四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用的制作方法
【專(zhuān)利摘要】四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用屬植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3，由序列表中SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3的編碼序列為下列之一:1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO:1的5’端第346-684位脫氧核苷酸；2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子；一種重組表達(dá)載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3；一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3；在本源植物四翅濱藜中通過(guò)qRT-PCR檢測(cè)，該基因在NaCl和PEG脅迫下上調(diào)表達(dá)。同時(shí)，將AcGSK3導(dǎo)入釀酒酵母得到轉(zhuǎn)基因釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae，進(jìn)行脅迫處理，結(jié)果亦可表明AcGSK3可以提升酵母耐干旱(山梨醇)和耐鹽(NaCl)的能力。
【專(zhuān)利說(shuō)明】四翅濱藜糖原合成酶激酶3基因克隆及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001 ] 本發(fā)明屬植物基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及使用釀酒酵母Saccharomyces cerevisiae INVScl菌株表達(dá)與植物抗逆（具體為鹽和干旱）相關(guān)的蛋白AcGSK3,同時(shí)采 用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(實(shí)時(shí)PCR，Real-Time-PCR，）的方法來(lái)研究該基因?qū)Ψ巧锩{迫NaCl 和PEG的功能。

【背景技術(shù)】
[0002] 目前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中逆境脅迫是影響糧食產(chǎn)量最重要的因素和挑戰(zhàn)之一。農(nóng)作物在整 個(gè)生長(zhǎng)季節(jié)中，會(huì)受到各種逆境因素的影響，如生物脅迫的病蟲(chóng)害等，及非生物脅迫的鹽、 堿、高溫、低溫、干旱等，這些脅迫限制了植物的生長(zhǎng)發(fā)育，最終會(huì)導(dǎo)致作物產(chǎn)量降低，品質(zhì) 下降，直接影響甚至威脅到糧食安全，在這些嚴(yán)重影響作物生產(chǎn)的逆境因子中，極端溫度、 干旱、高鹽、營(yíng)養(yǎng)失調(diào)（包括礦物質(zhì)中毒和礦物質(zhì)缺乏）是影響作物產(chǎn)量的主要限制因子， 每年直接從鹽、堿、干旱、低溫脅迫等逆境造成的農(nóng)作物減產(chǎn)仍然超過(guò)總產(chǎn)量的20%，而干 旱和鹽脅迫是最主要的制約因素。因此，研究與非生物脅迫有關(guān)的基因，并將其導(dǎo)入作物 進(jìn)行分子育種，引起了科研工作者的廣泛興趣，而通過(guò)基因工程的方法進(jìn)行逆境相關(guān)基因 的克隆及其功能的解析，能夠?yàn)橹参锟鼓嬗N提供有價(jià)值的信息和材料。然而，從直接解決 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中關(guān)鍵問(wèn)題的角度來(lái)看，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上能起顯著作用的轉(zhuǎn)基因作物種類(lèi)還不多， 人類(lèi)對(duì)植物逆境適應(yīng)性分子機(jī)理的研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠，遠(yuǎn)不能滿(mǎn)足植物分子育種的需求，同 世界發(fā)達(dá)國(guó)家相比，我國(guó)擁有自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和具有重要利用價(jià)值的基因相對(duì)較少。同時(shí)，目 前的研究也主要集中在草本植物，而對(duì)木本植物及其耐鹽和干旱的分子遺傳研究也相對(duì)較 少。然而，草本和木本植物在結(jié)構(gòu)、生長(zhǎng)、發(fā)育、生理，及在應(yīng)對(duì)生物和非生物脅迫等方面存 在較大的差異性。所以，從木本植物中尋找抗逆相關(guān)的基因并進(jìn)行研究，能夠?yàn)橥ㄟ^(guò)基因工 程提高作物的生物和非生物脅迫耐受性這種手段提供更多的候選基因。
