四翅濱藜rna結(jié)合蛋白基因克隆及其應用的制作方法
【專利摘要】四翅濱藜RNA結(jié)合蛋白基因克隆及其應用屬植物基因工程【技術(shù)領域】，一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcRbps1由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbps1的編碼基因AcRbps1的編碼序列為下列之一:1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第61-660位脫氧核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子；一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbps1的編碼基因AcRbps1；一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbps1的編碼基因AcRbps1；在本源植物四翅濱藜中通過qRT-PCR檢測，該基因在NaCl和PEG脅迫下上調(diào)表達。同時，將AcRpbs1導入釀酒酵母得到轉(zhuǎn)基因釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，進行脅迫處理，結(jié)果亦可表明AcRpbs1可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐鹽(NaCl)的能力。
【專利說明】四翅濱藜RNA結(jié)合蛋白基因克隆及其應用

【技術(shù)領域】
[0001 ] 本發(fā)明植物基因工程【技術(shù)領域】，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表達與植物抗逆（具體為鹽和干旱）相關(guān)的蛋白AcRbpsl,同時采 用實時熒光定量PCR(實時PCR，Real-Time-PCR，）的方法來研究該基因?qū)Ψ巧锩{迫NaCl 和PEG的功能。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逆境脅迫是影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。農(nóng)作物在 整個生長季節(jié)中，會受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲害等及非生物脅迫的鹽、 堿、高溫、低溫、干旱等，這些脅迫限制了植物的生長發(fā)育，最終會導致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì) 下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴重影響作物生產(chǎn)的逆境因子中，極端溫度、 干旱、高鹽、營養(yǎng)失調(diào)（包括礦物質(zhì)中毒和礦物質(zhì)缺乏）是影響作物產(chǎn)量的主要限制因子， 每年直接從鹽、堿、干旱、低溫脅迫等逆境造成的農(nóng)作物減產(chǎn)仍然超過總產(chǎn)量的20%，而干 旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關(guān)的基因并將其導入作物進 行分子育種引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過基因工程的方法進行逆境相關(guān)基因的克 隆及其功能的解析能夠為植物抗逆育種提供有價值的信息和材料。然而，從直接解決農(nóng)業(yè) 生產(chǎn)中關(guān)鍵問題的角度來看，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上能起顯著作用的轉(zhuǎn)基因作物種類還不多，人類 對植物逆境適應性分子機理的研究還遠遠不夠，遠不能滿足植物分子育種的需求，同世界 發(fā)達國家相比，我國擁有自主知識產(chǎn)權(quán)和具有重要利用價值的基因相對較少。同時，目前的 研究也主要集中在草本植物，而對木本植物及其耐鹽和干旱的分子遺傳研究也相對較少。 然而，草本和木本植物在結(jié)構(gòu)、生長、發(fā)育、生理、及在應對生物和非生物脅迫等方面存在較 大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關(guān)的基因并進行研究，能夠為通過基因工程提 高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。
