一株芽孢桿菌及復(fù)合廢水培養(yǎng)產(chǎn)絮凝劑的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一株芽孢桿菌及復(fù)合廢水培養(yǎng)產(chǎn)絮凝劑的方法，該芽孢桿菌(Bacillus sp.)保藏編號為CGMCC NO.9143。本發(fā)明的芽孢桿菌，可以以豆制品廢水和/或味精廢水為培養(yǎng)基，發(fā)酵培養(yǎng)得到多糖絮凝劑。本發(fā)明的芽孢桿菌和產(chǎn)絮凝劑的方法，不僅可高產(chǎn)絮凝劑，同時(shí)能去除豆制品廢水和味精廢水的COD和NH4+-N，此外，得到的多糖絮凝劑不僅可以改善濃縮污泥脫水性能，而且可以去除米氏凱倫藻培養(yǎng)液中的米氏凱倫藻及塔馬亞歷山大藻培養(yǎng)液中的塔馬亞歷山大藻。
CGMCC No. 9143
2014.05.12
【專利說明】一株芽孢桿菌及復(fù)合廢水培養(yǎng)產(chǎn)絮凝劑的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株產(chǎn)絮凝劑的芽孢桿菌的選育、以及味 精廢水和豆制品廢水復(fù)合培養(yǎng)芽孢桿菌產(chǎn)絮凝劑的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 生物絮凝劑具有高效、無毒和可生物降解性，是典型的環(huán)境友好功能材料，代表 了絮凝劑的重要研發(fā)方向之一。Burterfield于1935年從活性污泥中最早篩選到產(chǎn)絮凝 劑的微生物。20世紀(jì)70年代以來，國內(nèi)外學(xué)者篩選到許多產(chǎn)絮凝劑的微生物，發(fā)現(xiàn)從土 壤、活性污泥、生活污水、工業(yè)廢水以及各類沉積物樣品中，均可分離得到具有產(chǎn)絮能力的 微生物，包括細(xì)菌、藻類、放線菌、真菌和酵母等（朱艷彬等，中國環(huán)境科學(xué)學(xué)會學(xué)術(shù)年會論 文集，2009,173-178)。20世紀(jì)末，日本學(xué)者從旱田土壤分離篩選得到的一株紅串紅球菌 (Rhodococcus erythropolis) S-I產(chǎn)生的N0C-1，是已發(fā)現(xiàn)效果最好的生物絮凝劑之一，具 有強(qiáng)而廣泛的絮凝活性（J Takeda M, Agric. Biol. Chem, 1991，55(10) :2263-2264)。
[0003] 生物絮凝劑屬于天然有機(jī)高分子絮凝劑，可以根據(jù)不同的方式進(jìn)行分類：（1)根 據(jù)來源不同分為3類：直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑，如某些細(xì)菌、霉菌、放線菌和酵母；利 用微生物細(xì)胞提取物的絮凝劑，如酵母細(xì)胞壁的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白質(zhì)和N-乙酰葡萄 糖胺等；利用微生物細(xì)胞代謝產(chǎn)物的絮凝劑，微生物細(xì)胞分泌到細(xì)胞外的代謝產(chǎn)物，主要成 分為多糖及少量的多肽、蛋白質(zhì)、脂類及其復(fù)合物；(2)根據(jù)化學(xué)組成的不同分為3類：糖類 物質(zhì)，絕大多數(shù)是代謝產(chǎn)生的各種多聚糖類；多肽、蛋白質(zhì)和DNA類物質(zhì)，已知絮凝能力最 好的生物絮凝劑N0C-1的主要成分即為蛋白質(zhì)，其最大相對分子質(zhì)量為75萬；脂類物質(zhì)，目 前發(fā)現(xiàn)的唯一的脂類絮凝劑是1994年Kurane從Rhodococcus erythropolis s_l的培養(yǎng) 液中分離出來的生物絮凝劑；（3)根據(jù)在分散介質(zhì)水中所帶電荷的不同分為3類：兩性型蛋 白質(zhì)和多肽類大分子，為兩性電解質(zhì)；非離子型多糖類生物絮凝劑，屬于非離子型絮凝劑； 陰離子型直接利用微生物細(xì)胞的絮凝劑（李大鵬，哈爾濱工業(yè)大學(xué)博士論文，2010, 4-5)。
[0004] 以廉價(jià)底物為原料培養(yǎng)微生物產(chǎn)絮凝劑被廣泛地研究。如Xiaoling Zhang等以 糖蜜為原料培養(yǎng)Bacillus Iicheniformis產(chǎn)絮凝劑，優(yōu)化的培養(yǎng)基配方為20g · I71糖蜜、 0· 4g · Γ1 尿素、0· 4g · T1NaCUO. 2g · T1KH2PO4U. 6g · 17%冊04、0· 2g · T1MgSO4 ;在優(yōu)化 條件下 12h 內(nèi)產(chǎn)絮凝劑活性達(dá)到 700U .mrHXiaoling Zhang, et al, Biotechnology and Bioprocess Engineering, 2012, 17:1041-1047)〇
[0005] 影響生物絮凝劑發(fā)酵的因素很多，培養(yǎng)基的組成、C/N比、培養(yǎng)基的pH值、溫度、溶 氧等都將影響生物絮凝劑的產(chǎn)率。細(xì)胞生長與生物絮凝劑產(chǎn)生的關(guān)系因菌種不同而異。根 據(jù)國內(nèi)外相關(guān)研究者對胞外分泌產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)絮菌的研究表明，其產(chǎn)生胞外代謝物的時(shí)間 主要應(yīng)該在對數(shù)期后期和穩(wěn)定期前期、中期，在對數(shù)期前期基本上不產(chǎn)絮凝劑。