[0003] 四翅濱藜（Atriplex canescens [Pursh]Nute)是一種鹽生灌木，在分類(lèi)上為藜科， 濱藜屬，普遍存在于干旱、半干旱地區(qū)，具有較強(qiáng)的耐干旱、抗鹽堿、耐寒冷和耐重金屬的特 性，尤其是耐干旱和鹽的特性。四翅濱藜在每年降雨量最低為180_的干旱半干旱地區(qū)，年 平均氣溫僅為5°C左右的低溫地區(qū)，甚至在極端低溫為-40°C地區(qū)以及鹽堿地等惡劣環(huán)境 下依然生長(zhǎng)良好，同時(shí)在海拔2000米左右的地區(qū)也適合生長(zhǎng)，根據(jù)已有報(bào)道，四翅濱藜被 有些國(guó)家稱(chēng)為"生物脫鹽器"，它一年時(shí)間就可以從6. 07畝的土地上吸收到1噸以上的鹽 分，灌木生物量也能達(dá)到15t/hm2,枝葉中的粗蛋白含量在12%以上，高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、富含營(yíng)養(yǎng)， 相關(guān)科學(xué)家們認(rèn)為，四翅濱藜有及其豐富的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和可觀的飼料用途，因此成為了荒漠、 半荒漠干旱地區(qū)非常有價(jià)值的優(yōu)良飼料灌木樹(shù)種。同時(shí)，四翅濱藜還具有積累硒的能力，因 此在美國(guó)也廣泛用于水土保持和路坡固定，但牧場(chǎng)改良仍然是其主要用途。近年來(lái)，四翅濱 藜先后在中國(guó)的新疆，甘肅，寧夏，青海和其它地方種植，通過(guò)大量研究，充分體現(xiàn)了四翅濱 藜較強(qiáng)的抗鹽，堿，干旱，低溫，貧瘠等優(yōu)良特性，漸漸成為綠化和水土保持的優(yōu)良樹(shù)種。
[0004] 釀酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae)具有典型的真核系統(tǒng)，是二倍體，它在 蛋白翻譯后加工過(guò)程中能形成二硫鍵，具有糖基化以及蛋白折疊等特征，使得其基因表達(dá) 模式更加接近于真核植物中的表達(dá)模式，它還具有生長(zhǎng)快速、遺傳操作簡(jiǎn)便和易于培養(yǎng)等 的優(yōu)點(diǎn)，所以在對(duì)植物功能基因的相關(guān)研究中，用酵母表達(dá)系統(tǒng)篩選具有原核表達(dá)系統(tǒng)不 可替代的優(yōu)勢(shì)性。釀酒酵母菌株INVScl (基因型為MATa his3Dlleu2trpl-289ura3-52)是 經(jīng)過(guò)人工改造后的尿嘧啶營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，該菌株的酵母轉(zhuǎn)化子運(yùn)用SC-U缺培養(yǎng)基篩選 時(shí)，假陽(yáng)性低，轉(zhuǎn)化效率高，因此是理想的酵母表達(dá)菌株。利用酵母營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株對(duì)植物 cDNA文庫(kù)的研究和挖掘，在植物中受到越來(lái)越多關(guān)注。Frommer等和Hsu等（1993年）在篩 選擬南芥cDNA文庫(kù)中克隆到氨基酸透過(guò)酶的NAT2/AAP1基因，該基因可以互補(bǔ)酵母的氨基 酸轉(zhuǎn)運(yùn)缺陷突變體；酵母系統(tǒng)研究植物耐鹽性表達(dá)基因的功能研究也被廣泛應(yīng)用，Yamada 等（2002年）就利用酵母轉(zhuǎn)化子來(lái)驗(yàn)證丙二烯環(huán)化氧化酶（AOC)基因可以大大提高抗鹽 性，進(jìn)一步推測(cè)到AOC基因在植物中也可能具有抗鹽功能。唐玉林等（2007年）利用酵母 研究了大豆SALI3-2蛋白可以使酵母轉(zhuǎn)化子的耐鹽能力得到顯著提高，從而推測(cè)SALI3-2 基因所具有的抗逆能力。由此可見(jiàn)，利用酵母表達(dá)外源蛋白并研究其功能已經(jīng)受到廣泛應(yīng) 用。
[0005] Real-Time PCR(RT-PCR)是一種目前應(yīng)用普遍的檢測(cè)基因表達(dá)的技術(shù)，它通過(guò) 添加熒光基團(tuán)，并利用熒光信號(hào)累積來(lái)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR的進(jìn)程，最后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)未 知模板進(jìn)行定量分析，該方法能夠避免傳統(tǒng)PCR定量終產(chǎn)物時(shí)產(chǎn)生的偏差，從而使實(shí)驗(yàn)的 重復(fù)性得到提高，該技術(shù)現(xiàn)已被廣泛用于監(jiān)測(cè)細(xì)胞mRNA的表達(dá)量變化。SYBR green是 Real-time PCR的常用方法之一，該法靈敏度高，通用性好，方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)而被國(guó)內(nèi)外科 研中普遍使用。