[0003] 四翅濱藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類上為藜科， 濱藜屬，普遍存在于干旱、半干旱地區(qū)，具有較強的耐干旱、抗鹽堿、耐寒冷和耐重金屬的特 性，尤其是耐干旱和鹽特性。四翅濱藜在每年降雨量> 180_的干旱半干旱地區(qū)，年平均氣 溫僅為5°C左右的低溫地區(qū)，甚至在極端低溫為-40°C地區(qū)以及鹽堿地等惡劣環(huán)境下依然 生長良好，同時在海拔2000米左右的地區(qū)也適合生長，根據(jù)已有報道，四翅濱藜被有些國 家稱為"生物脫鹽器"，它一年時間就可以從6. 07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽分，灌木 生物量也能達到15t/hm2,枝葉中的粗蛋白含量在12%以上，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、富含營養(yǎng)，相關(guān)科學 家們認為，四翅濱藜有及其豐富的營養(yǎng)價值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、半荒漠干 旱地區(qū)非常有價值的優(yōu)良飼料灌木樹種。同時，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因此在美國 也廣泛用于水土保持和路坡固定，但牧場改良仍然是其主要用途。近年來，四翅濱藜先后在 中國的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過大量研究，充分體現(xiàn)了四翅濱藜較強的 抗鹽，堿，干旱，低溫，貧瘠等優(yōu)良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優(yōu)良樹種。
[0004] 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系統(tǒng)，是二倍體，它在 蛋白翻譯后加工過程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白折疊等特征，使得其基因表達 模式更加接近于真核植物中的表達模式，它還具有生長快速、遺傳操作簡便和易于培養(yǎng)等 的優(yōu)點，所以在對植物功能基因的相關(guān)研究中，用酵母表達系統(tǒng)篩選具有原核表達系統(tǒng)不 可替代的優(yōu)勢性。釀酒酵母菌株INVScl (基因型為MATa his3Dl leu2 trpl-289 ura3-52) 是經(jīng)過人工改造后的尿嘧啶營養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株的酵母轉(zhuǎn)化子運用SC-U缺培養(yǎng)基篩 選時，假陽性低，轉(zhuǎn)化效率高，因此是理想的酵母表達菌株。利用酵母營養(yǎng)缺陷型菌株對植 物cDNA文庫的研究和挖掘，在植物中受到越來越多關(guān)注。Frommer等和Hsu等（1993年） 在篩選擬南芥cDNA文庫中克隆到氨基酸透過酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補酵母 的氨基酸轉(zhuǎn)運缺陷突變體；酵母系統(tǒng)研究植物耐鹽性表達基因的功能研究也被廣泛應用， Yamada等（2002年）就利用酵母轉(zhuǎn)化子來驗證丙二烯環(huán)化氧化酶（AOC)基因可以大大提 高抗鹽性，進一步推測到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等（2007年）利 用酵母研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測 SALI3-2基因所具有的抗逆能力。由此可見，利用酵母表達外源蛋白并研究其功能已經(jīng)受到 廣泛應用。
[0005] Real-Time PCR(RT-PCR)是一種目前應用普遍的檢測基因表達的技術(shù)，它通過 添加熒光基團，并利用熒光信號累積來實時監(jiān)測整個PCR的進程，最后通過標準曲線對未 知模板進行定量分析，該方法能夠避免傳統(tǒng)PCR定量終產(chǎn)物時產(chǎn)生的偏差，從而使實驗的 重復性得到提高，該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛用于監(jiān)測細胞mRNA的表達量變化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，該法靈敏度高，通用性好，方法簡單等優(yōu)點而被國內(nèi)外科 研中普遍使用。
[0006] 在真核生物中，基因表達的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)是一個非常復雜和關(guān)鍵的步驟，它包括多 個過程，如pre-mRNA的剪切、編輯、運輸、穩(wěn)定性保持和降解、翻譯。RNA結(jié)合蛋白（RNA binding proteins, Rbps)是一類對生長、發(fā)育、抗逆性至關(guān)重要的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控關(guān)鍵蛋白，它 通過與RNA相互作用形成核糖核蛋白復合體，直接或間接地參與了這些過程。RNA結(jié)合蛋白 具有保守的基序，如RNA識別基序、富含甘氨酸基序、富含精氨酸基序、RGG盒（RGG-box)、鋅 指結(jié)構(gòu)基序、KH基序、雙鏈RNA結(jié)合基序等。目前的研究，較為清楚的RNA結(jié)合蛋白基序是 RNA識別基序（RNA-recognition motif，RRM)，也被稱作RNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（RBD)或核糖體蛋 白結(jié)構(gòu)域（RNP)，因為它總是和pre-mRNA和和不均一 RNAs結(jié)合形成蛋白復合物，因此，RRM 基序在1988年由Dreyfuss等發(fā)現(xiàn)。