一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子，所述的標(biāo)記分子為Npr3、Ucma和Ogn；本發(fā)明提供的細(xì)胞標(biāo)記分子在小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞中是特異性表達(dá)的，來自小鼠耳蝸基底膜，通過Phalanx小鼠基因表達(dá)譜的檢測(cè)，表明Npr3、Ucma和Ogn三種基因具有顯著的高水平表達(dá)，所述細(xì)胞標(biāo)記分子可應(yīng)用于小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的鑒定及小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的分選和純化依據(jù)，可應(yīng)用于內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)耳祖細(xì)胞分選以及純化研究。
【專利說明】-種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子及應(yīng)用 (一）

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種內(nèi)耳祖細(xì)胞鑒定，特別涉及一種組合式細(xì)胞標(biāo)志分子鑒定小鼠內(nèi) 耳祖細(xì)胞的新型方法，該標(biāo)記分子能特異性地鑒定分離和培養(yǎng)的內(nèi)耳祖細(xì)胞。 (二）

【背景技術(shù)】
[0002] 哺乳動(dòng)物內(nèi)耳的前庭和耳蝸中存在內(nèi)耳干細(xì)胞，內(nèi)耳干細(xì)胞具有自我更新和多分 化多潛能性，可以分化為感覺前體細(xì)胞、神經(jīng)前體細(xì)胞以及非感覺前體細(xì)胞等三種不同類 型的細(xì)胞。感覺前體細(xì)胞又稱為內(nèi)耳祖細(xì)胞。
[0003] 內(nèi)耳干細(xì)胞在特定的分化條件下可以分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞，內(nèi)耳祖細(xì)胞可以在不同 的誘導(dǎo)條件下進(jìn)一步分化產(chǎn)生不同類型的細(xì)胞，包括毛細(xì)胞、支持細(xì)胞和神經(jīng)元等。將內(nèi)耳 干細(xì)胞接種在多聚賴氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，無血清貼壁培養(yǎng)7天之后，RT-PCR和免 疫熒光檢測(cè)表明分化之后的細(xì)胞表達(dá)內(nèi)耳祖細(xì)胞相關(guān)基因和蛋白。將誘導(dǎo)分化7天之后的 祖細(xì)胞進(jìn)一步進(jìn)行誘導(dǎo)分化。至第14天時(shí)，RT-PCR和免疫熒光檢測(cè)表明誘導(dǎo)分化后有部 分細(xì)胞表達(dá)毛細(xì)胞的特異性基因和蛋白。誘導(dǎo)產(chǎn)生的毛細(xì)胞可以特異性吸收小分子染料 FM1-43,全細(xì)胞膜片鉗檢測(cè)發(fā)現(xiàn)其具有功能。內(nèi)耳祖細(xì)胞是內(nèi)耳毛細(xì)胞的前體細(xì)胞，在治療 感音性耳聾方面具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
[0004] 但是到目前為止，對(duì)內(nèi)耳祖細(xì)胞的研究依然非常稀少。這主要是由于內(nèi)耳祖細(xì)胞 的種子細(xì)胞即內(nèi)耳干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)以及純化存在一定的困難；內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分 化為祖細(xì)胞的成功率較低等原因造成的。目前用來鑒定內(nèi)耳祖細(xì)胞的基因主要包括Pax-2 及Pax-8,但是這兩種基因在內(nèi)耳干細(xì)胞和毛細(xì)胞的早期都有表達(dá)。同時(shí)這些基因還缺乏組 織特異性，它們?cè)谄渌慕M織中也有表達(dá)。因此，到目前為止還缺乏針對(duì)內(nèi)耳祖細(xì)胞的特異 性分子標(biāo)志。這對(duì)內(nèi)耳祖細(xì)胞的分離、純化以及鑒定造成了一定的困難。也是內(nèi)耳祖細(xì)胞 應(yīng)用研究方面存在的一個(gè)技術(shù)瓶頸。 (三）


