一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子及應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子及應(yīng)用，所述的標(biāo)記分子為Chrna9和Espnl；本發(fā)明篩選出小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性的細(xì)胞標(biāo)記分子可以區(qū)分小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞與其他組織來(lái)源的細(xì)胞，也可為其他物種內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性標(biāo)記分子研究提供參考。
【專(zhuān)利說(shuō)明】-種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子及應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞鑒定，特別涉及一種組合式細(xì)胞標(biāo)記分子鑒定小 鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的新型方法，這種方法能特異性地鑒定分離和培養(yǎng)的小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動(dòng)物內(nèi)耳的前庭和耳蝸中存在內(nèi)耳干細(xì)胞，內(nèi)耳干細(xì)胞具有自我更新和多分 化多潛能性，體外無(wú)血清貼壁培養(yǎng)可以形成內(nèi)耳祖細(xì)胞。將內(nèi)耳祖細(xì)胞與滅活的雞胚橢圓 囊間質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)，部分祖細(xì)胞可以分化成具有功能的成熟毛細(xì)胞，具有典型的毛細(xì)胞形 態(tài)。
[0003] 近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)耳干細(xì)胞具有多分化潛能，在特定的分化條件下可以發(fā)育成 內(nèi)耳毛細(xì)胞。首先，將內(nèi)耳干細(xì)胞接種在經(jīng)多聚賴(lài)氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，無(wú)血清貼壁 培養(yǎng)7天。RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)表明分化之后的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)耳發(fā)育相關(guān)基因和蛋白，形 成內(nèi)耳祖細(xì)胞。然后將內(nèi)耳祖細(xì)胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上。7天后，RT-PCR 和免疫熒光檢測(cè)表明誘導(dǎo)分化后有部分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞的特異性基因和蛋白。誘導(dǎo)產(chǎn)生的 毛細(xì)胞可以吸收特異性分子染料FM1-43,全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有功能。內(nèi)耳毛細(xì)胞 是機(jī)械刺激的受體，可以將聲音刺激轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。功能敏感性毛細(xì)胞的丟失是導(dǎo)致感音 性耳聾的主要原因。因此，毛細(xì)胞在治療感音性耳聾方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 具有大量的純度較高的細(xì)胞是分子和細(xì)胞生物學(xué)研究的基礎(chǔ)。內(nèi)耳毛細(xì)胞在內(nèi)耳 中數(shù)目較少；體外培養(yǎng)條件復(fù)雜；缺少特異性的表面蛋白，導(dǎo)致分離高純度的毛細(xì)胞難度 很大。因此，到目前為止，對(duì)毛細(xì)胞進(jìn)行的相關(guān)研究還非常少。雖然目前有研究發(fā)現(xiàn)了一些 不同物種內(nèi)耳毛細(xì)胞表達(dá)的基因，但這些基因尚缺乏較強(qiáng)的組織特異性，例如成鼠分離的 內(nèi)耳毛細(xì)胞表達(dá)的Myosin VIIA，Espin以及Brn3c，在其他的組織中也有不同程度的表達(dá)。 因此，到目前為止尚缺乏針對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性的細(xì)胞標(biāo)記分子，這對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞的分離 和純化以及鑒定造成了一定的困難，也是內(nèi)耳毛細(xì)胞應(yīng)用研究方面存在的一個(gè)技術(shù)瓶頸。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種鑒定小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子，并采用這種細(xì)胞標(biāo)記分 子特異性地鑒定小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的方法。