割的細(xì)菌肽片段。這些片段通過其降解制備，以負(fù)載到MHC-II分子上。 MHC-II分子通過恒定鏈在2部分過程中釋放，這時(shí)恒定鏈?zhǔn)紫韧ㄟ^蛋白酶解被降解，僅留 下在MHC-II結(jié)合結(jié)構(gòu)域中稱為CLIP的肽，其次通過HLA-DM分子去除CLIP。MHC-II分子 隨后游離，以結(jié)合外源抗原，且在MIIC囊泡與質(zhì)膜融合后，將其呈遞在細(xì)胞表面上。這起始 體液免疫應(yīng)答，因?yàn)槌蔬f的抗原刺激T輔助細(xì)胞的激活，這依次通過幾種方式激活B細(xì)胞， 這最終分化成抗體分泌細(xì)胞。
[0103] 當(dāng)T細(xì)胞毒性細(xì)胞的T細(xì)胞受體識(shí)別與在抗原呈遞細(xì)胞上的MHC I類分子結(jié)合的 抗原時(shí)，細(xì)胞免疫應(yīng)答起始。MHC-I分子不與功能性類似與MHC-II結(jié)合的恒定鏈的分子結(jié) 合。MHC-I加工成的抗原呈遞分子另外不同于MHC-II分子的那種，因?yàn)镸HC-I分子已在內(nèi) 質(zhì)網(wǎng)中負(fù)載有抗原。由MHC-I分子呈遞的抗原一般是通過蛋白質(zhì)的蛋白酶體切割的肽片 段，所述蛋白質(zhì)已通過抗原呈遞細(xì)胞自身合成。這些蛋白質(zhì)可以是在細(xì)胞自身DNA中編碼 的異常蛋白質(zhì)或衍生自病毒或其他病原體的蛋白質(zhì)，所述病毒或其他病原體已感染細(xì)胞且 寄生其蛋白質(zhì)合成機(jī)制。MHC I類相關(guān)蛋白酶解系統(tǒng)存在于基本上所有細(xì)胞中。
[0104] 2類T細(xì)胞的功能是顯著不同的，如由其名稱所示的。細(xì)胞毒性T細(xì)胞通過細(xì)胞的 直接裂解和通過分泌細(xì)胞因子例如Y-干擾素來消滅細(xì)胞內(nèi)病原體和腫瘤。占優(yōu)勢(shì)的細(xì)胞 毒性T細(xì)胞是CD8 + T細(xì)胞，這也是抗原特異性的。輔助T細(xì)胞也是裂解細(xì)胞，但其主要功 能是分泌促進(jìn)B細(xì)胞(抗體生產(chǎn)細(xì)胞）和其他T細(xì)胞的活性的細(xì)胞因子，并且因此它們廣泛 增強(qiáng)對(duì)于外源抗原的免疫應(yīng)答，包括抗體介導(dǎo)的和細(xì)胞毒性T細(xì)胞介導(dǎo)的應(yīng)答機(jī)制。CD4+ T細(xì)胞是免疫應(yīng)答中的主要輔助T細(xì)胞表型。
[0105] 核酸構(gòu)律體 本發(fā)明的一個(gè)方面涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體例如裸露DNA構(gòu)建體，所述序列 編碼與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段簡(jiǎn)言之抗原可操作地連接 的至少一種恒定鏈或其變體。
[0106] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼與 至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定鏈 或其變體，其中所述恒定鏈或其變體不包括KEY區(qū)域的LRMK氨基酸殘基。
[0107] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼 與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定 鏈或其變體，其中所述恒定鏈或其變體包括CLIP區(qū)域的變體。
[0108] 在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編碼 與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒定 鏈或其變體，其中所述恒定鏈或其變體不包括前17個(gè)氨基酸。
[0109] 在另外一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括這樣的序列的核酸構(gòu)建體，所述序列編 碼與至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段可操作地連接的至少一種恒 定鏈或其變體，其中所述核酸構(gòu)建體用于癌癥疫苗的引發(fā)。