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的是提供一種組合式細(xì)胞標(biāo)記分子，并采用這種組合式細(xì)胞標(biāo)記分子特 異性地鑒定小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的方法。本發(fā)明是通過分離得到小鼠內(nèi)耳耳蝸基底膜上的干細(xì) 胞，在體外進(jìn)行無血清懸浮培養(yǎng)獲得克隆的小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞。將內(nèi)耳干細(xì)胞無血清貼壁培 養(yǎng)7天，誘導(dǎo)分化形成內(nèi)耳祖細(xì)胞。提取小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的核糖核酸（RNA)進(jìn)行小鼠基因 表達(dá)譜芯片檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞基因表達(dá)譜，然后篩選特異性候選基因。最后從新生PO天 小鼠中提取出如大腦、肝臟、皮膚等10個(gè)不同組織的RNA，通過RT-PCR對(duì)候選的目的基因進(jìn) 行特異性檢測(cè)，確定小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的特異性組合式細(xì)胞標(biāo)記分子。
[0006] 本發(fā)明采用的技術(shù)方案是：
[0007] 本發(fā)明提供一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子，所述的標(biāo)記分子為Npr3(核苷 酸序列見序列7所示）、Ucma (核苷酸序列見序列8所示）和Ogn (核苷酸序列見序列9所 示）。
[0008] 本發(fā)明還提供一種所述檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子的應(yīng)用，所述的應(yīng)用為： 從內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)7天產(chǎn)生的細(xì)胞群體中分離單細(xì)胞，提取單細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成 cDNA,以cDNA為模板，分別以Npr3正向引物和Npr3反向引物，Ucma正向引物和Ucma反向 引物，Ogn正向引物和Ogn反向引物作為三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若Npr3正向引物和Npr3 反向擴(kuò)增產(chǎn)物708bp，Ucma正向引物和Ucma反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物181bp，且Ogn正向引物和 Ogn反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物257bp，則單細(xì)胞為小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞；
[0009] Npr3 正向引物：5' -GGACGACATAGTGCGCTACA-3' ；
[0010] Npr3 反向引物：5 ' -TCTTCTAGGCCACATGATTTGC-3 ' ；
[0011] Ucma 正向引物：5，-TATGCTACAGGAGGGGACCA-3 ' ；
[0012] Ucma 反向引物：5 ' -CCTCTGTCTGTTTTCCGCATT-3 ' ；
[0013] Ogn 正向引物：5 ' -CCTGCTACTCTTCGTGCCTC-3 ' ；
[0014] Ogn 反向引物：5 ' -GGCATGTGGGCATTTCATCA-3 '。
[0015] 本發(fā)明所述內(nèi)耳祖細(xì)胞按如下步驟獲得：
[0016] (1)內(nèi)耳干細(xì)胞分離和成球培養(yǎng)
[0017] 解剖小鼠獲得小鼠耳蝸基底膜后，將基底膜胰酶消化，用移液槍吹打散后，獲得單 細(xì)胞，然后將單細(xì)胞懸浮在內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基中，在37°C、5% CO2孵育箱中懸浮培養(yǎng)5-6 天，形成內(nèi)耳干細(xì)胞球。
[0018] 本發(fā)明分離培養(yǎng)的小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Nestin、Abcg2、BMP-4及BMP-7等基 因。
[0019] (2)內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞
[0020] 用0. lmg/ml的多聚賴氨酸室溫孵育培養(yǎng)皿5分鐘,完全吸除多聚賴氨酸。用PBS 徹底清洗培養(yǎng)皿3次，每次5分鐘。將培養(yǎng)皿放入37°C孵育箱中過夜干燥。將P3代內(nèi)耳 干細(xì)胞接種在經(jīng)多聚賴氨酸預(yù)先處理好的培養(yǎng)皿中，用內(nèi)耳祖細(xì)胞培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng)7天之 后，形成內(nèi)耳祖細(xì)胞。