本發(fā)明是通過(guò)分離得到小鼠內(nèi)耳耳蝸基底膜上的 干細(xì)胞，在體外進(jìn)行無(wú)血清懸浮培養(yǎng)獲得克隆的小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞。將內(nèi)耳干細(xì)胞無(wú)血清貼 壁培養(yǎng)7天，誘導(dǎo)分化形成內(nèi)耳祖細(xì)胞。再將內(nèi)耳祖細(xì)胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì) 胞上共培養(yǎng)，7天后約有30-40%的內(nèi)耳祖細(xì)胞分化成毛細(xì)胞。用小分子染料FM1-43特異 性標(biāo)志毛細(xì)胞，再通過(guò)流式細(xì)胞儀進(jìn)行分選，得到純度較高的毛細(xì)胞。提取小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞 的核糖核酸（RNA)進(jìn)行小鼠基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞基因表達(dá)譜，然后篩選特 異性候選基因。最后從新生小鼠中提取出如大腦、肝臟、皮膚等10個(gè)不同組織的RNA，通過(guò) RT-PCR對(duì)候選的目的基因進(jìn)行特異性檢測(cè)，確定小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的特異性組合式細(xì)胞標(biāo)記 分子。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子，所述的標(biāo)記分子為Chrna9(核 苷酸序列為序列5所示）和Espnl (核苷酸序列為序列6所示）。
[0008] 本發(fā)明還提供一種所述的檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子在檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì) 胞中的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細(xì)胞，提取單細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,以cDNA為模板,分別以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl 反向引物作為兩對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物 355bp，Espnl正向引物和Espnl反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物759bp，則單細(xì)胞為小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞；
[0009] Chrna9 正向引物：5' -AGCTGCGTCTCCAGTCATTC-3' ；
[0010] Chrna9 反向引物：5 ' -TGCTGTCTCTACGGCTTTGA-3 ;
[0011] Espnl 正向引物：5' -GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3' ；
[0012] Espnl 反向引物：5' -GGCATGTGGGCATTTCATCA-3'。
[0013] 本發(fā)明所述檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子按如下步驟篩選：
[0014] (1)內(nèi)耳干細(xì)胞分離和成球培養(yǎng)
[0015] 解剖小鼠獲得小鼠耳蝸基底膜后，將基底膜胰酶消化，用移液槍吹打散后，獲得單 細(xì)胞，然后將單細(xì)胞懸浮在內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2孵育箱中懸浮培養(yǎng)5-6 天，形成內(nèi)耳干細(xì)胞球。
[0016] 本發(fā)明分離培養(yǎng)的小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin、Abcg2、Pax-2、BMP-4及 BMP-7等基因。
[0017] ⑵內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞
[0018] 用0. lmg/ml的多聚賴(lài)氨酸室溫孵育培養(yǎng)皿5分鐘,完全吸除多聚賴(lài)氨酸。用PBS 徹底清洗培養(yǎng)皿3次，每次5分鐘。將培養(yǎng)皿放入37°C孵育箱中過(guò)夜干燥。將P3代內(nèi)耳 干細(xì)胞接種在經(jīng)多聚賴(lài)氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，用內(nèi)耳祖細(xì)胞培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)7天之 后，形成內(nèi)耳祖細(xì)胞。
[0019] 本發(fā)明分離培養(yǎng)的小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Pax-2、BMP_4及BMP-7等基因。
[0020] (3)內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞
[0021] 將P3代雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞接種在用明膠處理好的培養(yǎng)皿上。待基質(zhì)細(xì)胞增長(zhǎng) 到整個(gè)玻片的90%的時(shí)候，用絲裂霉素（Sigmadyg/mL)孵育箱中處理3小時(shí)。完全吸 出絲裂霉素，用PBS漂洗處理后的細(xì)胞3次，然后作為飼養(yǎng)層細(xì)胞用于內(nèi)耳干細(xì)胞的分化。 將內(nèi)耳祖細(xì)胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，用內(nèi)耳毛細(xì)胞培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化7天之 后，部分內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞。
[0022] 小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Mathl、Myosin VIIA、Espin及Brn3c等基因。
[0023] (4)內(nèi)耳毛細(xì)胞的流式分選
[0024] 用DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋FM1-43 (5 μ M，Sigma)染料，將誘導(dǎo)分化之后的樣品放入 染料中染色10秒鐘?？焖俚奈鯢M1-43,加入PBS快速清洗三遍，每遍5分鐘。使用成分 為50% Accutase(Invitrogen公司）+50%胰酶（0· 05% )的混合消化液對(duì)樣品進(jìn)行消化。 消化完成之后加入等體積的大豆來(lái)源胰酶抑制劑終止消化，用Iml Eppendorf移液槍將樣 品吹打成單細(xì)胞懸液。
[0025] 將經(jīng)FM1-43染色的細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至15mL管中，IOOOrpm離心5分鐘。離心完成之 后，完全棄上清，加入ImLPBS重懸細(xì)胞。用40 μ m的濾器對(duì)細(xì)胞懸液進(jìn)行過(guò)濾，除去較大的 細(xì)胞團(tuán)。過(guò)濾之后的細(xì)胞懸液進(jìn)行二次離心，IOOOrpm離心5分鐘之后完全去除上清。用含 20% FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移到無(wú)菌流式管中，在流式細(xì)胞分選 儀中進(jìn)行毛細(xì)胞分選。
[0026] (5)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜與特異性候選基因篩選
[0027] 將分選得到的內(nèi)耳毛細(xì)胞RNA進(jìn)行Phalanx小鼠基因表達(dá)譜檢測(cè)（檢測(cè)單位：上 海儀方生物科技有限公司）。經(jīng)對(duì)比內(nèi)耳干細(xì)胞祖細(xì)胞以及內(nèi)耳毛細(xì)胞后，對(duì)內(nèi)耳毛細(xì)胞差 異表達(dá)性基因進(jìn)行進(jìn)一步分析，從內(nèi)耳毛細(xì)胞中篩選出31個(gè)特異表達(dá)的基因。
[0028] (6)特異性組合式細(xì)胞標(biāo)記分子驗(yàn)證
[0029] 根據(jù)內(nèi)耳毛細(xì)胞篩選的31種特異表達(dá)的基因，結(jié)合比較內(nèi)耳干細(xì)胞、祖細(xì)胞中特 異表達(dá)的基因，候選Chrna9和Espnl共2種基因，對(duì)小鼠大腦、肝臟、皮膚、肺、腸、胃、腎臟、 肌肉、心臟及眼睛共10個(gè)不同的組織及器官進(jìn)行RNA提取后，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)檢測(cè)這 2種基因在不同組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，驗(yàn)證出Chrna9和Espnl兩種分子組合為小鼠內(nèi)耳 毛細(xì)胞最佳組合式細(xì)胞標(biāo)記分子。
[0030] 本發(fā)明提供的Chrna9和Espnl兩種細(xì)胞標(biāo)記分子在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中是特異性 表達(dá)的，通過(guò)Phalanx小鼠基因表達(dá)譜的檢測(cè)，表明Chrna9和Espnl兩種基因具有顯著的 高水平表達(dá)。本發(fā)明提供的新型組合式細(xì)胞標(biāo)記分子可應(yīng)用于小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的鑒定，通 過(guò)小鼠不同組織2種候選基因的檢測(cè)分子，只有在小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞中Chrna9和Espnl這兩 種基因都是陽(yáng)性表達(dá)的，因此這兩種基因的組合陽(yáng)性表達(dá)可作為小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分 子，用于小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的分選和純化依據(jù)及用于小鼠分離或體外培養(yǎng)擴(kuò)增的內(nèi)耳毛細(xì)胞 分選以及純化研究。
[0031] 本發(fā)明的有益效果是：