[0006] 目前，生物絮凝劑的研究還存在一些問題，主要表現(xiàn)為：（1)絮凝效率低，制備成 本高；（2)代謝途徑特別是多種菌株產(chǎn)復(fù)合絮凝劑的代謝途經(jīng)及調(diào)控機(jī)理還不清楚；（3)從 大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)和應(yīng)用急需解決的關(guān)鍵問題（如降低成本、提高產(chǎn)絮能力、生產(chǎn)的調(diào)控、提 高產(chǎn)絮穩(wěn)定性等）角度開展的大規(guī)模的發(fā)酵技術(shù)研究幾乎是空白。因此，繼續(xù)選育具有高 效、穩(wěn)定的產(chǎn)絮能力的微生物種質(zhì)資源，以及在對其代謝途徑和調(diào)控機(jī)理研究基礎(chǔ)上開展 的發(fā)酵技術(shù)研究，是生物絮凝劑真正實(shí)現(xiàn)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)的關(guān)鍵。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于提供一株產(chǎn)生物絮凝劑的細(xì)菌。
[0008] 本發(fā)明的第一方面，提供一株芽孢桿菌（Bacillus sp.)，其保藏編號為CGMCC NO. 9143。
[0009] 本發(fā)明的第二方面，提供第一方面所述的芽孢桿菌Bacillus sp.的用途，用于制 備絮凝劑。
[0010] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑為多糖。
[0011] 本發(fā)明的第三方面，提供一種絮凝劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0012] (a)將保藏編號為CGMCC NO. 9143的芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24h得 到一級種子液；
[0013] 任選地（b)將步驟（a)得到的一級種子液在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18_24h得到二級 種子液；
[0014] 以及（C)將步驟（a)得到的一級種子液或步驟（b)得到的二級種子液接種于發(fā)酵 培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到所述絮凝劑。
[0015] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑為多糖。
[0016] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中于35-45°C、150-180rpm的條件下培養(yǎng)。
[0017] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（b)中于35-45°C、通氣量5-10L/min、攪拌速度 350-450rpm的條件下培養(yǎng)。
[0018] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（(：）中于30-501：(較佳地35-45°〇的條件下培養(yǎng)。
[0019] 在另一優(yōu)選例中，所述種子液的菌液濃度為1-2X IO9Cfu · πιΓ1。
[0020] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（b)中，所述一級種子液與所述種子培養(yǎng)基的體積比 3-10:100,較佳地為 4-6:100,更佳為 5:100。
[0021] 在另一優(yōu)選例中，所述二級種子液或所述一級種子液與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比 為 5-15:100,較佳地為 8-12:100,更佳為 10:100。
[0022] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基，較佳地，所述產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng) 基的組成為：葡萄糖 20g、K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0. lg、尿素 0. 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、ρΗ7· 5。
[0023] 在另一優(yōu)選例中，所述種子培養(yǎng)基為廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以下組分：
[0024] 豆制品廢水和/或味精廢水 500-8001111.17 1;
[0025] 水 200_500ml · ΙΛ
[0026] 其中，所述廢水培養(yǎng)基包含?制品廢水和味精廢水時(shí)，所述?制品廢水的含量為 250-500ml · Γ1，較佳地為300-400ml · Γ1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml · Γ1，較佳地 200-300ml · L'
[0027] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以下組分：