[0006] 蛋白激酶C(protein kinaseC，PKC)屬于多功能絲氨酸和蘇氨酸激酶，是G蛋白 偶聯(lián)受體系統(tǒng)中的效應(yīng)物，PKC在非活性狀態(tài)下是水溶性的，主要分布在細(xì)胞質(zhì)中，因此是 一種細(xì)胞質(zhì)酶。在未受刺激的細(xì)胞中，呈非活性構(gòu)象。一旦有第二信使的存在，PKC將成為 膜結(jié)合的酶，它能激活細(xì)胞質(zhì)中的酶，參與生化反應(yīng)的調(diào)控，同時(shí)也能作用于細(xì)胞核中的轉(zhuǎn) 錄因子，參與基因表達(dá)的調(diào)控，是一種多功能的酶。糖原合成酶激酶3 (glycogen synthase kinase3, GSK3)是最先在1980年從動(dòng)物細(xì)胞中得到的一類(lèi)PKC，李建莎等（2006)提到它 僅僅是一個(gè)調(diào)節(jié)糖原代謝的蛋白激酶。GSK3在多種細(xì)胞功能活動(dòng)的調(diào)節(jié)中扮演著重要的 角色，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞的結(jié)構(gòu)、細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞的分裂、凋亡、微管運(yùn)動(dòng)及參與決定胚 胎發(fā)育過(guò)程中細(xì)胞的命運(yùn)。在植物中，通常又稱(chēng)為shaggy-related protein kinase (SGG) (Dornelas et al.1999)。Khan等（2013)在酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，SGG/GSK3也可以在 油菜素內(nèi)酯介導(dǎo)的信號(hào)途徑中與BZRl互作，從而促進(jìn)BZRl在原生質(zhì)體中的磷酸化。同時(shí)， SGG/GSK3基因的表達(dá)受NaCl和ABA誘導(dǎo)，但不受KCl誘導(dǎo)，因此該基因可能參與響應(yīng)非生 物脅迫（Piao等，2001)。然而在目前的眾多研究中，還無(wú)有關(guān)四翅濱藜AcGSK3基因在抗逆 等生理功能方面的研究報(bào)道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明通過(guò)構(gòu)建四翅濱藜（Atriplex canescens)的低溫（-10 °C )及鹽脅迫 (400mM NaCl)全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并利用Gateway技術(shù)將cDNA文庫(kù)LR重組到酵母表達(dá)載 體（PYES-DEST52)中，混合質(zhì)粒載體經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株INVScl中，并通過(guò)模擬逆境脅迫 (NaCl、山梨醇）篩選出與逆境脅迫相關(guān)的基因-糖原合成酶激酶3基因（AcGSK3)，同時(shí)利 用RT-PCR技術(shù)檢測(cè)該基因在逆境脅迫（NaCl，PEG6000)條件下的表達(dá)量變化，以初步研究 該基因在四翅濱藜中逆境脅迫的相應(yīng)作用。本發(fā)明不僅對(duì)四翅濱藜的耐干旱和耐鹽分子機(jī) 制的研究提供新的依據(jù)，同時(shí)為獲得具有抗逆能力的轉(zhuǎn)基因農(nóng)作物和林木（耐鹽、干旱）奠 定基礎(chǔ)。本發(fā)明中，轉(zhuǎn)pYES-AcGSK3的重組酵母轉(zhuǎn)化子表現(xiàn)出了明顯的抗干旱和抗鹽脅迫 的能力。同時(shí)在本源植物四翅濱藜中，AcGSK3基因的表達(dá)也對(duì)鹽脅迫和旱脅迫表現(xiàn)出了明 顯的響應(yīng)。
[0008] 本發(fā)明提供了四翅濱藜中一種含GSK3功能域的與植物抗逆（鹽和旱）相關(guān)的蛋 白及其編碼基因序列，通過(guò)利用酵母系統(tǒng)進(jìn)行功能驗(yàn)證，并在本源植物中通過(guò)RT-PCR檢測(cè) 的方法對(duì)該基因進(jìn)行進(jìn)一步解析及其在植物抗逆中的應(yīng)用。
[0009] 本發(fā)明提供的糖原合成酶激酶3基因，名稱(chēng)為AcGSK3,為序列表中SEQ ID NO :1所 示的核苷酸序列。通過(guò)四翅濱藜全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)測(cè)序得到AcGSK3基因。該基因共由1101 個(gè)堿基組成，完整的開(kāi)放閱讀框含有339bp，同時(shí)還含有5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū)序列，開(kāi) 放閱讀框的起始密碼子為ATG，終止密碼子為T(mén)AA。
