去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的試劑盒、方法及其生物制品的制備方法
【專(zhuān)利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的試劑盒、用該試劑盒去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，以及一種去除內(nèi)毒素的生物制品的制備方法，本發(fā)明的試劑盒包括陰離子表面活性劑和鉀鹽；本發(fā)明的方法是用陰離子表面活性劑與生物制品中的內(nèi)毒素充分結(jié)合，形成結(jié)合物，再加入鉀鹽使結(jié)合物沉淀，過(guò)濾去除沉淀即得到去除內(nèi)毒素的生物制品溶液，再?gòu)脑撋镏破啡芤褐蟹蛛x出生物制品即可。本試劑盒能夠簡(jiǎn)便、高效地去除生物制品中的內(nèi)毒素、成本低，本發(fā)明的去除內(nèi)毒素的方法易于操作、不影響生物制品的生物活性且只使用了醫(yī)藥工業(yè)準(zhǔn)許使用的化合物。用發(fā)明方法制備出的生物制品，其中的內(nèi)毒素含量符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)、活性物質(zhì)損失少。
【專(zhuān)利說(shuō)明】去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的試劑盒、方法及其生物制品 的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物制品的分離純化領(lǐng)域，特別是涉及一種去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒 素的試劑盒、去除方法及去除內(nèi)毒素的生物制品的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 隨著現(xiàn)代生物技術(shù)的廣泛應(yīng)用，生物制品的安全性受到越來(lái)越多的重視，尤其是 對(duì)生物制品中的熱原控制得越來(lái)越嚴(yán)格。但是在生物制品的生產(chǎn)過(guò)程中，常會(huì)因原輔料、生 產(chǎn)環(huán)境以及個(gè)人操作等因素引入熱原，在采用發(fā)酵工藝的藥物生產(chǎn)過(guò)程中還會(huì)因?yàn)樵谏a(chǎn) 過(guò)程中不可避免地需要將菌種破壁以釋放活性物質(zhì)而引入大量熱原，污染生物制品。因此 除了在生產(chǎn)環(huán)節(jié)中采取有效的工藝控制及嚴(yán)格的預(yù)防措施減少熱原的來(lái)源外，如何去除生 物制品中的熱原成為本領(lǐng)域的重要研究課題，但是迄今為止沒(méi)有一個(gè)簡(jiǎn)便、高效的方法。
[0003] 熱原（Pyrogen)指能引起恒溫動(dòng)物體溫異常升高的致熱物質(zhì)。它包括細(xì)菌性熱 原、內(nèi)源性高分子熱原、內(nèi)源性低分子熱原及化學(xué)熱原等。通常提到的"熱原"，主要是指細(xì) 菌性熱原，是某些細(xì)菌的代謝產(chǎn)物、細(xì)菌尸體及內(nèi)毒素。細(xì)菌內(nèi)毒素（Endotoxin)是革蘭氏 陰性菌細(xì)胞壁外膜的主要成分之一，其本質(zhì)是脂多糖（Lipopolysaccharide，LPS)，在化學(xué) 結(jié)構(gòu)上主要由多糖（Polysaccharide)和類(lèi)脂A (Lipid A)組成。它的特殊性在于它不是細(xì) 菌或細(xì)菌的代謝產(chǎn)物，而是細(xì)菌死亡或解體后才釋放出來(lái)的一種具有生物活性的物質(zhì)，而 類(lèi)脂A正是內(nèi)毒素多種生物活性或毒性反應(yīng)的主要基團(tuán)。雖然不同的革蘭氏陰性細(xì)菌，其 LPS的化學(xué)組成有一定的差別，但它們都含有類(lèi)脂A部分，也就是說(shuō)這個(gè)基團(tuán)沒(méi)有種屬特異 性，因此各屬細(xì)菌內(nèi)毒素的毒性反應(yīng)相似，如發(fā)熱、血液流動(dòng)力學(xué)改變、彌漫性血管內(nèi)凝血、 休克等。因此，為保證生物制品的使用安全，需要將其中的內(nèi)毒素含量降低到安全范圍內(nèi) [1]
[2]。比較公認(rèn)的注射劑內(nèi)毒素上限值是5EU/kg體重[3]。