[0028] 豆制品廢水和/或味精廢水 500-8001111.17 1;
[0029] 水 200-5001111.171,
[0030] 其中，所述廢水培養(yǎng)基包含?制品廢水和味精廢水時(shí)，所述?制品廢水的含量為 250-500ml · Γ1，較佳地為300-400ml · Γ1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml · Γ1，較佳地 200-300ml · L'
[0031] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有0. 5-5g · LlH2PO4 ;較佳地為 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地為 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0032] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基中還含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量為 5_15g · L、
[0033] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（c)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期，流加5_15g · Γ1的葡萄 糖，較佳地流加8_12g · Γ1的葡萄糖。
[0034] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（C)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期，氧飽和度維持在 15-95 %，較佳地為20-90 %，更佳地為25-65 %。
[0035] 在另一優(yōu)選例中，所述制備方法還包括采用乙醇沉淀出所述絮凝劑的步驟。
[0036] 在另一優(yōu)選例中，所述乙醇與所述步驟（c)獲得的發(fā)酵液的體積比為3-4:1。
[0037] 本發(fā)明的第四方面，提供一種絮凝劑，采用第三方面所述的方法制備獲得。
[0038] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑為多糖。
[0039] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑具有以下一個或多個特征：
[0040] (1)具有如圖3所示的紅外特征譜圖；
[0041] (2)具有如圖4所示的紫外特征譜圖。
[0042] 本發(fā)明的第五方面，提供第四方面所述的絮凝劑的用途，所述絮凝劑用于：
[0043] (i)制備改善濃縮污泥脫水性能的促進(jìn)劑；或
[0044] (ii)去除米氏凱倫藻；或
[0045] (iii)去除塔馬亞歷山大藻。
[0046] 在另一優(yōu)選例中，去除米氏凱倫藻培養(yǎng)液中的米氏凱倫藻。
[0047] 在另一優(yōu)選例中，去除塔馬亞歷山大藻培養(yǎng)液中的塔馬亞歷山大藻。
[0048] 在另一優(yōu)選例中，所述米氏凱倫藻培養(yǎng)液是F/2培養(yǎng)基。
[0049] 在另一優(yōu)選例中，所述塔馬亞歷山大藻培養(yǎng)液是F/2培養(yǎng)基。
[0050] 在另一優(yōu)選例中，所述F/2培養(yǎng)基配方：NaN0375mg、NaH2PO 4 · H2O 5mg、 Na2SiO3 ·9Η20 20mg,Na2EDTA 4. 36mg,FeCl3 ·6H20 3. 16mg,CuSO4 · 5H20 0. Olmg^ZnSO4 · 7H20 0· 023mg、CoCl2 ·6Η20 0· 012mg、MnCl2 ·4Η20 0· 18mg、Na2Mo04 ·2Η20 0· 07mg、維生素 B1O. lg、 維生素 B12O. 5g、生物素0. 5g、自然海水（0. 4 μ m孔徑濾膜過濾）1000ml。
[0051] 本發(fā)明的芽孢桿菌和產(chǎn)絮凝劑的方法，不僅可高產(chǎn)絮凝劑，而且在較高溫度下培 養(yǎng)，同時(shí)能去除豆制品廢水和味精廢水的COD和NH/-N，此外，得到的多糖絮凝劑不僅可以 改善濃縮污泥脫水性能，而且可以去除米氏凱倫藻培養(yǎng)液中的米氏凱倫藻及塔馬亞歷山大 藻培養(yǎng)液中的塔馬亞歷山大藻。
[0052] 應(yīng)理解，在本發(fā)明范圍內(nèi)，本發(fā)明的上述各技術(shù)特征和在下文（如實(shí)施例）中具體 描述的各技術(shù)特征之間都可以互相組合，從而構(gòu)成新的或優(yōu)選的技術(shù)方案。限于篇幅，在此 不再一一贅述。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0053] 圖1是Bacillus sp. WZOl的革蘭氏染色圖。
[0054] 圖2是Bacillus sp. WZYOl分批補(bǔ)料發(fā)酵產(chǎn)絮凝劑的進(jìn)程圖。
[0055] 圖3是絮凝劑的紅外光譜分析圖譜。
[0056] 圖4是絮凝劑的紫外光譜分析圖譜。

【具體實(shí)施方式】