[0010] 本發(fā)明所提供的蛋白耐干旱和鹽脅迫，名稱(chēng)為AcGSK3(糖原合成酶激酶3)，來(lái)源 于鹽生灌木四翅濱藜，植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3,由序列表中序列2所示的氨基酸序列組 成的蛋白質(zhì)。
[0011] 所述植物抗逆性相關(guān)蛋白ACGSK3的編碼基因 AcGSK3的編碼序列為下列之一：
[0012] 1)編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第346-684位脫氧核 苷酸；
[0013] 2)編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
[0014] 一種重組表達(dá)載體，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因 AcGSK3。
[0015] 一種重組菌，含有植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因 AcGSK3。
[0016] 序列表中的序列2共由113個(gè)氨基酸殘基所組成，根據(jù)DNAMN分析等電點(diǎn)9. 69， 一般情況下，蛋白帶正電荷，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含57個(gè)卷曲，56個(gè)螺旋，不含折疊，有6個(gè)抗 原肽段，蛋白含40個(gè)親水氨基酸，73個(gè)疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob/ Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面區(qū)域?yàn)橹胁考癈端。PSORT Prediction預(yù)測(cè)蛋 白可能性定位大小依次為細(xì)胞質(zhì)、微體。
[0017] 本發(fā)明涉及的酵母表達(dá)載體pYES-DEST52(購(gòu)自Invitrogen公司）與AcGSK3基因 重組為pYES-AcGSK3,且該重組酵母表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主感受態(tài)細(xì)胞為釀酒酵母INVScl。 該酵母表達(dá)載體除了含有AcGSK3的編碼DNA序列外，還攜帶有GALl啟動(dòng)子、T7啟動(dòng)子、 URA3基因、氨芐青霉素抗性標(biāo)記基因、CYCl終止轉(zhuǎn)錄信號(hào)、LR重組位點(diǎn)attRl和attR2、用 于逆向篩選的致死基因 ccdB，蛋白純化的6xHisTag，蛋白表達(dá)檢測(cè)的V5epitope等外源基 因蛋白在酵母中高效表達(dá)所需的各種調(diào)控元件。
[0018] 本發(fā)明通過(guò)RT-PCR方法，檢測(cè)了該基因在對(duì)于干旱和鹽脅迫的響應(yīng)（PEG，NaCl處 理），基因在兩種脅迫處理下表現(xiàn)出了基因上調(diào)，進(jìn)一步推測(cè)該基因在植物參與逆境響應(yīng)， 尤其是干旱和鹽脅迫中起重要作用，該基因的上調(diào)表達(dá)有助于提高四翅濱藜的抗干旱和抗 鹽的能力。
[0019] 本發(fā)明在通過(guò)酵母（NaCl，山梨醇）及RT-PCR(NaCl，PEG)關(guān)于干旱和鹽的研究后， 結(jié)果表明AcGSK3基因在逆境方面的應(yīng)用：該基因過(guò)量表達(dá)可能提高植物的抗逆性，所述植 物抗逆性具體可分為對(duì)非生物脅迫和生物脅迫的抗逆性，非生物脅迫如干旱、極端溫度、鹽 堿等，特別是植物的抗干旱和鹽脅迫的能力。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0020] 圖1為四翅濱藜總RNA提取圖片
[0021] 圖 2 為 IKb Plus DNA Ladder
[0022] 圖3為cDNA文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度PCR檢測(cè)圖片
[0023] 圖4為cDNA文庫(kù)插入片段長(zhǎng)度PCR檢測(cè)圖片
[0024] 圖 5 為 IKb Plus DNA Ladder
[0025] 圖6為pYES-AcGSK3重組質(zhì)粒PCR擴(kuò)增凝膠電泳圖
[0026] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1，2 :擴(kuò)增 片段
[0027] 圖7為AcGSK3在NCBI中功能域比對(duì)分析結(jié)果
[0028] 圖8為AcGSK3與其它物種的同源蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析