Maris等（2005)研究發(fā)現(xiàn)，RRM大約有90個氨基酸， 含有兩段保守的肽段，分別為RNPl和RNP2,它們是RNA結(jié)合活性所必需的。唐蜻（2010)研 究表明，植物的RNA結(jié)合蛋白通常具有多個功能，不僅調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)與RNA的相互作用，也調(diào) 節(jié)蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)之間的作用。由于缺少體外研究轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的系統(tǒng)，植物中對RNA結(jié)合 蛋白的研究相對較少，其在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控中作用的研究也比較落后，Leemo等（2009)研 究發(fā)現(xiàn)擬南芥基因組可能編碼超過200個的RNA結(jié)合蛋白，但是僅有極少的RNA結(jié)合蛋白 的作用被證實。根據(jù)目前的研究發(fā)現(xiàn)，RNA結(jié)合蛋白參與光合作用的調(diào)控、抗逆反應的調(diào)節(jié)、 開花調(diào)控、激素信號傳導調(diào)節(jié)等多個生理生化過程。而RNA結(jié)合蛋白基因在多抗鹽生灌木 四翅濱藜中的相關(guān)功能并無相關(guān)報道，因此對于四翅濱藜RNA結(jié)合蛋白的抗逆研究（生物 脅迫和非生物脅迫）具有重要的研究價值和前景。然而在目前的眾多研究中，還無有關(guān)四 翅濱藜AcRbpsl基因在抗逆等生理功能方面的研究報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過構(gòu)建四翅濱藜（Atriplexcanescens)的低溫（-10 °C )及鹽脅迫 (400mM NaCl)全長cDNA文庫，并利用Gateway技術(shù)將cDNA文庫LR重組到酵母表達載 體（PYES-DEST52)中，混合質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株INVScl中，并通過模擬逆境脅迫 (NaCl、山梨醇）篩選出與逆境脅迫相關(guān)的基因，同時利用RT-PCR技術(shù)檢測該基因在逆境 脅迫（NaCl，PEG6000)條件下的表達量變化，以初步研究該基因在四翅濱藜中逆境脅迫 的相應作用。本發(fā)明不僅對四翅濱藜的耐干旱和耐鹽分子機制的研究提供新的依據(jù)，同 時為獲得具有抗逆能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木（耐鹽、干旱）奠定基礎。本發(fā)明中，轉(zhuǎn) PYES-AcRbpsl的重組酵母轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出了明顯的抗干旱和抗鹽脅迫的能力。同時在本源植 物四翅濱藜中，AcRbpsl基因的表達也對鹽脅迫和旱脅迫表現(xiàn)出了明顯的響應。
[0008] 本發(fā)明提供了四翅濱藜中一種含Rbps功能域的與植物抗逆（鹽和旱）相關(guān)的蛋 白及其編碼基因序列，通過利用酵母系統(tǒng)進行功能驗證，并在本源植物中通過RT-PCR檢測 的方法對該基因進行進一步解析及其在植物抗逆中的應用：
[0009] 本發(fā)明提供的RNA結(jié)合蛋白基因，名稱為AcRbpsl，為序列表中SEQ ID NO :1所示 的核苷酸序列。通過四翅濱藜全長cDNA文庫測序得到AcRbpsl基因。該基因共由980個 堿基組成，完整的開放閱讀框含有597bp，同時還含有5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū)序列，開放 閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為TGA。
[0010] 本發(fā)明所提供的蛋白耐干旱和鹽脅迫，名稱為AcRbpsl，來源于鹽生灌木四翅濱 藜，植物抗逆相關(guān)蛋白AcRbpsl由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)。
[0011] 所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl的編碼基因 AcRbpsl的編碼序列為下列之一：
[0012] 1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第61-660位脫氧核苷 酸；
[0013] 2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
[0014] 一種重組表達載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl的編碼基因 AcRbpsl。
[0015] 一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl的編碼基因 AcRbpsl。