[0004] 內(nèi)毒素的化學(xué)性質(zhì)非常穩(wěn)定，KKTC煮沸條件下不會(huì)被破壞；250°C 30分鐘以上或 者180°C 3小時(shí)以上才能被破壞；濃度為0. IM以上的強(qiáng)酸或者強(qiáng)堿浸泡才能被破壞[2]。在 生理?xiàng)l件下具有疏水性和電負(fù)性，通常分子量為十幾萬(wàn)至上百萬(wàn)道爾頓。通常采用的去除 手段有超濾、各種柱層析（如疏水層析、離子交換）、親和吸附（多粘菌素 B、L-組氨酸、多 聚-L-賴(lài)氨酸、多聚Y-L-谷氨酸交聯(lián)介質(zhì)）和濁點(diǎn)萃取法（Triton X-114)等，這些方法 能去除或滅活部分內(nèi)毒素，但是都存在著一定的缺點(diǎn)。比如超濾法只能應(yīng)用于小分子藥物， 如果藥物分子（譬如抗體）和內(nèi)毒素分子大小接近，就無(wú)法有效分離；柱層析成本高、效率 很低，不適合大規(guī)模生產(chǎn)中細(xì)菌內(nèi)毒素的去除；陰離子交換樹(shù)脂對(duì)于同樣帶負(fù)電荷的生物 分子就無(wú)法分離；濁點(diǎn)萃取法（Triton X-114)[4]也存在很大缺點(diǎn)如在操作過(guò)程中需要多次 萃取，造成質(zhì)粒中活性物質(zhì)的損失；處理時(shí)需要轉(zhuǎn)換溫度，相變后Triton X-114形成極細(xì) 小霧滴存在于水相，需要高速離心分離，難于工業(yè)化操作和控制等等。
[0005] 綜上所述，研發(fā)一種既能高效率、低成本去除內(nèi)毒素，又能最大限度地保持生物制 品活性的方法是本領(lǐng)域當(dāng)前的重要課題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的主要目的是針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中存在的技術(shù)缺陷，提供一種操作簡(jiǎn)單、能夠 有效去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的試劑盒；試劑盒包括鉀鹽和在足量所述鉀鹽存在下不能 溶于水的陰離子表面活性劑。
[0007] 所述陰離子表面活性劑選自十二烷基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、仲烷 基硫酸鈉，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油?；嗫s氨基酸鈉，烷基苯磺酸 鈉、α-烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、α-磺基單羧酸酯、脂肪酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽、烷 基萘磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、烷基甘油醚磺酸鈉。優(yōu)選十二烷基硫酸鈉、脫氧膽 酸鈉。
[0008] 所述陰離子表面活性劑在內(nèi)毒素去除過(guò)程中使用的終濃度取決于溶液中細(xì)菌內(nèi) 毒素的濃度，高于內(nèi)毒素的濃度即可，當(dāng)內(nèi)毒素濃度較高時(shí)所述陰離子表面活性劑濃度也 應(yīng)該提高。反之則可以使用較低濃度的所述陰離子表面活性劑。通常為質(zhì)量濃度不低于 Iwt %，優(yōu)選 5wt % -IOwt %。
[0009] 所述含鉀鹽選自氯化鉀、醋酸鉀、硫酸鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀、磷酸一氫鉀、 磷酸二氫鉀和硝酸鉀中的一種或幾種的組合，優(yōu)選醋酸鉀、氯化鉀。
[0010] 所述鉀鹽在內(nèi)毒素去除過(guò)程中使用的終濃度為不低于能使所述陰離子表面活性 劑充分沉淀的濃度，也就是說(shuō)，只要能使溶液中所述陰離子表面活性劑沉淀完全即可；一般 不低于0. 3M，優(yōu)選0. 5M-1M。
[0011] 所述陰離子表面活性劑和鉀鹽可以為固體，也可以為溶液，分別獨(dú)立包裝。
[0012] 本發(fā)明的另一目的是提供一種能夠有效去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，包括 以下步驟：將含有內(nèi)毒素的生物制品樣品與足量所述陰離子表面活性劑混合均勻靜置，再 加入足量所述鉀鹽混勻使所述陰離子表面活性劑沉淀完全，靜置后離心或者過(guò)濾，收集清 液得到去除內(nèi)毒素的生物制品樣品溶液。