[0021] 本發(fā)明分離培養(yǎng)的小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)Pax-2、Pax8、BMP-4及BMP-7等基因。
[0022] (3)基因表達(dá)譜芯片檢測(cè)基因表達(dá)譜與特異性候選基因篩選
[0023] 對(duì)分離的內(nèi)耳祖細(xì)胞RNA進(jìn)行Phalanx小鼠基因表達(dá)譜檢測(cè)（檢測(cè)單位：上海儀 方生物科技有限公司）。經(jīng)對(duì)比內(nèi)耳干細(xì)胞以及內(nèi)耳毛細(xì)胞后，對(duì)內(nèi)耳祖細(xì)胞差異表達(dá)性基 因進(jìn)行進(jìn)一步分析，從內(nèi)耳祖細(xì)胞中篩選出38個(gè)特異表達(dá)的基因。
[0024] (4)特異性組合式細(xì)胞標(biāo)記分子驗(yàn)證
[0025] 根據(jù)內(nèi)耳祖細(xì)胞篩選的38種特異表達(dá)的基因，結(jié)合比較內(nèi)耳干細(xì)胞及毛細(xì)胞中 特異表達(dá)的基因，候選Npr3、U Cma和Ogn共3種基因，對(duì)小鼠大腦、肝臟、皮膚、肺、腸、胃、腎 臟、肌肉、心臟及眼睛共10個(gè)不同的組織及器官進(jìn)行RNA提取后，聚合酶鏈反應(yīng)（PCR)檢測(cè) 這3種基因在不同組織細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)水平，驗(yàn)證出Npr3、Ucma和Ogn三種分子組合為小鼠 內(nèi)耳祖細(xì)胞最佳組合式細(xì)胞標(biāo)記分子。通過小鼠不同組織3種候選基因的分子檢測(cè)，只有 在小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞中Npr3、U Cma和Ogn這三種基因都是陽(yáng)性表達(dá)的。因此這三種基因的組 合陽(yáng)性表達(dá)可作為小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞的分子標(biāo)記。
[0026] 本發(fā)明提供的細(xì)胞標(biāo)記分子在小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞中是特異性表達(dá)的，由內(nèi)耳干細(xì)胞 誘導(dǎo)產(chǎn)生，通過Phalanx小鼠基因表達(dá)譜的檢測(cè)，表明Npr3、Ucma和Ogn三種基因具有顯著 的高水平表達(dá)，所述細(xì)胞標(biāo)記分子可應(yīng)用于小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的鑒定及小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的分 選和純化依據(jù)，亦可應(yīng)用于內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)產(chǎn)生的內(nèi)耳祖細(xì)胞分選以及純化研究。
[0027] 本發(fā)明的有益效果是：
[0028] (1)本發(fā)明篩選出小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞特異性的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子Npr3、Ucma和 Ogn0
[0029] (2)以本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子可以區(qū)分小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞與其他組織來 源的細(xì)胞。
[0030] (3)使用本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子陽(yáng)性表達(dá)可鑒定小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞，為 發(fā)展新的分離純化技術(shù)提供依據(jù)。
[0031] (4)本發(fā)明提供的組合式細(xì)胞標(biāo)記分子也可為其他物種內(nèi)耳祖細(xì)胞特異性標(biāo)記分 子研究提供參考。 (四）

【專利附圖】

【附圖說明】