[0057] 本申請的發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入地研究，首次意外研發(fā)出一種新的芽孢桿菌 (Bacillus sp.)WZY01，具有高的產(chǎn)絮凝劑能力，能在較高溫度下培養(yǎng)，并可直接利用豆制 品廢水和味精廢水為營養(yǎng)來源產(chǎn)絮凝劑，可為微生物發(fā)酵法生產(chǎn)絮凝劑提供種源。在此基 礎(chǔ)上，完成了本發(fā)明。
[0058] 芽孢桿菌
[0059] 本發(fā)明采用常規(guī)分離方法，從采自浙江溫州西片污水處理廠的活性污泥中分離并 經(jīng)復(fù)合誘變育種獲得一株芽孢桿菌（Bacillus sp.)，編為Bacillus sp.WZYOl，已保藏于中 國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3 號，保藏中心登記入冊編號為CGMCC NO. 9143,保藏起始日期為2014年05月12日。
[0060] LB培養(yǎng)基
[0061] LB培養(yǎng)基是常用的細(xì)菌培養(yǎng)基，因其營養(yǎng)豐富，可使細(xì)菌菌種快速生長而達(dá)到活 化或作為種子的要求。可以根據(jù)《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》（J.薩姆布魯克D.W.拉塞爾著）進(jìn) 行配制。
[0062] 廢水培養(yǎng)基
[0063] 本發(fā)明的廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以下組分：
[0064] 豆制品廢水和/或味精廢水 500-8001111.17 1;
[0065] 水 200_500ml · ΙΛ
[0066] 其中，當(dāng)所述廢水培養(yǎng)基包含?制品廢水和味精廢水時(shí)，所述?制品廢水的含量 為250-500ml .L-1，較佳地為300-400ml .L-1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml .L-1，較佳 地 200-300ml · ΙΛ
[0067] 基于所述復(fù)合廢水培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
[0068] 在另一優(yōu)選例中，本發(fā)明的廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以下組分：
[0069] 豆制品廢水和味精廢水 500-8001111.17 1;
[0070] 水 200_500ml · ΙΛ
[0071] 其中，所述豆制品廢水的含量為250-500ml · Γ1，較佳地為300-400ml · Γ1 ;所述 味精廢水的含量為150_400ml · I71，較佳地200-300ml · Γ1，
[0072] 基于所述復(fù)合廢水培養(yǎng)基的總體積計(jì)。
[0073] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還含有0· 5_5g · T1KH2PO4 ;較佳地為 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地為 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0074] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還含有葡萄糖，所述葡萄糖的含量為5_15g · Γ1， 較佳地為8-128·?Α
[0075] 應(yīng)理解，培養(yǎng)基配方中的水并不包含豆制品廢水和味精廢水中的水。
[0076] 本發(fā)明的?制品廢水和味精廢水沒有特別的限制，任何加工?制品后的廢水和任 何生產(chǎn)味精后的除菌體蛋白尾液的廢水均可用于本發(fā)明。
[0077] 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，豆制品廢水的COD為15000-20000mg · Γ1、ΝΗ4+-Ν為 50-100mg · Γ1，pH 為 4. 5-5. 5。
[0078] 在一優(yōu)選實(shí)施方式中，味精廢水的COD 20000-25000mg · L' NH4+-N為 18000-25000mg · L' SO廣為 50000-60000mg · L' pH 為 4· 0-4. 5。
[0079] 絮凝劑
[0080] 本發(fā)明還提供芽孢桿菌（Bacillus sp.)WZYOl在復(fù)合廢水培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)得到 的絮凝劑。
[0081] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑為多糖。
[0082] 本發(fā)明提供的絮凝劑可用于改善濃縮污泥脫水性能、去除米氏凱倫藻培養(yǎng)液中的 米氏凱倫藻、或去除塔馬亞歷山大藻培養(yǎng)液中的塔馬亞歷山大藻。
[0083] 優(yōu)選地，絮凝劑用于改善濃縮污泥脫水性能的適宜添加量為l_2ml 3%絮凝劑溶 液，pH 6. 2-7.0,溫度 20-35 °C。
[0084] 優(yōu)選地，絮凝劑用于去除米氏凱倫藻或塔馬亞歷山大藻的適宜濃度為0. 4-0. 6% (ff/V), pH 7. 5-8. 5 〇
[0085] 絮凝劑制備方法
[0086] 本發(fā)明的絮凝劑的制備方法，所述方法包括以下步驟：
[0087] (a)將保藏編號為CGMCC NO. 9143的芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24h得 到一級種子液；
