一次復(fù)合pcr反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法，該方法包括以下步驟：1)大麻植物基因組DNA提?。?)復(fù)合PCR引物設(shè)計：3)PCR反應(yīng)體系配置；4)PCR擴(kuò)增；5)瓊脂糖電泳；6)PCR產(chǎn)物電泳條帶觀察及化學(xué)型判斷。通過一次復(fù)合PCR反應(yīng)，毒品型大麻可以擴(kuò)增出約550bp大小的特異性THC條帶，纖維型大麻可以擴(kuò)增出約1050bp大小的特異性CBD條帶，而中間型大麻可以同時擴(kuò)增出上述550bp和1050bp大小的兩條條帶，通過擴(kuò)增條帶情況，可直觀地判斷出應(yīng)試大麻樣品的化學(xué)型分離。該方法不受傳統(tǒng)化學(xué)檢測中取樣時間、取樣部位等約束，具有操作簡單、周期短、成本低廉等特點，能夠?qū)Υ舐橹仓昊瘜W(xué)型進(jìn)行快速鑒定，可供公安毒品檢測部門、農(nóng)業(yè)育種部門等使用，具有良好的應(yīng)用前景。
【專利說明】-次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué) 型的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 大麻（Cannabis sativaL.)是大麻科（Cannabinaceae)大麻屬（Cannabis) -年 生草本植物，多為雌雄異株。世界各地都有廣泛的栽培或野生，現(xiàn)主要分布在亞洲和歐洲， 我國大麻種質(zhì)資源豐富，為我國傳統(tǒng)經(jīng)濟(jì)作物，有著悠久的栽培歷史。大麻是一種公認(rèn)的雙 面性植物，一方面大麻有著重要的經(jīng)濟(jì)價值，涉及紡織、造紙、食品、建材、化工及制藥等多 個方面，為人類社會發(fā)展作出了巨大貢獻(xiàn)。另一方面由于大麻植株中含有一種致幻成癮的 活性成分-四氫大麻酚（tetrahydrocannabinol, THC)，大麻在西方社會被濫用為毒品， 是一種公認(rèn)的毒品原植物。如何正確處理大麻植物利用與毒品濫用之間的矛盾，已經(jīng)成為 全世界關(guān)注的焦點。
[0003] 大麻素是大麻植物中特有的含有烷基和單萜基團(tuán)分子結(jié)構(gòu)的一類次生代謝產(chǎn) 物。目前，已從大麻干物質(zhì)及新鮮大麻葉中分離出大麻素70多種，但是以THC和大麻二酚 (cannabidiol，CBD)的含量最高，約占大麻植株中大麻素的90%，THC和CBD為大麻素中兩 個主要物質(zhì)。根據(jù)THC和CBD兩者含量比值大小，可將大麻植物分為毒品型、中間型和纖維 型三種，其中纖維型大麻中不含或含極微量THC，無毒品利用價值，可開發(fā)成工業(yè)大麻并合 理利用（陳璇，2011 ;ELS0HLY，2005)。目前公安禁毒部門以及農(nóng)業(yè)科研部門進(jìn)行大麻植物 檢測過程中，只能使用化學(xué)方法來檢測大麻植株中THC或CBD含量，由于大麻植物在不同生 長時期、不同部位中THC或CBD等含量差異很大（大麻素作為植物次生代謝產(chǎn)物，其含量還 受到環(huán)境因子的影響），以雌性植株始果期的頂部花葉中含量最高，所以檢測部位需為大麻 雌性植株始果期的頂部花葉（云南省地方標(biāo)準(zhǔn)，2009 ;伍菊仙，2010)?；瘜W(xué)檢測方法對取樣 時間、取樣部位、取樣量及材料處理過程均較苛刻，步驟復(fù)雜，檢測費用昂貴。
[0004] 研究表明，THC和CBD在新鮮大麻植株中都是以酸的形式存在（即THCA和CBDA， 脫羧基則變成酚的形式），且THCA和CBDA是由同一個前體物質(zhì)--大麻萜酚酸（CBGA)， 經(jīng)過不同氧化還原酶（THCA合成酶、CBDA合成酶）催化而得到，兩者之間互為同源異構(gòu)體。 本發(fā)明正是基于用分子生物學(xué)手段來區(qū)分這兩個相似性很高的同源異構(gòu)體，經(jīng)大量的科學(xué) 實驗而得到。經(jīng)查閱，尚未見有使用復(fù)合PCR方法來鑒定大麻化學(xué)型的專利及文獻(xiàn)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 為了克服現(xiàn)有技術(shù)中存在的缺陷，本發(fā)明提供一種一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植 物化學(xué)型的方法，不受生長環(huán)境、取樣時間、取樣部位及取樣量的影響，可一次性鑒定出大 麻化學(xué)型（毒品型、中間型或纖維型），高效而準(zhǔn)確。其技術(shù)方案如下：
[0006] 一種一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)大麻植物基因組DNA提?。翰捎弥参锍Ｒ?guī)CTAB法來提取大麻基因組DNA，提取 對象為大麻植物生長任何生長時期、任何生長部位，優(yōu)選取樣對象為植株的幼嫩組織（幼 嫩根、莖、葉等），取樣量一般大于0. Ig即可，提取的基因組DNA用RNase A水溶液溶解并放 置37°C下消化RNA，測定DNA溶液濃度和質(zhì)量后，用于后續(xù)PCR反應(yīng)中的模板；