[0110] 核酸構(gòu)建體應(yīng)理解為遺傳改造的核酸。核酸構(gòu)建體可以是非復(fù)制的且線性的核 酸、環(huán)狀表達(dá)載體或自主復(fù)制質(zhì)粒。核酸構(gòu)建體可以包括幾種元件，例如但不限于基因或 其片段、啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、終止子、多聚腺苷酸尾、接頭、多聚接頭、操作接頭、多克隆位點(diǎn) (MCS)、標(biāo)記、終止密碼子、內(nèi)部核糖體進(jìn)入位點(diǎn)（IRES)和用于整合的宿主同源序列或其他 限定元件。應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以包括上述元件的任何組合的所有或亞 組。
[0111] 用于改造核酸構(gòu)建體的方法是本領(lǐng)域眾所周知的(參見例如，Molecular Cloning :A Laboratory Manual, Sambrook 等人，編輯，Cold Spring Harbor Laboratory, 第2版，Cold Spring Harbor, N. Y.，1989)。進(jìn)一步地，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以無需 模板而合成，并且可以得自各種商業(yè)供應(yīng)者(例如Genscript Corporation)。
[0112] 在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸構(gòu)建體包括的核酸殘基可以被修飾。所述修飾可以選自： 乙?；?、甲基化、磷酸化、遍在蛋白化、核糖基化、硫化及其他。
[0113] 在一個(gè)實(shí)施方案中，根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體可以由DNA組成。在另一個(gè)實(shí)施方 案中，核酸構(gòu)建體可以由選自下述的核酸組成：脫氧核糖核酸（DNA)、核糖核酸（RNA)、鎖核 酸（LNA)、肽核酸（PNA)、嵌入核酸（INA)、扭曲嵌入核酸（TINA)、己糖醇核酸（HNA)、阿糖核 酸（ANA)、環(huán)己烷核酸（CNA)、環(huán)己烯基核酸（CeNA)、甘油核酸（GNA)、蘇糖基核酸（TNA)、缺 口 -聚體、混合-聚體、嗎啉代類物質(zhì)或其組合。
[0114] 如上所述，MHC II分子在加工過程中與恒定鏈結(jié)合，直至結(jié)合的恒定鏈降解，以允 許外源抗原肽負(fù)載到MHC II分子上。當(dāng)應(yīng)用包括度定鏈·-茲矣-表位的'外部'蛋白質(zhì) 構(gòu)建體時(shí)，其中恒定鏈包括KEY區(qū)域(包括LRMK氨基酸殘基)，所述蛋白質(zhì)構(gòu)建體在所述MHC II分子定位于細(xì)胞的細(xì)胞外表面上時(shí)將與MHC II分子(包含抗原）相互作用。因此，效應(yīng) 是外部的，并且依賴于蛋白質(zhì)構(gòu)建體(包括LRMK氨基酸殘基）的恒定鏈KEY-殘基競(jìng)爭(zhēng)負(fù)載 到MHC II分子上的能力。換言之，在細(xì)胞內(nèi)加工過程中已負(fù)載到MHCII分子上的抗原必須 被"倒出"（"tipped off"）或從細(xì)胞表面上的MHCII分子中去除，并且由包括/互定鏈·-茲 義-表位的蛋白質(zhì)構(gòu)建體代替。這給出無法擴(kuò)增的"1:1"-效應(yīng)，并且它不變地依賴于來 自恒定鏈的LRMK氨基酸殘基的存在。
[0115] 根據(jù)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體涉及應(yīng)用編碼恒定鏈或其變體且還編碼抗原肽或表位 的'內(nèi)部'核酸構(gòu)建體，即核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)染到受試者中細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)間隙內(nèi)。所述核酸構(gòu)建 體將使用細(xì)胞翻譯機(jī)制，以產(chǎn)生度定鏈-茲矣-表位或度定鏈' -表位產(chǎn)物，在所述MHC分 子定位在細(xì)胞內(nèi)例如在胞內(nèi)體或MIIC中時(shí)，這將與MHCII分子或MHCI分子(不包含抗原） 相互作用。因此，效應(yīng)是內(nèi)部的，并且不·依賴于蛋白質(zhì)構(gòu)建體(包括LRMK氨基酸殘基）的恒 定鏈KEY-結(jié)構(gòu)域競(jìng)爭(zhēng)負(fù)載到MHC分子上的能力。事實(shí)上，該效應(yīng)不依賴于Ii-KEY區(qū)域及 其LRMK殘基的存在。此外，這給出可以擴(kuò)增的效應(yīng)，因?yàn)橐粋€(gè)核酸構(gòu)建體可以產(chǎn)生超過一 種產(chǎn)物。