[0016] 序列表中的序列2共由200個氨基酸殘基所組成，根據(jù)DNAMN分析，蛋白等電點 5. 82,蛋白總量23. lKDa。一般情況下，蛋白二級結(jié)構(gòu)含100個卷曲，46個螺旋，54個折疊， 有9個抗原肽段，賴氨酸（Lys)、谷氨酸（Glu)含量分別為12.04^^10.5?^蛋白含112個 親水氨基酸，88個疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob. /Kyte & Doolittle分析 到球蛋白可能的表面區(qū)域在中部偏C端。PSORT Prediction預測蛋白定位可能性為細胞 質(zhì)。
[0017] 本發(fā)明涉及的酵母表達載體pYES_DEST52(購自Invitrogen公司）與AcRbpsl 基因重組為pYES-AcRbpsl，且該重組酵母表達載體轉(zhuǎn)化的宿主感受態(tài)細胞為釀酒酵母 INVScl。該酵母表達載體除了含有AcRbpsl的編碼DNA序列外，還攜帶有GALl啟動子、T7 啟動子、URA3基因、氨芐青霉素抗性標記基因、CYCl終止轉(zhuǎn)錄信號、LR重組位點attRl和 attR2、用于逆向篩選的致死基因 ccdB，蛋白純化的6xHis Tag,蛋白表達檢測的V5epitope 等外源基因蛋白在酵母中高效表達所需的各種調(diào)控元件。
[0018] 本發(fā)明通過RT-PCR方法檢測了該基因在對于干旱和鹽脅迫的響應（PEG，NaCl處 理），基因在兩種脅迫處理下表現(xiàn)出了基因上調(diào)，進一步推測該基因在植物參與逆境響應尤 其是干旱和鹽脅迫中起重要作用，該基因的上調(diào)表達有助于提高四翅濱藜的抗干旱和抗鹽 的能力。
[0019] 本發(fā)明在通過酵母（NaCl，山梨醇）及RT-PCR(NaCl，PEG)關(guān)于干旱和鹽的研究后， 結(jié)果表明AcRbpsl基因在逆境方面的應用：該基因過量表達可能提高植物的抗逆性，所述 植物抗逆性具體可為對非生物脅迫和生物脅迫的抗逆性，非生物脅迫如干旱、極端溫度、鹽 堿等，特別是植物的抗干旱和鹽脅迫的能力。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1為四翅濱藜總RNA提取圖片
[0021] 圖 2 為 IKb Plus DNA Ladder
[0022] 圖3為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0023] 圖4為為cDNA文庫插入片段長度PCR檢測圖片
[0024] 圖 5 為 IKb Plus DNA Ladder
[0025] 圖6為pYES-AcRbps 1重組質(zhì)粒PCR擴增凝膠電泳圖
[0026] M :DL2000 DNAMarker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :擴增 片段
[0027] 圖7為AcRbpsl在NCBI中功能域比對分析結(jié)果
[0028] 圖8為AcRbpsl與其它物種的同源蛋白系統(tǒng)進化分析
[0029] 圖9為pYES-AcRbps 1陽性重組酵母轉(zhuǎn)化子PCR凝膠電泳圖
[0030] M :DL2000 DNAMarker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :陽性 酵母轉(zhuǎn)化子PCR電泳鑒定
[0031] 圖10為重組酵母pYES-AcRbpsl和pYES-DEST52非脅迫下的結(jié)果
[0032] 圖11為重組酵母pYES-AcRbpsl和pYES-DEST52在3M山梨醇脅迫下的結(jié)果
[0033] 圖12為重組酵母pYES-AcRbpsl和pYES-DEST52在2M NaCl脅迫下的結(jié)果
[0034] 圖10-12中：pYES-AcRbpsl酵母轉(zhuǎn)化在對2M NaCl和3M山梨醇的抗逆能力明顯 強于空載體PYES-DEST52酵母轉(zhuǎn)化子。
[0035] 圖13為AcRbpsl基因在400mM NaCl脅迫處理后的表達量變化圖
[0036] 圖14為AcRbpsl基因在20% PEG6000脅迫處理后的表達量變化圖
[0037] 圖13和14中：AcRbpsl基因在NaCl處理12h后開始上調(diào)表達；同時，在PEG處理 6h后該基因開始上調(diào)表達。

【具體實施方式】
[0038] 實施例一：AcRbpsl基因全長cDNA的獲得及序列分析
[0039] 1.脅迫處理四翅濱藜：
[0040] -KTC條件下生長三個月的四翅濱藜植株移栽到人工氣候培養(yǎng)箱，正常培養(yǎng)10天 后，待植株復蘇存活，發(fā)出新葉，生長健壯。將植株轉(zhuǎn)移到含有營養(yǎng)的水培條件下，正常生長 兩天后，用500mL的含NaCl 400mM的鹽液水培處理四翅濱藜植株，脅迫處理4天后，采摘葉 片，嫩莖部和幼根清洗干凈并液氮速凍，_80°C凍存，以備建庫。
[0041] 2.構(gòu)建 cDNA 文庫：