[0032] 圖1小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞球顯微圖，A行為100X放大倍數(shù)下，內(nèi)耳干細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、 5天的形態(tài)，B行為250X放大倍數(shù)下，內(nèi)耳干細(xì)胞在培養(yǎng)1、3、5天的形態(tài)；C行為用DAPI 對(duì)培養(yǎng)1、3、5天的內(nèi)耳干細(xì)胞球染色后，250X放大倍數(shù)下顯微圖。
[0033] 圖2小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞顯微圖。
[0034] 圖3小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞基因表達(dá)電泳圖，泳道1為Marker，泳道2為GAPDH，泳道3 為Pax-2,泳道4為BMP-4,泳道5為BMP-7,泳道6為Pax-8。
[0035] 圖4小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞Pax-2與Pax-8雙標(biāo)激光共聚焦顯微圖，A為Pax-2抗體標(biāo) 志顯微圖，B為Pax-8抗體標(biāo)志顯微圖，C為A與B的合并圖。
[0036] 圖5候選基因在不同組織中的表達(dá)電泳圖，泳道1為大腦，泳道2為肝臟，泳道3為 皮膚，泳道4為肺，泳道5為腸，泳道6為胃，泳道7為腎臟，泳道8為肌肉，泳道9為心臟， 泳道10為眼睛，泳道11為內(nèi)耳祖細(xì)胞。
[0037] 圖6標(biāo)志分子Npr3+Ucma+0gn在不同類型細(xì)胞中的表達(dá)電泳圖，泳道1為內(nèi)耳干 細(xì)胞體外誘導(dǎo)7天產(chǎn)生的細(xì)胞檢測(cè)Npr3,泳道2為內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)7天產(chǎn)生的細(xì)胞檢 測(cè)Ucma，泳道3為內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)7天產(chǎn)生的細(xì)胞檢測(cè)Ogn，泳道4為皮膚組織檢測(cè) Npr3,泳道5皮膚組織檢測(cè)Ucma，泳道6為皮膚組織檢測(cè)Ogn，泳道7為肺組織檢測(cè)Npr3,泳 道8為肺組織檢測(cè)Ucma，泳道9為肺組織檢測(cè)Ogn。 (五）

【具體實(shí)施方式】
[0038] 下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行進(jìn)一步描述，但本發(fā)明的保護(hù)范圍并不僅限于 此：
[0039] 實(shí)施例1小鼠內(nèi)耳干細(xì)胞的分離及培養(yǎng)
[0040] 1)將ICR小鼠（浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院）在-20°c冰箱中麻醉5分鐘，浸入75%酒精 中殺菌。用手術(shù)剪將小鼠直接斷頭，去除皮毛。然后在無菌狀態(tài)下中分頭顱，去除大腦及 腦干，充分暴露位于顱底的顳骨。仔細(xì)的用剪刀和鑷子分離出顳骨，將其轉(zhuǎn)移到裝有4°C預(yù) 冷PBS (pH值為7.4)的3. 5cm培養(yǎng)皿中。顯微鏡下用鑷子在耳蝸底部鉆一個(gè)小孔，從下至 上剖開螺殼，暴露完整的蝸軸和蝸管。用鑷子夾住耳蝸管的最底部，將耳蝸管與蝸軸分離。 由此得到的耳蝸管包括螺旋韌帶、前庭膜、以及基底膜（包含Corti器）。將分離得到的耳 蝸管轉(zhuǎn)移到新鮮預(yù)冷的PBS中，進(jìn)一步將包含Corti器的基底膜與前庭膜及螺旋韌帶分離 開。將基底膜轉(zhuǎn)移到IOOuL 0.05% (w/v)的胰酶（購(gòu)自Gbico)中，37°C消化7分鐘，加入 100μ llmg/ml的大豆胰酶抑制劑（PBS緩沖液配制，購(gòu)自Gbico，pH = 7. 4)終止胰酶反應(yīng)。
[0041] 2)用量程為200 μ L的移液槍吹打步驟1)反應(yīng)物30-40次，使單細(xì)胞從基底膜中 脫落。細(xì)胞脫落后經(jīng)70 μ m的細(xì)胞篩過濾，去除較大的組織殘骸與碎片，得到幾乎沒有大細(xì) 胞聚集的單細(xì)胞懸液。然后用內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋，細(xì)胞密度為l〇 5/ml，獲得稀釋后的單 細(xì)胞懸液。內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：1% (v/v)B27(血清替代物B27)、2% (v/v)N2(血清 替代物N 2)、20ng/mL EGF(表皮生長(zhǎng)因子）、50ng/mL bFGF(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子）、 10ng/mL IGF-I (類胰島素生長(zhǎng)因子1)、50μ g/ml青霉素，溶劑為DMEM/F12(購(gòu)自Gbico)， DMEM/F12 組成為 DMEM 和 Ham's F-12, pH 值為 L 4。