[0088] (b)將步驟（a)得到的一級種子液在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18_24h得到二級種子液；
[0089] (C)將步驟（b)得到的二級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)得到所述絮凝劑。
[0090] 在另一優(yōu)選例中，所述絮凝劑為多糖。
[0091] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（a)中于35-45°C、150-180rpm的條件下培養(yǎng)。
[0092] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（b)中于35_45°C的條件下培養(yǎng)，所述步驟（c)中于 30-50°C (較佳地35-45°C)的條件下培養(yǎng)。
[0093] 在另一優(yōu)選例中，所述種子液的菌液濃度為1-2X IO9Cfu · πιΓ1。
[0094] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（b)中，所述一級種子液與所述種子培養(yǎng)基的體積比 3-10:100,較佳地為 4-6:100,更佳為 5:100。
[0095] 在另一優(yōu)選例中，所述二級種子與所述發(fā)酵培養(yǎng)基的體積比為5-15:100,較佳地 為 8-12:100,更佳為 10:100。
[0096] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基，其組成為：葡萄糖20g、 K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、pH7. 5。
[0097] 在另一優(yōu)選例中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以下組分：
[0098] 豆制品廢水和/或味精廢水 500-8001111.17 1;
[0099] 水 200_500ml · ΙΛ
[0100] 其中，當(dāng)所述廢水培養(yǎng)基包含?制品廢水和味精廢水時(shí)，所述?制品廢水的含量 為250-500ml .L-1，較佳地為300-400ml .L-1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml .L-1，較佳 地 200-300ml · L'
[0101] 在另一優(yōu)選例中，所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基為廢水培養(yǎng)基，pH為7-9,包含以 下組分：
[0102] 豆制品廢水和味精廢水 500-800ml · Γ1 ;
[0103] 水 200_500ml · ΙΛ
[0104] 所述豆制品廢水的含量為250-500ml · L-1，較佳地為300-400ml · L-1 ;所述味精廢 水的含量為 150_400ml · Γ1，較佳地 200-300ml · Γ1，
[0105] 所述種子培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基可以相同，可以不同。
[0106] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還含有0. 5_5g · T1KH2PO4 ;較佳地為 l-4g · T1KH2PO4 ;更佳地為 I. 2-3. 5g · T1KH2PO415
[0107] 在另一優(yōu)選例中，所述培養(yǎng)基中還含有葡萄糖，所述葡糖糖的含量為5-15g · L'
[0108] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（c)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期，流加5_15g · Γ1的葡萄 糖，較佳地流加8-12g · Γ1的葡萄糖。
[0109] 在另一優(yōu)選例中，所述步驟（c)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期，氧飽和度維持在 15-95 %，較佳地為20-90 %，更佳地為25-65 %。
[0110] 在另一優(yōu)選例中，所述制備方法還包括采用乙醇沉淀出所述絮凝劑的步驟。
[0111] 在另一優(yōu)選例中，所述乙醇與所述步驟（b)獲得的發(fā)酵液的體積比為3-4:1。
[0112] 本發(fā)明能夠達(dá)到以下技術(shù)效果：
[0113] 1.本發(fā)明提供一種新型的芽孢桿菌（Bacillus sp.)WZY01，具有高的產(chǎn)絮凝劑能 力，較高的培養(yǎng)溫度，并可直接利用豆制品廢水和味精廢水為營養(yǎng)來源產(chǎn)絮凝劑，可為微生 物發(fā)酵法生產(chǎn)絮凝劑提供種源。
[0114] 2.本發(fā)明提供了適合培養(yǎng)菌株Bacillus sp. WZYOl產(chǎn)絮凝劑的豆制品廢水和味 精廢水復(fù)合的培養(yǎng)基配方和培養(yǎng)方法。
[0115] 3.在最佳培養(yǎng)條件下，菌株Bacillus sp. WZYOl產(chǎn)絮凝劑的產(chǎn)量達(dá)8. 6898·!^， 產(chǎn)率達(dá) 0· 362g · 17?'