[0042] 將NaCl處理4天后的四翅濱藜樣品（葉片、嫩莖和幼根）提取總RNA (圖1、圖2)， 然后使用Invitrogen公司的'cap antibody module'將含有完整帽子結(jié)構(gòu)的單鏈cDNA進 行富集，并按照Superscript K Full-Length cDNA Library Construction Kit 試劑盒構(gòu)建 全長cDNA文庫，并通過Gateway技術(shù)將該cDNA文庫LR重組到酵母表達載體pYES-DEST52 中，隨機對cDNA文庫進行PCR檢測（圖3、圖4、圖5)，將長度500bp以上的片段進行測序， 利用NCBI的BlastX進行功能域的比對及相關(guān)生物信息學分析，獲得了四翅濱藜鹽脅迫的 表達序列標簽（ESTs)。
[0043] 2. 1四翅濱藜總RNA提取的方法：
[0044] 2. I. 1取IOOmg植物樣品，在預冷的研缽中用液氮迅速研成粉末，快速轉(zhuǎn)移到遇 冷的2mL離心管中。（保證全過程在通風廚中，防止RNA降解。）
[0045] 2. 1. 2加入ImlTrizol試劑，劇烈振蕩混勻15s，靜置IOmin充分裂解細胞。
[0046] 2. L 3加入0· 2mL氯仿（三氯甲烷），迅速震蕩混勻15s，靜置5min。
[0047] 2. 1. 4 高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 15min。
[0048] 2. I. 5將上清小心轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL離心管，加0. 5mL異丙醇，顛倒混勻，靜置 IOmin0
[0049] 2. 1. 6 再次高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 10min。
[0050] 2. 1. 7去除上清，加0. 5mL75%的乙醇，7, 500rpm低溫離心5min以洗漆沉淀。
[0051] 2. 1. 8重復步驟2. 1. 7 -次，進一步洗漆沉淀，去除離子。
[0052] 2. 1. 9小心吸取上清，并通風廚中干燥RNA沉淀，并用50 μ L的DEPC水溶解RNA。
[0053] 3.篩選AcRbpsl基因片段的克隆：
[0054] 根據(jù)測序分析，獲得四翅濱藜ESTs，從中獲得了一個編碼Rbps的cDNA全序列 AcRbpsl，將LR重組得到的酵母表達載體pYES-AcRbpsl轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細胞中 (DH5 α )，過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，并于LB (含100mg/L的Amp)液體培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，通過 質(zhì)粒提取試劑盒（鼎國公司）提取質(zhì)粒。并根據(jù)載體上的通用序列PCR引物，并進行質(zhì)粒 PCR擴增驗證，以鑒定獲得的cDNA序列。
[0055] 上游（T7) :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[0056] 下游（R) :5, -AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3，
[0057] PCR 反應體系（25 μ L) :Buffer2· 5 μ L、上下游引物（T7、R)各 0· 5 μ L、Tag 酶 0· 5 μ UdNTPO. 5 μ L、模板 0· 2 μ L、ddH2020. 8 μ L。PCR 反應的條件：在 94°C預變性 5 分鐘； 94 °C變性30秒；迅速冷卻至58 °C退火30秒；72 °C延伸2分鐘，30個循環(huán)；72 °C延伸10分 鐘；4°C冷卻保存。擴增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳檢測，在大約980bp的位置上有特異 性的目的條帶（圖6)。
[0058] 實施例二：AcRbpsl基因的序列分析
[0059] 經(jīng)測序分析后，AcRbps 1基因的全長cDNA序列包含980bp的開放閱讀框，根據(jù) DNAMN分析，蛋白由200個氨基酸組成，等電點5. 82,蛋白總量23. lKDa。一般情況下，蛋白 二級結(jié)構(gòu)含100個卷曲，46個螺旋，54個折疊，有9個抗原肽段，賴氨酸（Lys)、谷氨酸（Glu) 含量分別為12.04^^10.5?^蛋白含112個親水氨基酸，88個疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob./Kyte & Doolittle分析到球蛋白可能的表面區(qū)域在中部偏C端。 PSORT Prediction預測蛋白定位可能性為細胞質(zhì)，這是Rbps家族蛋白的主要特征。通過分 析表明，獲得了 AcRbpsl基因的全長cDNA序列，并且在GenBank上的登錄號為KJ027088。
[0060]利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對該編 碼基因進行保守區(qū)域分析（圖7)，該基因編碼的蛋白屬于Rbps家族蛋白。通過NCBI對 AcRbpsl基因編碼的氨基酸序列進行BLASTX，通過與已確定功能的其它物種的氨基酸序列 進行同源性分析和系統(tǒng)進化分析，利用MEGA4軟件進行進化樹分析，結(jié)果表明：AcRbpsl與 巨桉和桃樹等中的Rbps編碼的氨基酸進化關(guān)系較近，而與玉米Rbps親緣關(guān)系較遠。（圖 8)。