[0013] 所述陰離子表面活性劑在其與含有內(nèi)毒素的生物制品混合后的溶液中的濃度取 決于溶液中細(xì)菌內(nèi)毒素的濃度，高于內(nèi)毒素的濃度即可，當(dāng)內(nèi)毒素濃度較高時(shí)所述陰離子 表面活性劑濃度也應(yīng)該提高。反之則可以使用較低濃度的所述陰離子表面活性劑。通常使 用質(zhì)量百分含量不低于lwt%。
[0014] 所述鉀鹽加至溶液中的終濃度為不低于能使所述陰離子表面活性劑充分沉淀的 濃度，也就是只要能使溶液中所述陰離子表面活性劑沉淀完全即可；一般不低于〇. 3M，優(yōu) 選(λ 5M-1M。
[0015] 所述生物制品為蛋白或核酸。
[0016] 本發(fā)明還有一個(gè)目的在于提供一種高效率、低成本去除內(nèi)毒素的生物制品的制備 方法，將含有內(nèi)毒素的生物制品樣品與足量所述陰離子表面活性劑混合均勻至陰離子表面 活性劑混合，靜置。再加入足量所述鉀鹽混勻至所述陰離子表面活性劑完全被鉀鹽沉淀完 全，靜置后離心或過(guò)濾；收集清液即是去除內(nèi)毒素的生物制品樣品溶液。再將所述生物制品 樣品從去除內(nèi)毒素的生物制品溶液中分離，即得去除內(nèi)毒素后的生物制品樣品。
[0017] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：本試劑盒能夠簡(jiǎn)便快捷地去除生物制品 中的內(nèi)毒素。本發(fā)明的去除內(nèi)毒素的方法易于操作、成本低，內(nèi)毒素去除效果顯著優(yōu)于現(xiàn)有 方法。而且不影響生物制品的生物活性，用發(fā)明方法制備出的生物制品，其中的內(nèi)毒素含量 符合臨床用藥標(biāo)準(zhǔn)、活性物質(zhì)損失少。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0018] 圖1所示為實(shí)驗(yàn)例1中內(nèi)毒素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0019] 本發(fā)明提供了一種去除生物制品中內(nèi)毒素的試劑盒，及利用該試劑盒去除生物制 品中內(nèi)毒素的方法，還有利用這種去除內(nèi)毒素的方法用來(lái)制備無(wú)內(nèi)毒素生物制品的方法。 本發(fā)明的核心原理是陰離子表面活性劑與內(nèi)毒素能夠很好地結(jié)合，另一方面，陰離子表面 活性劑在一定濃度鉀離子存在的條件下溶解度會(huì)變得足夠小；加入鉀離子能夠使與陰離 子表面活性劑相結(jié)合的內(nèi)毒素一同從水相以沉淀的形式析出，從而去除生物制品中的內(nèi)毒 素。再用常規(guī)方法將去除了內(nèi)毒素的生物制品從水溶液中分離純化出來(lái)，即得到去除了內(nèi) 毒素的生物制品。
[0020] 以下結(jié)合附圖和具體實(shí)施例，更具體地說(shuō)明本發(fā)明的內(nèi)容，并對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步 闡述，但這些實(shí)施例絕非對(duì)本發(fā)明有任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員在本說(shuō)明書(shū)的啟示下對(duì)本 發(fā)明實(shí)施例中所作的任何變動(dòng)都將屬于本發(fā)明權(quán)利要求書(shū)的范圍內(nèi)。
[0021] 實(shí)施例中所用到的生物材料的來(lái)源是廣泛的，任何不違反法律和道德倫理能夠獲 取的生物材料都可以按照實(shí)施例中的提示替換使用。所用方法如無(wú)特別說(shuō)明均為常規(guī)方 法。如無(wú)特別說(shuō)明，各實(shí)施例中相同名稱(chēng)的材料或試劑內(nèi)容相同。
[0022] 實(shí)驗(yàn)例1、生物制品樣品去除內(nèi)毒素前的準(zhǔn)備工作
[0023] -、內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品含量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0024] 1、實(shí)驗(yàn)材料
[0025] 顯色基質(zhì)鱟試劑盒購(gòu)自廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司；所用實(shí)驗(yàn)器材均無(wú)內(nèi)毒 素。
[0026] 2、內(nèi)毒素溶液標(biāo)準(zhǔn)品的制備及標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