[0032] (1)本發(fā)明篩選出小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子Chrna9和 Espnl0
[0033] (2)以本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子可以區(qū)分小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞與其它組織來(lái) 源的細(xì)胞。
[0034] (3)使用本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子陽(yáng)性表達(dá)可鑒定小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞，為 發(fā)展新的分離純化技術(shù)提供依據(jù)。
[0035] (4)本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子也可為其他物種內(nèi)耳毛細(xì)胞特異性標(biāo)記分 子研究提供參考。 (四）【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036] 圖1小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞球顯微圖，A行為100X放大倍數(shù)下，內(nèi)耳干細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、 5天的形態(tài)，B行為250X放大倍數(shù)下，內(nèi)耳干細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、5天的形態(tài)；C行為用DAPI 對(duì)培養(yǎng)1、3、5天的內(nèi)耳干細(xì)胞球染色后，250X放大倍數(shù)下顯微圖。
[0037] 圖2小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞顯微圖。
[0038] 圖3雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞顯微圖；A為原代雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞，B為P3代雞胚橢 圓囊間質(zhì)細(xì)胞，密度為80-90%。
[0039] 圖4小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞顯微圖。
[0040] 圖5小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞檢測(cè)電泳圖，泳道1為Marker，泳道2為GAPDH，泳道3為 Myosin7a，泳道 4 為 Espin，泳道 5 為 Brn3c，泳道 6 為 P27kip1。
[0041] 圖6小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞標(biāo)志蛋白Myosin7a、Espin和Brn3c激光共聚焦顯微圖，A為 毛細(xì)胞特異性蛋白Myosin7a抗體標(biāo)志顯微圖；B為毛細(xì)胞特異性蛋白Espin抗體標(biāo)志顯微 圖；C為毛細(xì)胞特異性蛋白Brn3c抗體標(biāo)志顯微圖。
[0042] 圖7為內(nèi)耳毛細(xì)胞流式分選圖，（A)為通過(guò)門(mén)控去除細(xì)胞懸液中的死細(xì)胞及細(xì)胞 碎片；(B)為通過(guò)門(mén)控去除細(xì)胞懸液中的細(xì)胞聚集；(C)為通過(guò)門(mén)控去除細(xì)胞懸液中的粘連 體；(D)沒(méi)有細(xì)胞碎片和粘連體的細(xì)胞懸液，F(xiàn)M1-43陽(yáng)性細(xì)胞通過(guò)門(mén)分選收集；(E)通過(guò)分 析沒(méi)有染色的對(duì)照組，來(lái)說(shuō)明沒(méi)有FM1-43熒光的背景圖；(F)對(duì)分選出來(lái)的FM1-43陽(yáng)性細(xì) 胞，進(jìn)行重新分選。
[0043] 圖8候選基因在不同組織中的表達(dá)電泳圖，泳道1為大腦，泳道2為肝臟，泳道3為 皮膚，泳道4為肺，泳道5為腸，泳道6為胃，泳道7為腎臟，泳道8為肌肉，泳道9為心臟， 泳道10為眼睛，泳道11為內(nèi)耳毛細(xì)胞。
[0044] 圖9標(biāo)志分子Chrna9+Espnl在不同類(lèi)型細(xì)胞中的表達(dá)電泳圖，泳道1為內(nèi)耳單細(xì) 胞檢測(cè)Chrna9,泳道2為內(nèi)耳單細(xì)胞檢測(cè)Espnl ;泳道3為胃組織檢測(cè)Chrna9,泳道4為胃 組織檢測(cè)Espnl ;泳道5為腎臟組織檢測(cè)Chrna9,泳道6為腎臟組織檢測(cè)Espnl ;泳道7為 肌肉組織檢測(cè)Chrna9,泳道8為肌肉組織檢測(cè)Espnl。 (五）【具體實(shí)施方式】
[0045] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0046] 實(shí)施例1小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