[0061] 實施例三：重組酵母的轉(zhuǎn)化及檢測
[0062] 釀酒酵母菌株INVScl為尿氨酸營養(yǎng)缺陷型（UraO的模式菌株，在缺乏尿氨酸 的酵母基本培養(yǎng)基（SC-UraO上，該酵母菌株幾乎不能生長和繁殖。而酵母表達載體 (PYES2-DEST52)上含有URA3基因，且該基因的表達可以使酵母轉(zhuǎn)化子在SC-Ura-培養(yǎng)基 上正常生長。因此，SC-Urf選擇培養(yǎng)基可以進行陽性和非陽性酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。通過醋 酸鋰法將載體質(zhì)粒PYES-AcRbps和pYES-DEST52分別轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)菌株INVScl中，將 轉(zhuǎn)化酵母菌液涂在SC-Ura-固體選擇培養(yǎng)基上，以未轉(zhuǎn)化的酵母做對照，進行培養(yǎng)，2d后除 了空酵母完全不長外，轉(zhuǎn)化兩種質(zhì)粒的酵母均可以生長并有菌落長出，說明酵母轉(zhuǎn)化成功， 挑取酵母單菌落，過夜培養(yǎng)后進行破除細胞壁，并通過菌液PCR方法進行陽性轉(zhuǎn)化子的進 一步鑒定。
[0063] 1.運用醋酸鋰化學轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl，其具體轉(zhuǎn)化步驟：
[0064] I. 1將一個酵母菌株單克?。↖NVScI)加入到IOmLYH)液體培養(yǎng)基中，30°C過夜搖 培。
[0065] 1. 2檢測酵母菌液的OD6c?值，利用50mL YH)液體培養(yǎng)基將過夜培養(yǎng)的酵母菌液 稀釋至OD6tltl為0· 4, 30°C繼續(xù)搖培2-4h。
[0066] 1. 3低溫離心（4°C，2500rpm) 5min后，去除上清收集菌體，用40mL IxTE緩沖液重 懸菌體。
[0067] L 4 再次低溫離心（4°C，2500rpm)5min 后，收集菌體，用 2mL lxLiAc/0. 5xTE 緩沖 液重懸菌體。
[0068] 1. 5將獲得的重懸菌體按照每管100 μ L的體系分裝到I. 5mL離心管。
[0069] 1. 6將分裝的酵母細胞置于室溫孵育lOmin。
[0070] 1. 7在每個轉(zhuǎn)化體系（100 μ L)中，加入1 μ g質(zhì)粒DNA，100 μ g變性鮭魚精DNA，混 勻。
[0071] l·8每個體系中加入 700μLlxLiAc/40%PEG-3350/lxTE，混勻。
[0072] I. 9 30°C孵育步驟1. 8中的混合液30min。
[0073] 1. 10在每個體系中再加入88μ L的DMS0,混勻后，42°C條件下水浴熱擊7min。
[0074] I. 11 5000rpm低溫離心lmin，去除上清。
[0075] 1. 12用備好的ImLlxTE的緩沖液重懸菌體，5000rpm低溫離心Imin,進一步去除 上清。
[0076] 1. 13用IOOyL IxTE的緩沖液將菌體重懸，并涂于酵母選擇培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 24h。
[0077] 2.陽性轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0078] 從酵母選擇培養(yǎng)基上隨機挑取5個酵母轉(zhuǎn)化子（pYES2-AcRbps)的單菌落，30°C振 蕩培養(yǎng)過夜（200rpm)，收集過夜培養(yǎng)菌體，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎細胞， 重復幾次，以細胞破碎液離心濃縮樣品作為模板進行菌液PCR，以引物T7和R進行PCR擴 增，PCR 反應體系為（25μ L) :Buffer2. 5μ L、上下游引物（T7、R)各 0. 5μ UTag 酶 0. 5μ L、 dNTPO. 5 μ L、模板 5 μ L、ddH20 15. 5 μ L。
[0079] PCR產(chǎn)物在I %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測，擴增片段大小為980bp，與目標長度吻 合（圖9)。證明重組質(zhì)粒pYES2-AcRbps已經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株中。
[0080] 實施例四：陽性轉(zhuǎn)化酵母逆境脅迫處理
[0081] L逆境脅迫處理前準備
[0082] 取適量陽性酵母轉(zhuǎn)化子（pYES-DEST52，pYES2-ACRbps)菌液，接種到含2%葡萄糖 的SC-U液體培養(yǎng)基中，30°C條件下200rpm振蕩培養(yǎng)24h，測OD 6c?值，并用SC-U液體培養(yǎng)基 (2%葡萄糖）將菌液OD6tltl統(tǒng)一調(diào)整為0. 4,總體積5mL，8 OOOrpm離心lmin，吸取上清液， 力口 2mL含2%半乳糖的酵母誘導培養(yǎng)基重懸菌體，以1:50的比例接到5mL的誘導培養(yǎng)基中 擴大培養(yǎng)，30°C振蕩培養(yǎng) 24h，檢測酵母 INVScl (pYES-DEST52)和 INVScl (pYES2-AcRbps)的 0D_值，并統(tǒng)一調(diào)整到0D_值為2,備用。對這兩種酵母轉(zhuǎn)化子進行不同的非生物脅迫處 理，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化子抗鹽和干旱脅迫能力，實驗重復3次。