[0116] 4.本發(fā)明不僅可高產(chǎn)絮凝劑，同時(shí)能有效去除豆制品廢水和味精廢水的COD和 NH:-N。
[0117] 下面結(jié)合具體實(shí)施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明 而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條 件如 Sambrook 等人，分子克?。簩?shí)驗(yàn)室手冊（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。除非另外說明，否則百分比和 份數(shù)按重量計(jì)算。
[0118] 除非另行定義，文中所使用的所有專業(yè)與科學(xué)用語與本領(lǐng)域熟練人員所熟悉的意 義相同。此外，任何與所記載內(nèi)容相似或均等的方法及材料皆可應(yīng)用于本發(fā)明方法中。文 中所述的較佳實(shí)施方法與材料僅作示范之用。
[0119] 通用方法
[0120] 絮凝活性（以絮凝率表征）
[0121] 在IOOml量筒中加入80ml蒸饋水，0· 4g高嶺土（平均粒度4. 5um)，5ml 1 % CaCl2 溶液，2ml上清液待測樣品，再加蒸餾水至IOOml，調(diào)pH值至7. 0,然后倒入150ml燒杯，在磁 力攪拌器上快速攪拌lmin，慢速攪拌3min，靜置IOmin,吸取一定深度的上清液于550nm處 測定吸光度，同時(shí)以不加含絮凝劑的上清液作對照，計(jì)算絮凝率（劉國祥等，安全與環(huán)境學(xué) 報(bào)，2006, 6(1) :103-106)。
[0122] 絮凝率=(A-B)/A X 100%
[0123] 式中A為對照上清液在550nm處的吸光度，B為樣品上清液在550nm處的吸光度。
[0124] 實(shí)施例1
[0125] 絮凝劑產(chǎn)生菌的分離
[0126] 樣品為采自浙江溫州西片污水處理廠的活性污泥，將Ig活性污泥加入99ml無菌 水混勻，然后用無菌水稀釋成重量（g)體積（ml)比為ΙΟ'ΙΟ'ΚΓ 6三個稀釋，涂布接種于 LB平板，于35°C下培養(yǎng)48h后挑取單菌落在LB平板上劃線純化，直至經(jīng)鏡檢為純培養(yǎng)物為 止，然后轉(zhuǎn)接于LB斜面經(jīng)培養(yǎng)后于4°C下保藏。
[0127] 將分離獲得的純菌株分別接種于產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基（葡萄糖20g、K2HP0 45g、 KH2P042g、（NH4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgS040. 2g、H201000ml、pH7. 5) 中，在35°C、160rpm下振蕩培養(yǎng)72h，于8000rpm下離心IOmin得上清液，測定上清液對高 嶺土懸池液的絮凝活性，篩選產(chǎn)絮凝活性高的菌株。對產(chǎn)絮凝活性超過70%的菌株進(jìn)行10 代傳代培養(yǎng)，以檢測其產(chǎn)絮凝活性的穩(wěn)定性。
[0128] 經(jīng)初篩、復(fù)篩并傳代試驗(yàn)，獲得1株產(chǎn)絮凝活性達(dá)80. 80 %并穩(wěn)定的菌株，該菌 株菌體桿狀、具莢膜和芽孢、革蘭氏陽性（見圖1)，初步鑒定為芽孢桿菌，編為Bacillus sp. WZ01。
[0129] 實(shí)施例2
[0130] Bacillus sp. WZOl 的復(fù)合誘變
[0131] 將實(shí)施例1獲得的菌株Bacillus sp. WZOl接入裝有50ml LB培養(yǎng)基的250ml錐形 瓶內(nèi)，在35°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)24h進(jìn)行活化，然后按5%的體積比轉(zhuǎn)接于裝有50ml LB 培養(yǎng)基的250ml錐形瓶內(nèi)，在35°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)至對數(shù)期（約18h)。取50ml菌液在 5000rpm下離心IOmin,菌體用生理鹽水洗漆2次后，用生理鹽水制成IO 8個^r1左右的菌 懸液。取15ml菌懸液于平皿中進(jìn)行紫外線誘變。采用功率為15W UV紫外燈，照射距離為 20cm，照射時(shí)間為18min。取5ml經(jīng)紫外光照射后菌懸液接種于用黑紙包裹的裝有50ml LB 培養(yǎng)基的250ml錐形瓶中，在40°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)4-6h。