[0047] 1)將ICR小鼠（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）在_20°C冰箱中麻醉5分鐘，浸入75%酒精 中殺菌。用手術(shù)剪將小鼠直接斷頭，去除皮毛。然后在無(wú)菌狀態(tài)下中分頭顱，去除大腦及 腦干，充分暴露位于顱底的顳骨。仔細(xì)的用剪刀和鑷子分離出顳骨，將其轉(zhuǎn)移到裝有4°C預(yù) 冷PBS (pH值為7.4)的3. 5cm培養(yǎng)皿中。顯微鏡下用鑷子在耳蝸底部鉆一個(gè)小孔，從下至 上剖開(kāi)螺殼，暴露完整的蝸軸和蝸管。用鑷子夾住耳蝸管的最底部，將耳蝸管與蝸軸分離。 由此得到的耳蝸管包括螺旋韌帶、前庭膜、以及基底膜（包含Corti器）。將分離得到的耳 蝸管轉(zhuǎn)移到新鮮預(yù)冷的PBS中，進(jìn)一步將包含Corti器的基底膜與前庭膜及螺旋韌帶分離 開(kāi)。將基底膜轉(zhuǎn)移到IOOuL 0.05% (w/v)的胰酶（購(gòu)自Gbico)中，37°C消化7分鐘，加入 100μ llmg/ml的大豆胰酶抑制劑（PBS緩沖液配制，購(gòu)自Gbico，pH = 7. 4)終止胰酶反應(yīng)。
[0048] 2)用量程為200 μ L的移液槍吹打步驟1)反應(yīng)物30-40次，使單細(xì)胞從基底膜中 脫落。細(xì)胞脫落后經(jīng)70 μ m的細(xì)胞篩過(guò)濾，去除較大的組織殘骸與碎片，得到幾乎沒(méi)有大細(xì) 胞聚集的單細(xì)胞懸液。然后用內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋?zhuān)?xì)胞密度為l〇 5/ml，獲得稀釋后的 單細(xì)胞懸液。內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：1% (v/v)B27(血清替代物B27)、2% (v/v)N2(血 清替代物N 2)、20ng/mL EGF(表皮生長(zhǎng)因子）、50ng/mL bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子、 10ng/mL IGF-I (類(lèi)胰島素生長(zhǎng)因子1)、50 μ g/ml青霉素，溶劑為DMEM/F12 (購(gòu)自Gbico)， DMEM/F12 組成為 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值為 L 4。
[0049] 3)稀釋后的單細(xì)胞懸液經(jīng)70 μ m的細(xì)胞篩過(guò)濾，獲得單細(xì)胞懸液。
[0050] 4)取步驟3)獲得的200 μ L單細(xì)胞懸液，用2mL內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋后在37°C、 5% CO2孵育箱中懸浮培養(yǎng)1-5天，其中內(nèi)耳干細(xì)胞會(huì)形成內(nèi)耳干細(xì)胞球，其它非干細(xì)胞的 細(xì)胞由于生長(zhǎng)條件的限制而逐漸凋亡。分別取50 μ L培養(yǎng)1、3和5天的內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基 滴于玻片上，在顯微鏡下分別放大100倍（圖1中的A行）和250倍（圖1中的B行）觀(guān) 察內(nèi)耳干細(xì)胞球。同時(shí)，分別取50 μ L培養(yǎng)1、3和5天的內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基，讓其中的內(nèi)耳 干細(xì)胞球在玻片上貼壁后，用200 μ L DAPI試劑（Roche公司）孵育細(xì)胞球1-3分鐘，進(jìn)行 DAPI染色，并放大250倍觀(guān)察內(nèi)耳干細(xì)胞球如圖1中C行所示，每一個(gè)細(xì)胞球里有幾十至數(shù) 百個(gè)細(xì)胞。
[0051] 實(shí)施例2內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞
[0052] 1)將實(shí)施例1中培養(yǎng)5天形成的內(nèi)耳干細(xì)胞球用量程為200μ L的移液槍吹打 成單細(xì)胞，并IOOOrpm離心5分鐘后收集細(xì)胞，然后細(xì)胞用2mL內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸后， 37 °C下培養(yǎng)5天形成P2代內(nèi)耳干細(xì)胞球。將P2代內(nèi)耳干細(xì)胞繼續(xù)傳代，獲得P3代內(nèi)耳干 細(xì)胞球。
[0053] 2)用200 μ L 0. lmg/ml的多聚賴(lài)氨酸（Sigma公司）孵育培養(yǎng)皿5分鐘，然后完全 吸除多聚賴(lài)氨酸。用PBS漂洗培養(yǎng)皿3次，每次5分鐘。將培養(yǎng)皿放入37°C孵育箱中干燥 過(guò)夜。
[0054] 3)將P3代內(nèi)耳干細(xì)胞球以500球/ml的密度懸浮在內(nèi)耳祖細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后 接種于上述用多聚賴(lài)氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)皿中，在37°C、5% CO2孵育箱中貼壁培養(yǎng)7天，形成 含內(nèi)耳祖細(xì)胞的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液IOOOrpm離心5分鐘，獲得內(nèi)耳祖細(xì)胞，如圖2。內(nèi)耳祖 細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：1% (v/v)B27、2% (v/v)N2(、50ng/mL FGF3(成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子3)、 50ng/mLFGF10 (成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)10)，溶劑為DMEM/F12 (購(gòu)自Gbico)，DMEM/F12組成為DMEM 和 Ham's F-12, pH 值為 L 4。