[0029] 圖9為pYES-AcGSK3陽(yáng)性重組酵母轉(zhuǎn)化子PCR凝膠電泳圖
[0030] M :DL2000DNA Marker ;M :2000bp、IOOObp、750bp、500bp、250bp、IOObp ;1 :陽(yáng)
[0031] 性酵母轉(zhuǎn)化子PCR鑒定
[0032] 圖10為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52非脅迫下的結(jié)果
[0033] 圖11為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52在3M山梨醇脅迫下的結(jié)果
[0034] 圖12為重組酵母pYES-AcGSK3和pYES-DEST52在2M NaCl脅迫下的結(jié)果
[0035] 圖10-12中：pYES-AcGSK3酵母轉(zhuǎn)化在對(duì)2MNaCl和3M山梨醇的抗逆能力明顯強(qiáng) 于空載體PYES-DEST52酵母轉(zhuǎn)化子。
[0036] 圖13為AcGSK3基因在400mM NaCl脅迫處理后的表達(dá)量變化圖
[0037] 圖14為AcGSK3基因在20% PEG6000脅迫處理后的表達(dá)量變化圖
[0038] 圖13和14中：AcGSK3基因在NaCl處理6h后開(kāi)始上調(diào)表達(dá)；同時(shí)，在PEG處理 24h后該基因開(kāi)始上調(diào)表達(dá)。

【具體實(shí)施方式】
[0039] 實(shí)施例一：AcGKS3基因全長(zhǎng)cDNA的獲得及序列分析
[0040] 1.脅迫處理四翅濱藜：
[0041] -KTC條件下生長(zhǎng)三個(gè)月的四翅濱藜植株，移栽到人工氣候培養(yǎng)箱，正常培養(yǎng)10 天后，待植株復(fù)蘇存活，發(fā)出新葉，生長(zhǎng)健壯。將植株轉(zhuǎn)移到含有營(yíng)養(yǎng)的水培條件下，正常生 長(zhǎng)兩天后，用500mL的含NaC1400mM的鹽液水培處理四翅濱藜植株，脅迫處理4天后，采摘 葉片，嫩莖部和幼根清洗干凈并液氮速凍，_80°C凍存，以備建庫(kù)。
[0042] 2.構(gòu)建 cDNA 文庫(kù)：
[0043] 將NaCl處理4天后的四翅濱藜樣品（葉片、嫩莖和幼根）提取總RNA (圖1、圖2)， 然后使用Invitrogen公司的'cap antibody module'將含有完整帽子結(jié)構(gòu)的單鏈cDNA進(jìn) 行富集，并按照Superscript lvFull-Length cDNA Library Construction Kit 試劑盒構(gòu)建 全長(zhǎng)cDNA文庫(kù)，并通過(guò)Gateway技術(shù)將該cDNA文庫(kù)LR重組到酵母表達(dá)載體pYES-DEST52 中，隨機(jī)對(duì)cDNA文庫(kù)進(jìn)行PCR檢測(cè)（圖3、圖4、圖5)，將長(zhǎng)度500bp以上的片段進(jìn)行測(cè)序， 利用NCBI的BlastX進(jìn)行功能域的比對(duì)及相關(guān)生物信息學(xué)分析，獲得了四翅濱藜鹽脅迫的 表達(dá)序列標(biāo)簽（ESTs)。
[0044] 2. 1四翅濱藜總RNA提取的方法：
[0045] 2. I. 1取IOOmg植物樣品，在預(yù)冷的研缽中用液氮迅速研成粉末，快速轉(zhuǎn)移到遇冷 的2mL離心管中。（保證全過(guò)程在通風(fēng)廚中，防止RNA降解。）
[0046] 2. 1. 2加入ImlTrizol試劑，劇烈振蕩混勻15s，靜置IOmin充分裂解細(xì)胞。
[0047] 2. 1.3加入0.2mL氯仿（三氯甲烷），迅速震蕩混勻15s，靜置5min。
[0048] 2. 1. 4 高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 15min。
[0049] 2. I. 5將上清小心轉(zhuǎn)移到新的I. 5mL離心管，加0.5mL異丙醇，顛倒混勻，靜置 IOmin0
[0050] 2. 1. 6 再次高速低溫（12, OOOrpm，4°C )離心 lOmin。
[0051] 2. 1. 7去除上清，加0. 5IHL751%的乙醇，7, 500rpm低溫離心5min以洗漆沉淀。
[0052] 2. 1. 8重復(fù)步驟2. 1. 7 -次，進(jìn)一步洗漆沉淀，去除離子。
[0053] 2. 1. 9小心吸取上清，并通風(fēng)廚中干燥RNA沉淀，并用50 μ L的DEPC水溶解RNA。