[0027] 均按照廈門(mén)市鱟試劑實(shí)驗(yàn)廠有限公司提供的顯色基質(zhì)鱟試劑盒使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。
[0028] 用光度測(cè)定法測(cè)得內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品的吸光度（見(jiàn)表1)，并以吸光度為Y軸，內(nèi)毒素濃 度為X軸，繪制出內(nèi)毒素濃度-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線（見(jiàn)圖1)，得到y(tǒng) = 〇.791X+0.084(R2 = 0.994)的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。
[0029] 表1內(nèi)毒素標(biāo)準(zhǔn)品吸光度值
[0030]

【權(quán)利要求】
1. 去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的試劑盒，其特征在于，包括鉀鹽和在足量所述鉀鹽存 在下不能溶于水的陰離子表面活性劑，所述陰離子表面活性劑優(yōu)選十二烷基硫酸鈉、脫氧 膽酸鈉、十二烷基磺酸鈉、仲烷基硫酸鈉，脂肪醇聚氧乙烯醚硫酸酯鈉、油醇硫酸鈉、N-油 ?；嗫s氨基酸鈉，烷基苯磺酸鈉、烯烴磺酸鈉、烷基磺酸鈉、a-磺基單羧酸酯、脂肪 酸磺烷基酯、琥珀酸酯磺酸鹽、烷基萘磺酸鹽、石油磺酸鈉、木質(zhì)素磺酸鈉、烷基甘油醚磺酸 鈉，更優(yōu)選的是十二烷基硫酸鈉、脫氧膽酸鈉。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述試劑盒，其特征在于，所述陰離子表面活性劑在內(nèi)毒素去除 過(guò)程中使用的終濃度高于內(nèi)毒素的濃度；所述終濃度一般為質(zhì)量濃度不低于lwt%，優(yōu)選 5wt % _10wt %。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述試劑盒，其特征在于，所述含鉀鹽選自氯化鉀、醋酸鉀、硫酸 鉀、碳酸鉀、碳酸氫鉀、磷酸鉀、磷酸一氫鉀、磷酸二氫鉀和硝酸鉀中的一種或幾種的組合， 優(yōu)選醋酸鉀、氯化鉀。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述試劑盒，其特征在于，所述鉀鹽在內(nèi)毒素去除過(guò)程中使用 的終濃度為不低于能使所述陰離子表面活性劑充分沉淀的濃度，一般不低于〇. 3M，優(yōu)選 0? 5M-1M。
5. -種去除生物制品中細(xì)菌內(nèi)毒素的方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-4任一所述 試劑盒，包括以下步驟：將含有內(nèi)毒素的生物制品樣品與所述足量陰離子表面活性劑溶液 混合均勻靜置，再加入所述足量鉀鹽混勻使所述陰離子表面活性劑沉淀完全，靜置后離心 或者過(guò)濾，收集清液得到去除內(nèi)毒素的生物制品樣品溶液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述方法，其特征在于，所述陰離子表面活性劑在其與含有內(nèi)毒素 的生物制品混合后的溶液中的終濃度高于所述內(nèi)毒素的濃度；一般質(zhì)量百分含量不低于 1界1:(%。優(yōu)選5(%-10(%。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5或6所述方法，其特征在于，所述鉀鹽加至其在溶液中的終濃度為不 低于能使所述陰離子表面活性劑充分沉淀的濃度，一般不低于〇. 3M，優(yōu)選0. 5M-1M。
8. 根據(jù)權(quán)利要求5-7任一所述方法，其特征在于，所述生物制品為蛋白或核酸。
9. 一種去除內(nèi)毒素的生物制品的制備方法，其特征在于，利用權(quán)利要求1-4任一所述 試劑盒將含有內(nèi)毒素的生物制品樣品與所述足量陰離子表面活性劑混合均勻，靜置，再加 入足量所述鉀鹽混勻至所述陰離子表面活性劑完全被鉀鹽沉淀完全，靜置后離心或過(guò)濾， 收集清液即是去除內(nèi)毒素的生物制品樣品溶液，再將所述生物制品樣品從去除內(nèi)毒素的生 物制品溶液中分離，即得去除內(nèi)毒素后的生物制品樣品。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104370997SQ201410494101
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】陳輝 申請(qǐng)人:陳輝