[0055] 實(shí)施例3雞胚橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞的分離與培養(yǎng)
[0056] 1)在顯微鏡下分離出20個(gè)胚胎期（E18)雞胚的橢圓囊，用0. 5mg/ml的嗜熱菌蛋 白酶（Sigma，DMEM/F12稀釋?zhuān)┰?7°C下處理40分鐘。加入5% (v/v)的血清終止消化后 去掉橢圓囊的感覺(jué)上皮。
[0057] 2)用PBS(pH值為7.4)清洗20個(gè)剩余的橢圓囊基質(zhì)部分，然后將其轉(zhuǎn)移到 200yLPBS 中。加入 200yL0.25% (w/v)的胰酶/EDTA(購(gòu)自 Gbico)，37°C 消化 7 分鐘。加 入400 μ L含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。
[0058] 3)用Eppendorf移液槍輕柔的吹打雞胚橢圓囊基質(zhì)組織，將基質(zhì)細(xì)胞分離出來(lái)接 種在IOcm培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)液為含10% (v/v)FBS的DMEM/F12,37°C培養(yǎng)至橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞 長(zhǎng)到整個(gè)培養(yǎng)皿的80-90% (圖3)的時(shí)候進(jìn)行傳代。
[0059] 4)傳代時(shí)，先完全吸除培養(yǎng)基，然后加入2mL 0.25% (w/v)的胰酶/EDTA(購(gòu)自 Gbico)，37°C消化7分鐘。加入4mL含10% (v/v)FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基終止消化。用 Eppendorf移液槍輕柔的將細(xì)胞吹打成單細(xì)胞懸液。用70 μ m細(xì)胞篩過(guò)濾細(xì)胞懸液，除去 較大的組織。將細(xì)胞接種IOcm培養(yǎng)皿中，37°C培養(yǎng)至橢圓囊基質(zhì)細(xì)胞長(zhǎng)到整個(gè)培養(yǎng)皿的 80-90%的時(shí)候進(jìn)行下一次傳代。細(xì)胞繼續(xù)擴(kuò)增兩代,然后進(jìn)行凍存,凍存液為90% (v/v) 血清加10% (v/v)的DMS0,每毫升凍存液中凍存IX IO6個(gè)細(xì)胞。
[0060] 實(shí)施例4內(nèi)耳祖細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞
[0061] 1)將明膠加入到24孔培養(yǎng)板中，37°C孵育半小時(shí)。然后完全吸除明膠，將實(shí)施例 3制備的P3代雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞接種在用明膠處理好的培養(yǎng)板中。37°C培養(yǎng)至基質(zhì)細(xì)胞 增長(zhǎng)到整個(gè)培養(yǎng)板面積的90%的時(shí)候，加入200 μ L含絲裂霉素（Sigma，2 μ g/mL)的培養(yǎng)基 (含10% FBS的DMEM/F12)，37°C在孵育箱中孵育3小時(shí)。完全吸除培養(yǎng)基，然后用PBS(pH 值7. 4)漂洗細(xì)胞3次，每次5分鐘，獲得滅活的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞。
[0062] 2)將實(shí)施例2制備的內(nèi)耳祖細(xì)胞接種在滅活的雞胚橢圓囊間質(zhì)細(xì)胞上，用內(nèi)耳毛 細(xì)胞誘導(dǎo)培養(yǎng)基在37°C下誘導(dǎo)分化7天，部分細(xì)胞分化為內(nèi)耳毛細(xì)胞，具有毛細(xì)胞的形態(tài)， 如圖4。內(nèi)耳毛細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：1% (ν/ν)Β27、2% (ν/ν)Ν2、5μΜ DAPT(Sigma公司）， 溶劑為 DMEM/F12 (購(gòu)自 Gbico)，DMEM/F12 組成為 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值為 L 4。
[0063] 實(shí)施例5誘導(dǎo)分化的內(nèi)耳毛細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)