[0054] 3.篩選AcGSK3基因片段的克?。?br> [0055] 根據(jù)測(cè)序分析，獲得四翅濱藜ESTs，從中獲得了一個(gè)編碼GSK3的cDNA全序 列AcGSK3,將LR重組得到的酵母表達(dá)載體pYES-AcGSK3轉(zhuǎn)化至大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞中 (DH5 α )，過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落，并于LB (含100mg/L的Amp)液體培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，通過(guò) 質(zhì)粒提取試劑盒（鼎國(guó)公司）提取質(zhì)粒。并根據(jù)載體上的通用序列PCR引物，并進(jìn)行質(zhì)粒 PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，以鑒定獲得的cDNA序列。
[0056] 上游（T7) :5, -TAATACGACTCACTATAGGG-3'
[0057] 下游（R) :5' -AGGGTTAGGGATAGGCTTACCTTC-3'
[0058] PCR 反應(yīng)體系（25 μ L) :Buffer2. 5 μ L、上下游引物（T7、R)各 0· 5 μ L、Tag 酶 0· 5 μ UdNTPO. 5 μ L、模板 0· 2 μ L、ddH2020. 8 μ L。PCR 反應(yīng)的條件：在 94°C預(yù)變性 5 分鐘； 94 °C變性30秒；迅速冷卻至58 °C退火30秒；72 °C延伸2分鐘，30個(gè)循環(huán)；72 °C延伸10分 鐘；4°C冷卻保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，在大約IlOObp的位置上有特異 性的目的條帶（圖6)。
[0059] 實(shí)施例二：AcGSK3基因的序列分析
[0060] 經(jīng)測(cè)序分析后，AcGSK3基因的全長(zhǎng)cDNA序列l(wèi)lOlbp，包含339bp的開(kāi)放閱讀框， 共編碼113氨基酸殘基，根據(jù)DNAMN分析等電點(diǎn)9. 69, 一般情況下，蛋白帶正電荷，蛋白二 級(jí)結(jié)構(gòu)含57個(gè)卷曲，56個(gè)螺旋，不含折疊，有6個(gè)抗原肽段，蛋白含40個(gè)親水氨基酸，73個(gè) 疏水氨基酸，根據(jù)Expasy protscale的Hphob/Kyte&Doolittle分析到球蛋白可能的表面 區(qū)域?yàn)橹胁考癈端。PSORT Prediction預(yù)測(cè)蛋白可能性定位大小依次為細(xì)胞質(zhì)、微體。這 是GSK3家族蛋白的主要特征。通過(guò)分析表明，獲得了 AcGSK3基因的全長(zhǎng)cDNA序列，并且 在GenBank上的登錄號(hào)為KJ027006。
[0061] 利用 NCBI (http://www. ncbi. nlm. nih. gov/Structure/cdd/wrpsb. cgi)對(duì)該編 碼基因進(jìn)行保守區(qū)域分析（圖7)，該基因編碼的蛋白屬于GSK3家族蛋白。通過(guò)NCBI對(duì) AcGSK3基因編碼的氨基酸序列進(jìn)行BLASTX，通過(guò)與已確定功能的其它物種的氨基酸序列 進(jìn)行同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，利用MEGA4軟件進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果表明：AcGSK3與葡 萄和蓖麻等木本植物中的GSK3編碼的氨基酸進(jìn)化關(guān)系更近（圖8)。
[0062] 實(shí)施例三：重組酵母的轉(zhuǎn)化及檢測(cè)
[0063] 釀酒酵母菌株INVScl為尿氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型（UraO的模式菌株，在缺乏尿氨酸 的酵母基本培養(yǎng)基（SC-UraO上，該酵母菌株幾乎不能生長(zhǎng)和繁殖。而酵母表達(dá)載體 (PYES2-DEST52)上含有URA3基因，且該基因的表達(dá)可以使酵母轉(zhuǎn)化子在SC-Ura-培養(yǎng)基 上正常生長(zhǎng)。因此，SC-Urf選擇培養(yǎng)基可以進(jìn)行陽(yáng)性和非陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子的篩選。通過(guò)醋 酸鋰法將載體質(zhì)粒pYES-AcGSK3和pYES-DEST52分別轉(zhuǎn)化到酵母感受態(tài)菌株INVScl中，將 轉(zhuǎn)化酵母菌液涂在SC-Urf固體選擇培養(yǎng)基上，以未轉(zhuǎn)化的酵母做對(duì)照，進(jìn)行培養(yǎng)，2d后除 了空酵母完全不長(zhǎng)外，轉(zhuǎn)化兩種質(zhì)粒的酵母均可以生長(zhǎng)并有菌落長(zhǎng)出，說(shuō)明酵母轉(zhuǎn)化成功， 挑取酵母單菌落，過(guò)夜培養(yǎng)后進(jìn)行破除細(xì)胞壁，并通過(guò)菌液PCR方法進(jìn)行陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的進(jìn) 一步鑒定。