[0008] 2)復(fù)合PCR引物設(shè)計：合成三條特異性引物，序列分別為：
[0009] A 引物 5' -AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3，，
[0010] B 引物 5，-GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3，，
[0011] C 引物 5' -GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-S，；
[0012] 3)PCR反應(yīng)體系配置：總體積25μ L，引物A為0· 5μ L、B為L 0μ L、C為L 0μ L(引 物母液濃度均為10 μ mol/L)，dNTP為2. 0 μ L(母液濃度為lOmmol/L)，模板DNA為20? lOOng，TaqDNA聚合酶為I. 0U，Buffer (含Mg2+)為2. 5 μ L，其余用去離子水補(bǔ)齊；
[0013] 4)PCR擴(kuò)增：將配置好的PCR體系放到PCR儀器中運(yùn)行，運(yùn)行條件為：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，59°C退火 45s，72°C延伸 90s，35 個循環(huán)；72°C延伸 7min ;
[0014] 5)PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液3?8μ L在I. 5%的瓊脂糖凝 膠上電泳，電泳條件為：恒電壓80?120V電泳20min ;瓊脂糖膠的第一個孔或最后一個孔 用來點DNAMarker,根據(jù)Markert條帶大小對比判斷PCR產(chǎn)物大小。
[0015] 6)PCR產(chǎn)物觀察及化學(xué)型判斷：將電泳結(jié)束后的凝膠在紫外儀下觀察，當(dāng)材料為 毒品型大麻時，只能觀察到由AB引物特異擴(kuò)增出的大小約550bp的標(biāo)記條帶；當(dāng)材料為纖 維型時，只能觀察到由AC引物特異擴(kuò)增出的大小約1050bp的標(biāo)記條帶，而當(dāng)材料為中間型 時，則能同時觀察到上述550bp和1050bp大小的兩個標(biāo)記。
[0016] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果：
[0017] 1)本發(fā)明具有操作簡單、周期短、成本低廉等優(yōu)點。不受植株生長環(huán)境、取樣時間 和取樣部位的影響，通過常規(guī)的分子生物學(xué)實驗手段即可一次性鑒定出大麻化學(xué)型。
[0018] 2)本發(fā)明適合對我國不同來源地區(qū)的大麻種質(zhì)資源進(jìn)行化學(xué)型鑒定，可作為工業(yè) 大麻新品種選育過程中低毒大麻材料篩選的技術(shù)方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 圖1是48份大麻資源復(fù)合PCR擴(kuò)增情況，Sl?S48為48份材料編號；M為DNA分 子 Marker(Trans2K Plus II DNA Marker)。

【具體實施方式】
[0020] 下面結(jié)合具體實施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。
[0021] 一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定我國不同來源地大麻資源化學(xué)型的方法，包括以下步驟：
[0022] 1)大麻植物基因組DNA提取：研究材料為我國不同地理來源地的大麻資源，以種 子種植的方式統(tǒng)一種植在云南省昆明市。采用植物常規(guī)CTAB法來提取大麻基因組DNA，提 取對象為大麻植株快速生長期的幼嫩葉樣組織。取0. 5g葉樣用液氮或機(jī)器研磨，采用常規(guī) 2 X CTAB提取方法，提取的DNA晾干后用12. 5 μ g/ml的RNaseA水溶液溶解，并于37°C下水 浴lh。DNA溶液經(jīng)0. 8%瓊脂糖電泳及分光光度計檢測濃度和質(zhì)量后，用去離子水稀釋到濃 度為50ng/L，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0023] 2)復(fù)合PCR引物設(shè)計：合成三條引物，引物合成量均為20D。按照引物合成說明， 用去離子水將引物稀釋到l〇ymol/L，-20°C保存?zhèn)溆?。序列分別為：
[0024] A 引物 5' -AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3，，
[0025] B 引物 5，-GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3，，
[0026] C 引物 5，-GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-3,;