[0064] 1)分化后細(xì)胞總RNA提?。簩?shí)施例4中祖細(xì)胞分化7天之后形成的含毛細(xì)胞 的細(xì)胞群體收集在15ml離心管中，IOOOrpm離心5分鐘棄上清；加入ImL TRIzol (TakaRa 公司），置漩渦振蕩器上震蕩至細(xì)胞完全溶解后，轉(zhuǎn)移至I. 5ml EP管（Axgen公司）中； 加入200 μ L氯仿（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），劇烈振蕩混勻，室溫放置5min ;4°C下 12, OOOrpm離心15min，吸取上層水相約300 μ L入新的I. 5ml EP管中；加入等體積的異 丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），顛倒混勻，室溫靜置IOmin ;4°C下12, OOOrpm離心 IOmin,棄上清；用體積濃度75%的乙醇水溶液洗漆沉淀，4?下12, OOOrpm離心5min，棄上 清；室溫干燥2-5min后，加入適量DEPC水（Sigma公司）溶解，即為總RNA樣品，用于下一 步實(shí)驗(yàn)或保存于-80°C冰箱。
[0065] 2) cDNA第一鏈合成：總RNA樣品用DNA酶（Sigma公司）消化處理清除殘余的 基因組DNA污染，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定（波長(zhǎng)為260nm) RNA濃度。cDNA第一鏈合成采 用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），每個(gè)樣品取2 μ g總RNA(0. 5-1 μ L)用于第一鏈合 成。具體步驟如下：2μ g總RNA(0. 5_1μ L)、ly L oligo(dT)18引物和1μ L隨機(jī)引物， ddH20 補(bǔ)至總體積 12μ L，置 65°C反應(yīng) 5min ;加入 5Xbuffer 4uL、dNTP 2μ L、ribolockTM RNase inhibitor 1 μ L 和 RevertAidTM M-MulV 反轉(zhuǎn)錄酶 1 μ L，反應(yīng)總體積為 20uL, 25°C 5min - 42°C 60min - 70°C 5min。合成的 cDNA 第一鏈用于下一步 PCR 反應(yīng)。
[0066] 3)PCR反應(yīng)：將上述制備的cDNA第一鏈作為模板進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所用引物序列 見(jiàn)表UPCR反應(yīng)采用PCR Mix試劑盒（上海翊圣生物技術(shù)有限公司），PCR反應(yīng)體系為：cDNA 2yL、2mM dNTP IyLUOyM 的上下游引物各 IyLUOXbufTer(含 Mg2+)5yL 和 TaqDNA 聚 合酶1 μ匕加 H2O補(bǔ)至總體積50μ L。PCR程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性30s，53°C? 62°C退火30s，72°C延伸30s，35循環(huán)，72°C延伸7min，退火溫度和循環(huán)數(shù)根據(jù)引物的具體情 況進(jìn)行選擇。反應(yīng)完成后取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μ L溴酚蘭指示劑（Sigma公司），用1. 2% 的瓊脂糖（Biowest公司）進(jìn)行凝膠電泳。電泳完畢后，用凝膠成像分析系統(tǒng)觀(guān)測(cè)結(jié)果如圖 5。表明實(shí)施例4中的內(nèi)耳祖細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)分化之后，部分細(xì)胞分化為毛細(xì)胞。
[0067] 表1用于RT-PCR的引物序列
[0068]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子，其特征在于所述的標(biāo)記分子為Chrna9和 Espnl 0
2. -種權(quán)利要求1所述的檢測(cè)小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞的標(biāo)記分子的應(yīng)用，其特征在于所述的 應(yīng)用為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細(xì)胞，提取單細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板， 分別以Chrna9正向引物和Chrna9反向引物，Espnl正向引物和Espnl反向引物作為兩對(duì) 引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若Chrna9正向引物和Chrna9反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物355bp，Espnl正向引 物和Espnl反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物759bp，則單細(xì)胞為小鼠內(nèi)耳毛細(xì)胞； Chrna9 正向引物：5' -AGCTGCGTCTCCAGTCAITC-3' ； Chrna9 反向引物：5' -TGCTGTCTCTACGGCITTGA-3 ; Espnl 正向引物：5' -GGTGGAGTGGTTACTCCGTG-3' ； Espnl 反向引物：5' -GGCATGTGGGCAITTCATCA-3'。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104313131SQ201410493237
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】王金福, 柳全文 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)