[0042] 3)稀釋后的單細(xì)胞懸液經(jīng)70 μ m的細(xì)胞篩過濾，獲得單細(xì)胞懸液。
[0043] 4)取步驟3)獲得的200 μ L單細(xì)胞懸液，用2mL內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基稀釋后在37°C、 5% CO2孵育箱中懸浮培養(yǎng)1-5天，其中內(nèi)耳干細(xì)胞會(huì)形成內(nèi)耳干細(xì)胞球，其它非干細(xì)胞的 細(xì)胞由于生長(zhǎng)條件的限制而逐漸凋亡。分別取50 μ L培養(yǎng)1、3和5天的內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基 滴于玻片上，在顯微鏡下分別放大100倍（圖1中的A行）和250倍（圖1中的B行）觀 察內(nèi)耳干細(xì)胞球。同時(shí)，分別取50 μ L培養(yǎng)1、3和5天的內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)基，讓其中的內(nèi)耳 干細(xì)胞球在玻片上貼壁后，用200 μ L DAPI試劑（Roche公司）孵育細(xì)胞球1-3分鐘，進(jìn)行 DAPI染色，并放大250倍觀察內(nèi)耳干細(xì)胞球如圖1中C行所示，每一個(gè)細(xì)胞球里有幾十至數(shù) 百個(gè)細(xì)胞。
[0044] 實(shí)施例2內(nèi)耳干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為內(nèi)耳祖細(xì)胞
[0045] 1)將實(shí)施例1中培養(yǎng)5天形成的內(nèi)耳干細(xì)胞球用量程為200 μ L的移液槍吹打成 單細(xì)胞，IOOOrpm離心5分鐘后收集細(xì)胞，然后200 μ L細(xì)胞用2mL內(nèi)耳干細(xì)胞培養(yǎng)液重懸 后，37°C下培養(yǎng)5天形成P2代內(nèi)耳干細(xì)胞球。將P2代內(nèi)耳干細(xì)胞繼續(xù)傳代，獲得P3代內(nèi) 耳干細(xì)胞球。
[0046] 2)用200yL 0· lmg/ml的多聚賴氨酸（Sigma公司）37°C孵育培養(yǎng)皿5分鐘，然后 完全吸除多聚賴氨酸。用PBS漂洗培養(yǎng)皿3次，每次5分鐘。將培養(yǎng)皿放入37°C孵育箱中 干燥過夜。
[0047] 3)將P3代內(nèi)耳干細(xì)胞球以500球/ml的密度懸浮在內(nèi)耳祖細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后 接種于上述用多聚賴氨酸預(yù)處理的培養(yǎng)皿中，在37°C、5% CO2孵育箱中貼壁培養(yǎng)7天，形成 含內(nèi)耳祖細(xì)胞的培養(yǎng)液，將培養(yǎng)液IOOOrpm離心5分鐘，獲得內(nèi)耳祖細(xì)胞，如圖2。內(nèi)耳祖 細(xì)胞培養(yǎng)基組成為：1% (v/v)B27、2% (v/v)N2、50ng/mL FGF3(成纖維生長(zhǎng)因子3)、50ng/ mLFGFlO (成纖維生長(zhǎng)因子10)，溶劑為DMEM/F12 (購(gòu)自Gbico)，DMEM/F12組成為DMEM和 Ham's F-12, pH 值為 7. 4。
[0048] 實(shí)施例3內(nèi)耳祖細(xì)胞基因表達(dá)檢測(cè)
[0049] 1)內(nèi)耳祖細(xì)胞總RNA提取：將實(shí)施例2中含內(nèi)耳祖細(xì)胞的培養(yǎng)液收集在15ml離心 管中，IOOOrpm離心5分鐘棄上清；加入ImL TRIzol (TakaRa公司），置漩渦振蕩器上震蕩至 內(nèi)耳祖細(xì)胞完全溶解后，轉(zhuǎn)移至I. 5ml EP管（Axgen公司）中；加入200 μ L氯仿（國(guó)藥集 團(tuán)化學(xué)試劑有限公司），劇烈振蕩混勻，室溫放置5min ;4°C下12, OOOrpm離心15min，吸取 上層水相約300 μ L入新的I. 5ml EP管中；加入等體積的異丙醇（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限 公司），顛倒混勻，室溫靜置IOmin ;4°C下12, OOOrpm離心IOmin,棄上清；用體積濃度75% 的乙醇水溶液洗漆沉淀，4?下12, OOOrpm離心5min，棄上清；室溫干燥2-5min后，加入適 量DEPC水（Sigma公司）溶解，獲得內(nèi)耳祖細(xì)胞總RNA，用于下一步實(shí)驗(yàn)或保存于-80°C冰 箱。
