一種人γδT細(xì)胞的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了一種人γδT細(xì)胞的制備方法，屬細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域；所述人γδT細(xì)胞的制備包括如下步驟：步驟一、用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原；步驟二、用純化所得結(jié)核桿菌耐熱性抗原活性組分刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)加入舒林酸和甘草多糖；步驟三、細(xì)胞培養(yǎng)3天后半量更換含有舒林酸、甘草多糖的培養(yǎng)液，保持細(xì)胞密度；步驟四、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第7天收獲細(xì)胞。針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，本發(fā)明提供一種制備周期短、純度高、殺傷效果好、細(xì)胞繁殖快、制備成本低的γδT細(xì)胞，確保成品符合要求。
【專利說(shuō)明】—種人Y δ T細(xì)胞的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬細(xì)胞免疫學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種人Y δ T細(xì)胞的制備方法。

【背景技術(shù)】
[0002]T淋巴細(xì)胞根據(jù)表達(dá)T細(xì)胞抗原受體(Τ cell receptor, TCR)的不同分為兩類:TCRa β T細(xì)胞和TCR Y δ T細(xì)胞，分別簡(jiǎn)稱為α β T細(xì)胞和Y δΤ細(xì)胞。其中Y δ T細(xì)胞是介于特異性免疫與非特異性免疫之間的一種特殊類型的細(xì)胞，大多數(shù)為CD4和CD8分子雙陰性，少數(shù)可表達(dá)⑶8分子。Y δ T細(xì)胞主要分布于皮膚和黏膜組織，一般不超過(guò)T細(xì)胞總數(shù)的5%。Y δ T細(xì)胞具有特異性識(shí)別抗原而無(wú)MHC限制性，具有抗感染、抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等功能，是機(jī)體免疫監(jiān)視的第一道防線。但由于Y ST細(xì)胞在外周血和腫瘤組織中含量不高，要獲得大量高細(xì)胞毒活性的Y S T細(xì)胞是十分困難的。雖然已有技術(shù)通過(guò)抗TCR Y δ抗體或非肽磷酸類抗原獲得大量Y S T細(xì)胞，這無(wú)疑會(huì)增加其制備的成本。因此開發(fā)一種實(shí)用、高效、快速體外大量?jī)?yōu)勢(shì)擴(kuò)增人外周血Y S T細(xì)胞的方法，對(duì)于Y δ T細(xì)胞免疫功能的研究，并用其提高病人免疫力、抵抗腫瘤和抗感染能力是非常重要的，對(duì)于攻克人類渴望解決的惡性腫瘤性疾病這一難題也是十分有價(jià)值的。
[0003]經(jīng)檢索發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在雖有一些技術(shù)方案公開了 Y δ T細(xì)胞的培養(yǎng)方法，但是制備周期較長(zhǎng)，純度不夠高，殺傷力不夠強(qiáng)。
[0004]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)缺陷，本發(fā)明提供一種制備周期短、純度高、殺傷效果好、細(xì)胞繁殖快、制備成本低的Y S T細(xì)胞，確保成品符合要求。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)中的缺陷，本發(fā)明的目的是提供一種人Y δ T細(xì)胞的制備方法。
[0006]本發(fā)明是通過(guò)以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0007]本發(fā)明提供一種人Y δ T細(xì)胞的制備方法，所述方法包括如下步驟:
[0008]步驟一、用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原；
[0009]步驟二、用純化所得結(jié)核桿菌耐熱性抗原活性組分刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)加入含舒林酸和甘草多糖的RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；
[0010]步驟三、培養(yǎng)2?3天后半量更換所述培養(yǎng)液；
[0011 ] 步驟四、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第7天收獲細(xì)胞。
[0012]優(yōu)選地，步驟一中，所述用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原，具體包括如下步驟:
[0013]Α、將預(yù)處理過(guò)的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物，接種于蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I?2周；然后將其分裝到含有新生牛血清的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)；再繼續(xù)于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)I?2周；收集培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，離心得核桿菌菌體；
