一種t4 dna聚合酶活性測(cè)定方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，所述方法包括：在無dNTP存在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應(yīng)體系中加入T4 DNA聚合酶，反應(yīng)完成后檢測(cè)雙鏈DNA的相對(duì)量，由此測(cè)出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切酶活性與聚合酶活性相關(guān)，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。本發(fā)明通過便利地測(cè)量外切酶活性，利用T4 DNA聚合酶的外切酶活性與聚合酶活性的相關(guān)性測(cè)量聚合酶活性。與現(xiàn)有技術(shù)的方法相比，無放射性污染，操作簡單快速，并且克服了外切酶活性對(duì)聚合酶活性測(cè)定的干擾，得到的結(jié)果因此更準(zhǔn)確。
【專利說明】-種T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生化【技術(shù)領(lǐng)域】，具體來說涉及一種Τ4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法。

【背景技術(shù)】
[0002] Τ4 DNA聚合酶由Τ4噬菌體聚合酶I基因編碼，具有5'_3'聚合酶活性以及3'_5' 外切酶活性。T4 DNA聚合酶是基因工程技術(shù)中一種重要的工具酶，可用于雙鏈DNA末端的 平滑化。在高通量測(cè)序（next generation sequencing)文庫構(gòu)建的過程中，片段化的DNA 末端首先需要用T4 DNA聚合酶平滑化，再經(jīng)過T4多聚核苷酸激酶加磷酸后，才能與雙鏈 DNA接頭進(jìn)行連接。
[0003] 標(biāo)準(zhǔn)的T4 DNA聚合酶測(cè)活方法采用放射性同位素法。T4 DNA聚合酶可以催化將 32P標(biāo)記的dNTP摻入到小牛胸腺DNA中。經(jīng)過TCA沉淀、whatman濾紙過濾，通過測(cè)定酸不 溶性物質(zhì)中放射性的含量，計(jì)算聚合酶活性。這種方法易產(chǎn)生放射性污染，且步驟多、周期 長，難以實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化。
[0004] Seville 等（Biotechniques· 1996 Oct ;21 (4) : 664)建立了一種基于突光的 DNA 聚合酶活性測(cè)定方法，其原理如圖1所示。
[0005] DNA聚合酶可以M13單鏈環(huán)狀DNA為模板催化聚合反應(yīng)，生成M13雙鏈環(huán)狀DNA。 雙鏈環(huán)狀DNA產(chǎn)物可以被雙鏈DNA特異性的picogreen染料結(jié)合，產(chǎn)生熒光，從而測(cè)定DNA 聚合酶活性。
[0006] 但是本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，這種方式不適用于T4 DNA聚合酶的活性測(cè)定。因?yàn)門4 DNA 聚合酶具有很強(qiáng)的3' -5'外切酶活性，在該測(cè)活體系中，3' -5'外切酶活性會(huì)在很大程度上 抵消聚合酶活性，造成聚合酶活性難以測(cè)定。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明的目的在于建立一種非放射性、簡便、快速的外切酶活性測(cè)定方法，其原理 如圖2所示。
[0008] 具體來說，本發(fā)明采用的是以下技術(shù)方案： 一種T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：在無 dNTP存 在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應(yīng)體系中加入T4 DNA聚合酶，反應(yīng)完成后 檢測(cè)雙鏈DNA的相對(duì)量，由此測(cè)出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外切 酶活性與聚合酶活性相關(guān)，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
[0009] 優(yōu)選地，雙鏈DNA的相對(duì)量是利用熒光染料，例如僅與雙鏈DNA或僅與單鏈DNA結(jié) 合的熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。
[0010] 更優(yōu)選，所采用的熒光染料是雙鏈DNA特異性熒光染料，更優(yōu)選為市售的成熟商 用突光染料，例如picogreen染料。
[0011] 在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法中所采用的雙鏈線性DNA模板是以λ DNA為底物， 在正向和反向引物的存在下通過PCR擴(kuò)增獲得的線性雙鏈DNA，以便建立一種標(biāo)準(zhǔn)的測(cè)量 方法。
[0012] 在一個(gè)進(jìn)一步的實(shí)施方案中，所用正向引物為5' -aataacgtcggcaactttgg-3'，反 向引物為 5' -gttacgccaccagtcatcct-3'。
[0013] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)： 1. 無放射性污染； 2. 操作步驟簡單快速，無需TCA沉淀、洗滌、干燥、洗脫步驟；可實(shí)現(xiàn)高通量、自動(dòng)化的 活性測(cè)定。
[0014] 3.建立了 T4 DNA聚合酶的外切酶活性和聚合酶活性的定量關(guān)系，通過方便的測(cè) 定外切酶活性，克服了外切酶活性對(duì)聚合酶活性測(cè)定的干擾，測(cè)量結(jié)果更準(zhǔn)確。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0015] 圖1是現(xiàn)有技術(shù)中測(cè)定DNA聚合酶活性的技術(shù)原理圖。
[0016] 圖2是本發(fā)明的測(cè)定T4 DNA聚合酶活性的技術(shù)原理圖。
[0017] 圖3是現(xiàn)有技術(shù)的熒光法測(cè)定大腸桿菌pol I和T4 DNA聚合酶獲得的熒光酶活 曲線圖。
[0018] 圖4是利用本發(fā)明的方法測(cè)定T4 DNA聚合酶獲得的熒光酶活曲線圖。
[0019] 圖5是不同來源的T4 DNA聚合酶的熒光酶活曲線圖。