[0132] 將培養(yǎng)4-6h的菌液在5000rpm下離心lOmin，菌體用pH6. 0的磷酸緩沖液洗滌2 次后，用pH6. 0的磷酸緩沖液制成IO8個· πιΓ1左右的菌懸液。取Iml菌懸液于試管中，力口 Img · Hir1NTG (用pH6. 0的磷酸緩沖液配制）lml，使NTG終濃度為500 μ g · ml-1，混勻后置 22°C水浴保溫30min，并不斷搖動試管，然后離心棄上清液終止反應(yīng)，用LB培養(yǎng)液稀釋20 倍，22°C水浴過夜，取1滴菌液涂布于LB平板于40°C下培養(yǎng)后挑去單菌落，特別注意挑取生 長快、與原始菌株的菌落形態(tài)比較有所改變的單菌落。將單菌落在LB平板上劃線純化直至 為純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于LB斜面經(jīng)培養(yǎng)后于4°C下保藏。
[0133] 將獲得的純菌株分別接種于產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基（葡萄糖20g、K2HP045g、KH 2P042g、 (NH4)2SO4O. 2g、NaClO. lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgSO4O. 2g、H2O 1000ml、ρΗ7· 5)中，在 40°C、150rpm下振蕩培養(yǎng)72h，于8000rpm下離心IOmin得上清液，測定上清液對高嶺土懸 濁液的絮凝活性；剩余上清液中加3-4倍體積的預(yù)冷乙醇，4°C下放置過夜，IOOOOrpm離心 IOmin得沉淀，用乙醇洗滌沉淀2次后真空干燥得絮凝劑粗品，稱重，計(jì)算絮凝劑產(chǎn)量；篩選 產(chǎn)絮凝活性和絮凝劑產(chǎn)量高的菌株。對產(chǎn)絮凝活性和絮凝劑產(chǎn)量較原始菌株提高10%以上 的菌株進(jìn)行10代傳代培養(yǎng)，以檢測其產(chǎn)絮凝活性和絮凝劑產(chǎn)量的穩(wěn)定性。經(jīng)篩選并傳代試 驗(yàn)，獲得1株產(chǎn)絮凝活性為93. 27%、絮凝劑產(chǎn)量達(dá)7. 025g · Γ1并穩(wěn)定的菌株，較原始菌株 產(chǎn)絮凝活性提高13. 37%，絮凝劑產(chǎn)量提高19. 53%，編為Bacillus sp. WZY01。
[0134] Bacillus sp. WZYOl已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心， 其保藏中心登記入冊編號為CGMCC NO. 9143,保藏起始日期為2014年05月12日。
[0135] 實(shí)施例3
[0136] 產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基培養(yǎng)Bacillus sp. WZYOl產(chǎn)絮凝劑
[0137] 將保藏菌株Bacillus sp. WZYOl接種于裝有100ml LB培養(yǎng)基的500ml錐形瓶中， 于40°C、160rpm下培養(yǎng)24h。然后按5%的體積比分別接種于裝有IOOml產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基 的500ml錐形瓶中，分別于30、351：、401：、451：和501：下培養(yǎng)7211，搖床轉(zhuǎn)速均為160印111。 培養(yǎng)結(jié)束后將發(fā)酵液在SOOOrpm下離心IOmin后得上清液，測定上清液的絮凝活性。剩余 上清液中加3-4倍體積的預(yù)冷乙醇，4°C下放置過夜，IOOOOrpm離心IOmin得沉淀，用乙醇洗 滌沉淀2次后真空干燥得絮凝劑粗品，稱重，計(jì)算絮凝劑產(chǎn)量，結(jié)果如表1所示。