[0083] 2.模擬逆境脅迫處理
[0084] 存在于自然界中的植物面對各種生物和非生物逆境，非生物脅迫中最主要的是鹽 脅迫（NaCl、KCl等）和干旱脅迫。
[0085] 在實驗室條件下進行鹽和干旱的模擬，用2M NaCl模擬鹽脅迫，3M的山梨醇模擬 干旱脅迫。運用以上兩種模擬條件處理酵母轉(zhuǎn)化子，通過酵母的生長情況對比，從而評價該 基因在酵母中誘導表達后對酵母抗逆性的影響，以對該基因在酵母中的抗逆功能進行初探 (圖 10、圖 11、圖 12)。
[0086] 2. INaCl處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、10000倍的菌 體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天后，比較兩種酵 母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長狀態(tài)。
[0087] 2. 23M山梨醇干旱模擬處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、 10000倍的菌體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天 后，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長狀態(tài)。
[0088] 實施例五：AcRbps基因在四翅濱藜PEG和NaCl脅迫下的應答
[0089] 1.四翅濱藜脅迫處理：
[0090] 將四翅濱藜種子種在營養(yǎng)土中正常條件生長50天后，選取生長良好的四翅濱藜 轉(zhuǎn)移到MS營養(yǎng)液中進行水培，每天更換營養(yǎng)液，水培3天待四翅濱藜生長健壯后，分別用 400mM NaCl和20% PEG6000處理，并在0、6、12、24、48h后取根莖葉，液氮速凍，-80°C保存。
[0091] 2. RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：
[0092] 采用Trizol法提取總RNA (如實施例一，2. 1)，利用Takara公司的PrimeScriptK RT reagent KitWith gDNA Eraser(Perfect Real Time)試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄以制備cDNA，用于 quantity Real-time PCR 分析。
[0093] 3.熒光定量PCR分析：
[0094] 利用SYBR?彳GreenReagent試劑盒，使用7500熒光定量系統(tǒng)檢測AcRbps基因 (F: CACCTCAGGTTAATGATGCGG ;R:GGCACACTTCCCAACGTAGT)在不同處理下隨時間變化的表達 量差異。真核延伸生長因子（EFl-α)作為內(nèi)參基因（F:5' -CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3' ； R5' -TGGTGGGAACCATCTTCACG-3'）。反應條件為：95°C預變性 30 秒；95°C變性 5 秒，60°C退 火延伸34秒，進行40個循環(huán)；95°C變性15秒，60°C退火延伸1分鐘，95°C變性15秒；60°C 延伸15秒。采用Ct法分析表達量差異（圖13、圖14)。
【權(quán)利要求】
1. 一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcRbpsl，其特征在于由序列表中SEQ ID N0:2所示的氨基 酸序列組成的蛋白質(zhì)。
2. 按權(quán)利要求1所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl的編碼基因AcRbpsl，其特征在于 所述編碼基因AcRbpsl的編碼序列為下列之一： 1) 編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第61-660位脫氧核苷酸； 2) 編碼序列表中SEQ ID N0:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
3. -種重組表達載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl 的編碼基因AcRbpsl。
4. 一種重組菌，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcRbpsl的編碼 基因 AcRbpsl。
【文檔編號】C12N15/29GK104371014SQ201410497308
【公開日】2015年2月25日 申請日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】潘洪玉, 孫新華, 李敬濤, 余剛, 張祥輝, 賈承國, 劉金亮 申請人:吉林大學