【具體實(shí)施方式】
[0020] 在dNTP缺失的情況下，T4 DNA聚合酶失去聚合活性，但保留強(qiáng)的3' -5'外切酶活 性，可從雙鏈DNA的兩個(gè)3'末端向內(nèi)進(jìn)行降解，表現(xiàn)出單純的核酸外切酶的活性。因?yàn)門4 DNA聚合酶的聚合酶活性和外切酶活性分屬不同結(jié)構(gòu)域，（MICHELLE et al.，Proc. Natl. Acad. Sci. USA Vol. 90，ρρ· 2579-2583，April 1993)，本發(fā)明人假設(shè)，其聚合酶活性和 外切酶活性的比例是一個(gè)恒定的值，可以通過測(cè)定其外切酶活性來推算出其聚合酶活性。 本發(fā)明首先建立了一種非放射性、簡便、快速的外切酶活性測(cè)定方法，其原理如圖2所示。
[0021] 如圖所示，在無 dNTP存在的情況下，T4 DNA聚合酶可以從雙鏈DNA的3'端開始 降解，從而降低雙鏈DNA的量。通過雙鏈特異性的picogreen染料就可以測(cè)定T4 DNA聚合 酶的外切酶活性。
[0022] 本發(fā)明人進(jìn)一步證明了上述假設(shè)，從而建立了非放射性、簡便、快速的T4 DNA聚合 酶測(cè)定方法。
[0023] 下面將結(jié)合具體實(shí)施例來具體說明本發(fā)明。
[0024] 實(shí)施例1.熒光法測(cè)定T4 DNA聚合酶的聚合酶活性 M13模板/引物復(fù)合物的制備： M13 單鏈 DNA :M13mpl8 單鏈 DNA (NEB); 引物：M13 引物 5，-aagccatccgcaaaaatgacctct-3，； M13模板/引物復(fù)合物：將M13mpl8單鏈DNA同M13引物按摩爾比1:1混合，在退火緩 沖液（10 mM Tris-HCl pH 8.0，50 mM NaCl)中，70°C加熱5分鐘后，緩慢降至室溫，使模 板引物退火。
[0025] 2.聚合酶反應(yīng)

【權(quán)利要求】
1. 一種T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：在無dNTP 存在的情況下，在以雙鏈線性DNA模板為底物的反應(yīng)體系中加入T4 DNA聚合酶，反應(yīng)完成 后檢測(cè)雙鏈DNA的相對(duì)量，由此測(cè)出T4 DNA聚合酶的外切酶活性，并使T4 DNA聚合酶的外 切酶活性與聚合酶活性相關(guān)，得到T4 DNA聚合酶的聚合酶活性程度。
2. 如權(quán)利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，雙鏈DNA的相對(duì)量 是利用熒光染料，通過熒光法測(cè)得的，并且雙鏈DNA的相對(duì)量是以熒光強(qiáng)度表示的。
3. 如權(quán)利要求2所述的T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的熒光染料 是雙鏈DNA特異性熒光染料。
4. 如權(quán)利要求3所述的T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的染料是 picogreen 染料。
5. 如權(quán)利要求1所述的T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所采用的雙鏈線 性DNA模板是以入DNA為底物，在正向和反向引物的存在下通過PCR擴(kuò)增獲得的線性雙鏈 DNA。
6. 如權(quán)利要求5所述的T4 DNA聚合酶活性測(cè)定方法，其特征在于，所用正向引物為 5，-aataacgtcggcaactttgg-3，，反向弓I物為 5，-gttacgccaccagtcatcct-3，。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313132SQ201410502171
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】徐曉昱, 劉來花, 王靜 申請(qǐng)人:南京諾唯贊生物科技有限公司