[0138] 產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基的組成：葡萄糖 20g、K2HP045g、KH2P042g、（NH 4)2SO4O. 2g、NaCl 0· lg、尿素 0· 5g、酵母膏 0· 5g、MgS040. 2g、H20 1000ml、pH7. 5。
[0139] 由表I看出，Bacillus sp. WZYOl在產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基中產(chǎn)絮凝活性的適宜溫度為 35-45°C，最適宜溫度為40°C。
[0140] 表1不同溫度下Bacillus sp. WZYOl產(chǎn)絮活性比較
[0141]

【權(quán)利要求】
1. 一株芽孢桿菌（Bacillus sp.)，其保藏編號為CGMCC NO. 9143。
2. 如權(quán)利要求1所述的芽孢桿菌Bacillus sp.的用途，其特征在于，用于制備絮凝劑。
3. -種絮凝劑的制備方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟： (a)將保藏編號為CGMCC NO. 9143的芽孢桿菌接種于LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)18-24h得到一 級種子液； 任選地（b)將步驟（a)得到的一級種子液在種子培養(yǎng)基中培養(yǎng)18-24h得到二級種子 液； 以及（c)將步驟（a)得到的一級種子液或步驟（b)得到的二級種子液接種于發(fā)酵培養(yǎng) 基中培養(yǎng)得到所述絮凝劑。
4. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（a)中于35-45 °C、 150-180rpm的條件下培養(yǎng)；和/或 所述步驟（b)中于35-45°C、通氣量5-10L/min、攪拌速度350-450rpm的條件下培養(yǎng)； 和/或 所述步驟（c)中于35-45°C的條件下培養(yǎng)。
5.如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養(yǎng)基為廢水培養(yǎng)基，pH為 7-9,包含以下組分： 豆制品廢水和/或味精廢水 500-800ml ? I71 ; 水 200-500ml ? I71， 其中，所述廢水培養(yǎng)基包含制品廢水和味精廢水時(shí)，所述制品廢水的含量為 250-500ml ? I/1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml ? L'
6. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為產(chǎn)絮凝劑培養(yǎng)基或 廢水培養(yǎng)基， 所述廢水培養(yǎng)基的PH為7-9,包含以下組分： 豆制品廢水和/或味精廢水 500-800ml ? T1 ; 水 ZOO-SOOml*!/1, 其中，所述廢水培養(yǎng)基包含制品廢水和味精廢水時(shí)，所述制品廢水的含量為 250-500ml ? I/1 ;所述味精廢水的含量為150-400ml ? L'
7. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述步驟（c)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期， 流加5-15g ? I71的葡萄糖；和/或 所述步驟（c)中，在培養(yǎng)至對數(shù)期末期，氧飽和度維持在15-95%。
8. 如權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述制備方法還包括采用乙醇沉淀出 所述絮凝劑的步驟。
9. 一種絮凝劑，其特征在于，采用權(quán)利要求3-9任一項(xiàng)所述的方法制備獲得。
10. 如權(quán)利要求9所述的絮凝劑的用途，其特征在于，所述絮凝劑用于： (i) 制備改善濃縮污泥脫水性能的促進(jìn)劑；或 (ii) 去除米氏凱倫藻；或 (iii) 去除塔馬亞歷山大藻。
【文檔編號】C12P1/04GK104312943SQ201410494871
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】董新姣, 周茂洪, 葛世玫 申請人:溫州大學(xué)