[0050] 2) cDNA第一鏈合成：內(nèi)耳祖細(xì)胞總RNA用DNA酶（Sigma公司）消化處理清除殘 余的基因組DNA污染，用紫外分光光度計(jì)測(cè)定（波長(zhǎng)為260nm)RNA濃度。cDNA第一鏈合 成采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒（Fermentas公司），每個(gè)樣品取2 μ g總RNA(0. 5-1 μ L)用于第一鏈 合成。具體步驟如下：2yg總RNA(0. 5-lyL)、lyL oligo(dT)18引物和IyL隨機(jī)引物， CldH2O 補(bǔ)至總體積 12μ L，置 65°C反應(yīng) 5min ;加入 5Xbuffer 4μ UdNTP 2μ UribolockTM RNase inhibitor 1μ L 和 RevertAidTM M-MulV 反轉(zhuǎn)錄酶 Ιμ?，反應(yīng)總體積為 20 μ L， 25°C 5min - 42°C 60min - 70°C 5min。合成的 cDNA 第一鏈用于下一步 PCR 反應(yīng)。
[0051] 3) PCR反應(yīng)：將上述制備的cDNA第一鏈作為模板，分別進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，所用引 物序列見表1。PCR反應(yīng)采用PCR Mix試劑盒（上海翊圣生物技術(shù)有限公司），PCR反應(yīng)體 系為：cDNA 2yL、2mM dNTP IyLUOyM 的上下游引物各 IyLUOXbuffer(含 Mg2+)5yL 和TaqDNA聚合酶1 μ L，加 H2O補(bǔ)至總體積50 μ L。PCR程序?yàn)椋?4°C預(yù)變性5min，94°C變性 30s，53°C?62°C退火30s，72°C延伸30s，35循環(huán)，72°C延伸7min，退火溫度和循環(huán)數(shù)根據(jù) 引物的具體情況進(jìn)行選擇。反應(yīng)完成后取5 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物加1 μ L溴酚蘭指示劑（Sigma公 司），用1. 2%的瓊脂糖（Biowest公司）進(jìn)行凝膠電泳。電泳完畢后，用凝膠成像分析系統(tǒng) 觀測(cè)結(jié)果如圖3表明內(nèi)耳干細(xì)胞體外誘導(dǎo)產(chǎn)生了內(nèi)耳祖細(xì)胞。
[0052] 表1用于RT-PCR的引物序列
[0053]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子，所述的標(biāo)記分子為Npr3、Ucma和Ogn。
2. -種權(quán)利要求1所述檢測(cè)小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞的標(biāo)記分子的應(yīng)用，其特征在于所述的應(yīng) 用為：從小鼠耳蝸基底膜分離單細(xì)胞，提取單細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板， 分別以Npr3正向引物和Npr3反向引物，Ucma正向引物和Ucma反向引物，Ogn正向引物和 〇gn反向引物作為三對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，若Npr3正向引物和Npr3反向擴(kuò)增產(chǎn)物708bp， Ucma正向引物和Ucma反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物18 lbp，且Ogn正向引物和Ogn反向引物擴(kuò)增產(chǎn)物 257bp，則單細(xì)胞為小鼠內(nèi)耳祖細(xì)胞； Npr3 正向引物：5' -GGACGACATAGTGCGCTACA-3' ； Npr3 反向引物：5' -TCTTCTAGGCCACATGATTTGC-3' ； Ucma 正向引物：5, -TATGCTACAGGAGGGGACCA-3,； Ucma 反向引物：5' -CCTCTGTCTGTTTTCCGCATT-3' ； Ogn 正向引物：5' -CCTGCTACTCTTCGTGCCTC-3' ； Ogn 反向引物：5' -GGCATGTGGGCATTTCATCA-3'。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104293926SQ201410495359
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月24日
【發(fā)明者】王金福, 柳全文 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)