[0116] 核酸構(gòu)建體的'內(nèi)部'使用具有優(yōu)于蛋白質(zhì)構(gòu)建體的'外部'使用的幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)，如 上詳述：1)擴(kuò)增；小量核酸構(gòu)建體的引入產(chǎn)生可以都與MHC分子結(jié)合的許多產(chǎn)物，這還可以 是二次擴(kuò)增的，因?yàn)榕cMHC結(jié)合的所述產(chǎn)物可以通過內(nèi)在化進(jìn)一步再循環(huán)，以最終增加其 展示，2)細(xì)胞自身抗原加工系統(tǒng)的使用確保表位與MHC分子的正確和緊密結(jié)合，3)不需要 Ii-KEY區(qū)域的LRMK殘基和天然Ii-CLIP結(jié)構(gòu)域。
[0117] 密碼子最伴化和簡(jiǎn)并核酸序列 功能蛋白質(zhì)在異源宿主中的表達(dá)是現(xiàn)代生物技術(shù)的基石。不幸的是，許多蛋白質(zhì)難以 在其原始背景外表達(dá)。它們可以包含表達(dá)限制性調(diào)節(jié)元件，來自使用非經(jīng)典核苷酸編碼的 生物，或來自具有在所需宿主中很少使用的密碼子的普遍基因 （gene rife)?；蚝铣伤俣?和效率中的改善已致使可行的完整基因重新設(shè)計(jì)用于最大限度的蛋白質(zhì)表達(dá)。例如，當(dāng)在 研究下的基因的密碼子頻率與宿主表達(dá)系統(tǒng)的密碼子頻率匹配時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)可以顯著改 善。例如，重新設(shè)計(jì)策略可以不僅包括最佳密碼子偏好的使用，還包括mRNA結(jié)構(gòu)元件的改 變以及翻譯和起始區(qū)的修飾。用于密碼子最佳化的技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的，并且可 以通過商業(yè)供應(yīng)者例如GenScript Corporation執(zhí)行。
[0118] 應(yīng)當(dāng)理解根據(jù)本發(fā)明包括恒定鏈或其變體的核酸構(gòu)建體可以以任何方式進(jìn)行密 碼子最優(yōu)化，以便通過翻譯成蛋白質(zhì)即氨基酸產(chǎn)生包括根據(jù)本發(fā)明的恒定鏈或其變體的氨 基酸序列，所述恒定鏈對(duì)應(yīng)于SEQ ID NO :2 (人Ii)中公開的氨基酸序列。
[0119] 同樣地，根據(jù)本發(fā)明包括恒定鏈的核酸構(gòu)建體可以以任何方式進(jìn)行密碼子最優(yōu) 化，以便通過翻譯成蛋白質(zhì)即氨基酸產(chǎn)生包括根據(jù)本發(fā)明的恒定鏈或其變體的氨基酸序 列，所述恒定鏈對(duì)應(yīng)于其中核酸構(gòu)建體可以用于引發(fā)免疫應(yīng)答的任何動(dòng)物的氨基酸序列； 包括任何脊椎動(dòng)物、哺乳動(dòng)物、魚或鳥。
[0120] 齋媽子湯//:密碼子偏好已鑒定為在原核生物基因表達(dá)中的單個(gè)最重要因子。給 定密碼子在遺傳密碼中出現(xiàn)的程度在生物之間、在以高和低水平表達(dá)的蛋白質(zhì)之間和甚至 在相同操縱子的不同部分之間顯著不同。關(guān)于這點(diǎn)的原因幾乎是必然的，因?yàn)閮?yōu)選密碼子 與細(xì)胞內(nèi)可用的同族tRNA豐度相關(guān)。這個(gè)關(guān)系用于最優(yōu)化翻譯系統(tǒng)且平衡密碼子濃度與 同工 tRNA (isoacceptor tRNA)濃度。
[0121] 麵泥少使勒效密媽f :一般而言，基因包含的罕見密碼子越多，異源蛋白質(zhì)將在 那種特定宿主系統(tǒng)內(nèi)以合理水平表達(dá)的可能性越小。如果罕見密碼子成簇或在蛋白質(zhì)的N 末端部分中出現(xiàn)，那么這些水平變得甚至更低。用更緊密地反映宿主系統(tǒng)的密碼子偏好而 不改變氨基酸序列的其他密碼子替換罕見密碼子可以增加功能蛋白質(zhì)表達(dá)水平。
[0122] 游腐/?覆密游子：生物使用小于5% - 10%時(shí)機(jī)的任何密碼子都可能引起問題， 不管它來自何處。再次，緊密或相鄰密碼子對(duì)蛋白質(zhì)表達(dá)比它們分開可以具有更大的影響。 消除罕見密碼子和可以作為終止信號(hào)閱讀的密碼子可以阻止低表達(dá)或不存在表達(dá)的情況。