[0064] 1.運(yùn)用醋酸鋰化學(xué)轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化釀酒酵母INVScl，其具體轉(zhuǎn)化步驟：
[0065] I. 1將一個(gè)酵母菌株單克隆（INVScl)加入到IOmLYH)液體培養(yǎng)基中，30°C，200rpm 過(guò)夜搖培。
[0066] 1. 2檢測(cè)酵母菌液的0D_值，利用50mL YH)液體培養(yǎng)基，將過(guò)夜培養(yǎng)的酵母菌液 稀釋至 OD6tltl 為 0. 4, 30°C，200rpm 繼續(xù)搖培 2-4h。
[0067] 1. 3低溫離心（4°C，2500rpm)5min后，去除上清收集菌體，用40mLlxTE緩沖液重懸 菌體。
[0068] L 4再次低溫離心（4°C，2500rpm)5min后，收集菌體，用2mLlxLiAc/0. 5xTE緩沖液 重懸菌體。
[0069] 1. 5將獲得的重懸菌體按照每管100 μ L的體系，分裝到I. 5mL離心管。
[0070] 1. 6將分裝的酵母細(xì)胞置于室溫孵育lOmin。
[0071] 1. 7在每個(gè)轉(zhuǎn)化體系（100 μ L)中，加入Iyg質(zhì)粒DNA，IOOyg變性鮭魚(yú)精DNA，混 勻。
[0072] 1. 8 每個(gè)體系中加入 700μ Llx LiAc/40% PEG-3350/lx ΤΕ，混勻。
[0073] I. 930°C孵育步驟1. 8中的混合液30min。
[0074] I. 10在每個(gè)體系中再加入88μ L的DMSO,混勻后，42°C條件下水浴熱擊7min。
[0075] I. 115000rpm低溫離心lmin，去除上清。
[0076] 1. 12用備好的ImLlxTE的緩沖液重懸菌體，5000rpm低溫離心Imin,進(jìn)一步去除上 清。
[0077] 1. 13用IOOyLlxTE的緩沖液將菌體重懸，并涂于酵母選擇培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng) 24h。
[0078] 2.陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的鑒定
[0079] 從酵母選擇培養(yǎng)基上隨機(jī)挑取5個(gè)酵母轉(zhuǎn)化子（pYES2_AcGSK3)的單菌落，30°C振 蕩培養(yǎng)過(guò)夜（200rpm)，收集過(guò)夜培養(yǎng)菌體，沸水煮5min，迅速置于冰上5min以破碎細(xì)胞， 重復(fù)幾次，以細(xì)胞破碎液離心濃縮樣品作為模板進(jìn)行菌液PCR，以引物T7和R進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，PCR 反應(yīng)體系為（25μ L) :Buffer2. 5μ L、上下游引物（T7、R)各 0. 5μ UTag 酶 0. 5μ L、 dNTPO. 5 μ L、模板 5 μ L、ddH2015. 5 μ L。
[0080] PCR產(chǎn)物在1%的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)，擴(kuò)增片段大小為llOObp，與目標(biāo)長(zhǎng)度吻 合（圖9)。證明重組質(zhì)粒pYES2-AcGSK3已經(jīng)轉(zhuǎn)化到酵母菌株中。
[0081] 實(shí)施例四：陽(yáng)性轉(zhuǎn)化酵母逆境脅迫處理
[0082] 1.逆境脅迫處理前準(zhǔn)備
[0083] 取適量陽(yáng)性酵母轉(zhuǎn)化子（pYES-DEST52，pYES2-AcGSK3)菌液，接種到含2%葡萄糖 的SC-U液體培養(yǎng)基中，30°C條件下200rpm振蕩培養(yǎng)24h，測(cè)OD 6c?值，并用SC-U液體培養(yǎng)基 (2 %葡萄糖）將菌液OD6tltl統(tǒng)一調(diào)整為0. 4,總體積5mL，8000rpm離心lmin，吸取上清液，力口 2mL含2%半乳糖的酵母誘導(dǎo)培養(yǎng)基重懸菌體，以1:50的比例接到5mL的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中擴(kuò) 大培養(yǎng)，30°C振蕩培養(yǎng) 24h，檢測(cè)酵母 INVScl(pYES-DEST52)和 INVScl(pYES2-AcGSK3)的 0D_值，并統(tǒng)一調(diào)整到0D_值為2,備用。對(duì)這兩種酵母轉(zhuǎn)化子進(jìn)行不同的非生物脅迫處 理，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化子抗鹽和干旱脅迫能力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。
[0084] 2.模擬逆境脅迫處理
[0085] 存在于自然界中的植物面對(duì)各種生物和非生物逆境，非生物脅迫中最主要的是鹽 脅迫（NaCl、KCl等）和干旱脅迫。