[0027] 3)PCR反應(yīng)體系配置：總體積25μ L，引物A為0. 5μ L、B為1. 0μ L、C為1. 0μ L，引 物母液均為 l〇ymol/L ;dNTP為 2.0yL，母液為 lOmmol/L ;模板 DNA為 lyL(50ng) JaqDNA 聚合酶為I. OU buffer (含Mg2+)為2. 5 μ L，其余用去離子水補(bǔ)齊；PCR薄壁管及相關(guān)試劑 均為普通PCR耗材和試劑。
[0028] 4) PCR擴(kuò)增：將配置好的PCR體系放到PCR儀中運(yùn)行，運(yùn)行條件為：94°C預(yù)變性 4min ;94°C變性 30s，59°C退火 45s，72°C延伸 90s，35 個循環(huán)；72°C延伸 7min ;
[0029] 5)瓊脂糖電泳：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5. 0 μ L在I. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳， 電泳條件為：恒電壓（100V)條件下電泳20min ;
[0030] 6)PCR產(chǎn)物觀察及化學(xué)型判斷：將電泳結(jié)束后的凝膠在紫外儀下觀察，當(dāng)材料為 毒品型大麻時，AB引物可特異擴(kuò)增出大小約550bp的標(biāo)記條帶；當(dāng)材料為纖維型時，AC引物 可特異擴(kuò)增出大小約1050bp標(biāo)記條帶，而當(dāng)材料為中間型（II型）時，可同時擴(kuò)增出550bp 和1050bp大小的兩個標(biāo)記。具體電泳圖結(jié)果見圖1 ;
[0031] 7)復(fù)合PCR判斷大麻化學(xué)型有效性驗證：上述48份資源均采集雌株始果期的頂 部花葉，并采用高效液相色譜法檢測花葉中THC和CBD的化學(xué)含量，根據(jù)大麻化學(xué)型分類方 法鑒定每份資源的化學(xué)型，資源化學(xué)型及電泳判斷結(jié)果見表1。由表1化學(xué)型同電泳吻合情 況可知，該實驗48個樣品中只有S9的電泳圖不夠清晰，不能從電泳圖來判定化學(xué)型，其余 判定結(jié)果均和基于化學(xué)含量判定的化學(xué)型相符合，有效率為98%。
[0032] 表1我國48份大麻資源化學(xué)型及復(fù)合PCR判定情況
[0033]

【權(quán)利要求】
1. 一種一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法，其特征在于，包括以下步驟： 1) 大麻植物基因組DNA提?。翰捎弥参锍Ｒ?guī)CTAB法來提取大麻基因組DNA，提取對象 可以為大麻任何生長環(huán)境下的任何生長時期、任何組織，提取的基因組DNA用于后續(xù)PCR反 應(yīng)中的模板； 2) 復(fù)合PCR引物設(shè)計：合成三條引物，序列分別為： A 引物 5 ' -AGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCG-3'， B 引物 5' -GGAAAAATTGAAGAGAAGTAACCA-3'， C 引物 5，-GCCTTGCTTCTCCCAACTACATA-3'; 3. PCR反應(yīng)體系配置：總體積25yL，引物A為0. 5yL、B為1.0yL、C為l.OyL，引物 母液均為 10 μ mol/L ;dNTP 為 2. 0 μ L，母液為 10mmol/L ;模板 DNA 為 20 ?100ng，TaqDNA 聚 合酶為1. 0U，含Mg2+的Buffer為2. 5 μ L，其余用去離子水補(bǔ)齊； 4. PCR擴(kuò)增：將配置好的PCR體系放到PCR儀器中運(yùn)行，運(yùn)行條件為：94°C預(yù)變性4min ; 94°C變性 30s，59°C退火 45s，72°C延伸 90s，35 個循環(huán)；72°C延伸 7min ; 5) 瓊脂糖電泳：PCR反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液3?8 μ L在1. 5%的瓊脂糖凝膠上電泳，電 泳條件為：恒電壓80?120V電泳20min ; 6. PCR產(chǎn)物觀察及化學(xué)型判斷：將電泳結(jié)束后的凝膠在紫外成像儀下觀察，當(dāng)材料為 毒品型大麻時，AB引物可特異擴(kuò)增出大小約550bp的標(biāo)記條帶；當(dāng)材料為纖維型時，AC引 物可特異擴(kuò)增出大小約1050bp的標(biāo)記條帶；而當(dāng)材料為中間型時，可同時擴(kuò)增出約550bp 和1050bp大小的兩個標(biāo)記。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一次復(fù)合PCR反應(yīng)鑒定大麻植物化學(xué)型的方法，其特征在于， 步驟1)中所述優(yōu)選提取對象為大麻植物新鮮幼嫩組織。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293934SQ201410505113
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】陳璇, 郭鴻彥, 楊明, 郭孟璧, 張慶瀅, 許艷萍, 郭蓉, 陳裕 申請人:云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所