[0123] 在凝冥動(dòng)舞癥主中表送嫁毒蛋沒履：如果基因正確制備，甚至病毒基因也可以在 哺乳動(dòng)物細(xì)胞系中成功表達(dá)。病毒基因的密集信息負(fù)荷頻繁導(dǎo)致重疊的讀碼框。許多病毒 基因還在編碼序列內(nèi)編碼順式作用的負(fù)調(diào)節(jié)序列。病毒基因可以重新合成，不僅只表達(dá)所 需蛋白質(zhì)，還破壞調(diào)節(jié)元件，從而增強(qiáng)蛋白質(zhì)產(chǎn)生。病毒密碼子最優(yōu)化在DNA疫苗研究中是 特別有用的，因?yàn)樗黾影械拿庖咴浴?br> [0124] 算逾履歡:盡管密碼子偏好在基因表達(dá)中發(fā)揮很大作用，但表達(dá)載體和轉(zhuǎn)錄啟動(dòng) 子的選擇也是重要的。在蛋白質(zhì)N末端區(qū)域周圍的核苷酸序列對(duì)于罕見密碼子的存在和緊 鄰起始AUG的密碼子的特性是特別敏感的。在翻譯和mRNA穩(wěn)定性之間還存在一定相互影 響。 放Yl免遺傳密碼的簡(jiǎn)并性 根據(jù)上文可見遺傳密碼具有冗余性但不具有多義性（ambiguity)。例如，盡管密碼子 GAA和GAG都指定谷氨酸(冗余性)，但其中無一指定任何其他氨基酸(無多義性）（關(guān)于完全 關(guān)聯(lián)參見下文密碼子表)。編碼一種氨基酸的密碼子可以在其3個(gè)位置中的任何中不同。遺 傳密碼的簡(jiǎn)并性是解釋沉默突變的存在的原因。因?yàn)?種堿基的三聯(lián)體密碼指定20種氨 基酸和終止密碼子，所以產(chǎn)生簡(jiǎn)并性。

【權(quán)利要求】
1. 一種核酸構(gòu)建體，其包括編碼下述的序列： a. 與b可操作地連接的至少一種恒定鏈或其變體， b. 至少一種抗原蛋白質(zhì)或肽或所述蛋白質(zhì)或肽的抗原片段， 其中所述核酸構(gòu)建體用于癌癥疫苗的引發(fā)，和/或所述恒定鏈或其變體不包括前17個(gè) 氨基酸，和/或所述恒定鏈或其變體不包括KEY區(qū)域的LRMK氨基酸殘基，和/或所述恒定 鏈包括CLIP區(qū)域的變體。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其用作用于刺激免疫應(yīng)答的引發(fā)物，從而增加后續(xù) 施用的疫苗的效力。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1的核酸構(gòu)建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是生物特異性的。
4. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中至少一種恒定鏈或其變體是人源 的。
5. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的至少一個(gè)區(qū) 域、肽或結(jié)構(gòu)域加入、去除或置換所述至少一種恒定鏈的區(qū)域、肽或結(jié)構(gòu)域。
6. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域的 LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)由其他氨基酸殘基置換。
7. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域的 LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)由丙氨酸置換。
8. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的KEY區(qū)域的 LRMK氨基酸殘基中的1、2、3或4個(gè)是缺失的。
9. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的CLIP區(qū)域 在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由其他氨基酸殘基置換。
10. 根據(jù)前述權(quán)利要求中任一項(xiàng)的核酸構(gòu)建體，其中所述至少一種恒定鏈的CLIP區(qū)域 在位置91和99上的甲硫氨酸氨基酸殘基由丙氨酸置換。
【文檔編號(hào)】C12N15/63GK104404068SQ201410485599
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2009年11月20日 優(yōu)先權(quán)日:2008年11月21日
【發(fā)明者】P.J.霍爾斯特, A.R.湯姆森, J.P.克里斯滕森, M.格魯吉克 申請(qǐng)人:哥本哈根大學(xué)