[0086] 在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行鹽和干旱的模擬，用2MNaCl模擬鹽脅迫，3M的山梨醇模擬干 旱脅迫。運(yùn)用以上兩種模擬條件處理酵母轉(zhuǎn)化子，通過(guò)酵母的生長(zhǎng)情況對(duì)比，從而評(píng)價(jià)該 基因在酵母中誘導(dǎo)表達(dá)后對(duì)酵母抗逆性的影響，以對(duì)該基因在酵母中的抗逆功能進(jìn)行初探 (圖 10、圖 11、圖 12)。
[0087] 2. INaCl處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、10000倍的菌 體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天后，比較兩種酵 母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0088] 2. 23M山梨醇干旱模擬處理：將上述備用菌體分別以不稀釋和稀釋10、100、1000、 10000倍的菌體，吸取2 μ L菌液接種到含2%半乳糖的SC-U固體培養(yǎng)基上，30°C培養(yǎng)兩天 后，比較兩種酵母轉(zhuǎn)化菌的菌落生長(zhǎng)狀態(tài)。
[0089] 實(shí)施例五：AcGSK3基因在四翅濱藜PEG和NaCl脅迫下的應(yīng)答
[0090] 1.四翅濱藜脅迫處理：
[0091] 將四翅濱藜種子種在營(yíng)養(yǎng)土中，正常條件生長(zhǎng)50天后，選取生長(zhǎng)良好的四翅濱 藜，轉(zhuǎn)移到MS營(yíng)養(yǎng)液中進(jìn)行水培，每天更換營(yíng)養(yǎng)液，水培3天待四翅濱藜生長(zhǎng)健壯后，分別 用400mM NaCl和20% PEG6000處理，并在0、6、12、24、48h后取根莖葉，液氮速凍，-80°C保 存。
[0092] 2. RNA提取及反轉(zhuǎn)錄：
[0093] 采用Trizol法提取總RNA (如實(shí)施例一，2. 1)，利用Takara公司的PrimeScripP RT reagent Kit With gDNA Eraser (Perfect Real Time)試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄以制備 cDNA，用 于 quantity Real-time PCR 分析。
[0094] 3.熒光定量PCR分析：
[0095] 利用SYBR:?Grecn Reagent試劑盒，使用7500熒光定量系統(tǒng)檢測(cè)AcGSK3基因 (F: CGTCCATTGCCACCTCTCTT ; R: TACTGTCGCCTCACATGCTC)在不同處理下隨時(shí)間變化的表達(dá) 量差異。真核延伸生長(zhǎng)因子（EFl-α)作為內(nèi)參基因（F:5' -CCCCAGTTCTCGACTGTCAC-3' ； R5' -TGGTGGGAACCATCTTCACG-3'）。反應(yīng)條件為：95°C預(yù)變性 30 秒；95°C變性 5 秒，60°C退 火延伸34秒，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)；95°C變性15秒，60°C退火延伸1分鐘，95°C變性15秒；60°C 延伸15秒。采用法分析表達(dá)量差異（圖13、圖14)。
【權(quán)利要求】
1. 一種植物抗逆相關(guān)蛋白AcGSK3,其特征在于由序列表中SEQ ID NO: 2所示的氨基酸 序列組成的蛋白質(zhì)。
2. 按權(quán)利要求1所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基因AcGSK3,其特征在于所 述編碼基因AcGSK3的編碼序列為下列之一： 1) 編碼序列的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO: 1的5'端第346-684位脫氧核苷酸； 2) 編碼序列表中SEQ ID NO:2蛋白質(zhì)序列的核苷酸分子。
3. -種重組表達(dá)載體，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的 編碼基因AcGSK3。
4. 一種重組菌，其特征在于含有權(quán)利要求2所述植物抗逆性相關(guān)蛋白AcGSK3的編碼基 因 AcGSK3。
【文檔編號(hào)】C12N9/12GK104371986SQ201410497562
【公開(kāi)日】2015年2月25日 申請(qǐng)日期:2014年9月23日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月23日
【發(fā)明者】潘洪玉, 李敬濤, 余剛, 孫新華, 劉金亮, 劉言志, 張祥輝, 賈承國(guó) 申請(qǐng)人:吉林大學(xué)