[0014]B、將收集的核桿菌菌體經(jīng)生理鹽水洗滌，再用蒸餾水重懸浮菌體，高壓蒸汽處理，取上清經(jīng)0.22 μ m微孔微孔濾膜得結(jié)核桿菌耐熱性抗原。
[0015]優(yōu)選地，步驟A中，所述預(yù)處理的時(shí)間為5?15分鐘。
[0016]優(yōu)選地，所述預(yù)處理具體為:將備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物加入到硫酸溶液或者氫氧化鈉溶液中，震蕩混勻，離心收集菌體。
[0017]更優(yōu)選地，所述硫酸溶液的體積濃度為0.5%;所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.2mg/ml ο
[0018]更優(yōu)選地，所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與硫酸溶液的體積比為1:(1?3);所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與氫氧化鈉溶液的體積比為1: (2?6)。
[0019]優(yōu)選地，步驟B中，所述高壓蒸汽處理的條件為120°C、15分鐘。
[0020]優(yōu)選地，步驟二中，所述純化具體操作為:將步驟一所得核桿菌耐熱性抗原快速通過(guò)蛋白液相色譜儀的分子篩型S-100層析柱和離子交換型Mono Q層析柱。
[0021 ] 優(yōu)選地,步驟二中，所述活性組分包括Mtb-Ag高M(jìn)r蛋白組分(Mtb-HW-Ag)、Mtb低Mr 多肽組分(Mtb-LW-Ag)或 Mtb-Ag 峰 3 單一主肽(Mtb_Ag_Pk3)。
[0022]優(yōu)選地，步驟二中，所述用純化所得結(jié)核桿菌耐熱性抗原活性組分刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)加入舒林酸和甘草多糖，具體包括:采集外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞；將單個(gè)核細(xì)胞置于含有唑來(lái)膦酸、舒林酸、甘草多糖、0.05mg/ml自體血漿、50?100IU/ml結(jié)核桿菌耐熱性純化抗原活性組分的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，調(diào)細(xì)胞密度為I?2X105/ml，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板，于37°C、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
[0023]優(yōu)選地，所述唑來(lái)膦酸的濃度為0.01?lng/ml。
[0024]優(yōu)選地,步驟二和步驟三中，所述舒林酸、甘草多糖的濃度為0.1?0.5ng/mL.
[0025]優(yōu)選地，步驟四中，所述細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)具體表現(xiàn)為:20?28小時(shí)可見(jiàn)Y δ T細(xì)胞沉于培養(yǎng)器皿的底部，并趨于集落化；30?40小時(shí)集落開始變大；培養(yǎng)5?7天即可以看到大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)I個(gè)小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形；臺(tái)盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)。
[0026]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下的有益效果:
[0027](I)本發(fā)明制備方法簡(jiǎn)單，細(xì)胞培養(yǎng)周期短，大大降低培養(yǎng)成本；
[0028](2)本發(fā)明制備方法通過(guò)對(duì)結(jié)核桿菌培養(yǎng)物的預(yù)處理，獲得Mtb-Hag的速度快、純度高，結(jié)合能力強(qiáng)；
[0029](3)本發(fā)明通過(guò)用含有唑來(lái)膦酸、舒林酸、甘草多糖的培養(yǎng)液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，使得細(xì)胞增殖速度快，質(zhì)量好，純度高，活性強(qiáng)。

【具體實(shí)施方式】
[0030]下面結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)說(shuō)明。以下實(shí)施例將有助于本領(lǐng)域的技術(shù)人員進(jìn)一步理解本發(fā)明，但不以任何形式限制本發(fā)明。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)。這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0031]實(shí)施例1
[0032]本實(shí)施例涉及一種人Y δ T細(xì)胞，所述人Y δ T細(xì)胞的制備包括如下步驟:
[0033]步驟一、用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原，包括如下步驟:
[0034]Α、取Iml預(yù)處理過(guò)的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物(約菌數(shù)I X 13)，接種于200ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)I周，取出震蕩后，繼續(xù)培養(yǎng)I周；然后將其分裝到含有15%新生牛血清的150ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶50ml，分裝成4瓶；再繼續(xù)于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)2周；收集培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，得核桿菌菌體；
[0035]B、將收集的菌體經(jīng)生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，1200C高壓蒸汽處理15分鐘，取上清經(jīng)0.22 μ m微孔微孔濾膜得Mtb-Hag ；
[0036]步驟二、用純化所得Mtb-Hag活性組分刺激PBMCs，同時(shí)加入舒林酸和甘草多糖，具體步驟包括:
[0037]采集20ml患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活15分鐘后離心備用，無(wú)菌水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1:4的混合，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，吸取白膜層，無(wú)菌水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1500轉(zhuǎn)/分，均離心5分鐘，即得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0038]將上述分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞置于含有0.0 lng/ml唑來(lái)膦酸、0.lng/ml舒林酸、0.lng/ml甘草多糖、0.05mg/ml自體血衆(zhòng)、50IU/ml結(jié)核桿菌耐熱性純化抗原活性組分的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，調(diào)細(xì)胞密度為I?2父105/1111，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板，于371:、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0039]步驟三、細(xì)胞培養(yǎng)3天后半量更換含有舒林酸、甘草多糖的培養(yǎng)液，保持細(xì)胞密度為 I ?1.5 X1Vml ；
[0040]步驟四、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第7天收獲細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)即可見(jiàn)Y δΤ細(xì)胞沉于培養(yǎng)器皿的底部，并趨于集落化，30?40小時(shí)集落開始變大，培養(yǎng)5?7天即可以看到大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)I個(gè)小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形；取培養(yǎng)10天的細(xì)胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)；
[0041]分別取第O、3、5、7天的細(xì)胞，用含0.5%新生牛血清和0.01%疊氮納的磷酸緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 106/ml，每個(gè)檢測(cè)管內(nèi)加入50 μ I細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記抗體δ-ΡΕ)染色，4°C避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有I %多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)文件采用WinMDI軟件分析。
[0042]步驟一中，所述A中的預(yù)處理的時(shí)間為5分鐘；所述預(yù)處理具體為:將備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物加入到硫酸溶液或者氫氧化鈉溶液中，震蕩混勻，4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘收集菌體；所述硫酸溶液的濃度為0.5% (體積比)；所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.2mg/ml ;所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與硫酸溶液的體積比為1:1 ;所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與氫氧化鈉溶液的體積比為1:2。
[0043]優(yōu)選地，步驟二中，所述純化具體為:將步驟一所得Mtb-Hag快速通過(guò)蛋白液相色譜儀的分子篩型S-100層析柱和離子交換型Mono Q層析柱；所述活性組分包括Mtb-Ag高M(jìn)r蛋白組分(Mtb-HW-Ag)、Mtb低Mr多肽組分(Mtb-LW-Ag)和Mtb-Ag峰3單一主肽(Mtb-Ag-Pk3)。
[0044]實(shí)施例2
[0045]本發(fā)明提供一種人Y δ T細(xì)胞，所述人Y δ T細(xì)胞的制備包括如下步驟:
[0046]步驟一、用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原，包括如下步驟:
[0047]Α、取Iml預(yù)處理過(guò)的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物(菌數(shù)I X 13)，接種于200ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)I周，取出震蕩后，繼續(xù)培養(yǎng)I周；然后將其分裝到含有15%新生牛血清的150ml的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，每瓶50ml，分裝成4瓶；再繼續(xù)于37 °C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)2周；收集培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，經(jīng)4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘，得核桿菌菌體；
[0048]B、將收集的菌體經(jīng)生理鹽水洗滌2次，再用2倍體積的蒸餾水重懸浮菌體，1200C高壓蒸汽處理15分鐘，取上清經(jīng)0.22 μ m微孔微孔濾膜得Mtb-Hag ；
[0049]步驟二、用純化所得Mtb-Hag活性組分刺激PBMCs，同時(shí)加入舒林酸和甘草多糖，具體步驟包括:
[0050]采集20ml患者外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞，具體步驟為:1500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，吸取上層血漿層，56°C滅活15分鐘后離心備用，無(wú)菌水對(duì)倍稀釋沉淀的血細(xì)胞，人淋巴細(xì)胞分離液與稀釋血液按1:4的混合，2000轉(zhuǎn)/分，離心20分鐘，吸取白膜層，無(wú)菌水洗滌2次，轉(zhuǎn)速分別為1500轉(zhuǎn)/分，均離心5分鐘，即得到外周血單個(gè)核細(xì)胞；
[0051]將上述分離的外周血單個(gè)核細(xì)胞置于含有l(wèi)ng/ml唑來(lái)膦酸、0.5ng/ml舒林酸、0.5ng/ml甘草多糖、0.05mg/ml自體血衆(zhòng)、100IU/ml結(jié)核桿菌耐熱性純化抗原活性組分的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，調(diào)細(xì)胞密度為I?2父105/1111，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板，于371:、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；
[0052]步驟三、細(xì)胞培養(yǎng)3天后半量更換含有舒林酸、甘草多糖的培養(yǎng)液，保持細(xì)胞密度為 I ?1.5X 106/ml ；
[0053]步驟四、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第7天收獲細(xì)胞；將細(xì)胞培養(yǎng)24小時(shí)即可見(jiàn)Y δΤ細(xì)胞沉于培養(yǎng)器皿的底部，并趨于集落化，40?50小時(shí)集落開始變大，培養(yǎng)7天即可以看到大的集落和不規(guī)則的單個(gè)核細(xì)胞，對(duì)培養(yǎng)7天的細(xì)胞進(jìn)行瑞姬氏染色，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)胞體積增大，呈橢圓形或不規(guī)則形，細(xì)胞核大多為橢圓形或圓形，核染色疏松，核膜不規(guī)則，有突起，每個(gè)細(xì)胞可見(jiàn)I個(gè)小核仁，呈深藍(lán)色；胞質(zhì)豐富，染成灰藍(lán)色，形態(tài)不規(guī)則，有偽足，近核處有淡染現(xiàn)象，也有呈不規(guī)則形；取培養(yǎng)7天的細(xì)胞100 μ 1，加入100 μ 10.4%臺(tái)盼藍(lán)染色液，活細(xì)胞不染色，死細(xì)胞染成藍(lán)色，顯微鏡下計(jì)數(shù)；
[0054]分別取第0、3、5、7天的細(xì)胞，用含0.5%新生牛血清和0.01%疊氮納的磷酸緩沖液洗滌2次，調(diào)整細(xì)胞密度為I X 106/ml，每個(gè)檢測(cè)管內(nèi)加入50 μ I細(xì)胞懸液，加入熒光標(biāo)記抗體δ-ΡΕ)染色，4°C避光孵育30分鐘，用上述PBS洗滌2次，加入含有I %多聚甲醛的PBS溶液固定后，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)，數(shù)據(jù)文件采用WinMDI軟件分析。
[0055]步驟一中，所述A中的預(yù)處理的時(shí)間為15分鐘；所述預(yù)處理具體為:將備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物加入到硫酸溶液或者氫氧化鈉溶液中，震蕩混勻，4000轉(zhuǎn)/分，離心30分鐘收集菌體；所述硫酸溶液的濃度為0.5% (體積比)；所述氫氧化鈉溶液的濃度為0.2mg/ml ;所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與硫酸溶液的體積比為1:3 ;所述備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物與氫氧化鈉溶液的體積比為1:6。
[0056]優(yōu)選地，步驟二中，所述純化具體為:將步驟一所得Mtb-Hag快速通過(guò)蛋白液相色譜儀的分子篩型s-100層析柱和離子交換型Mono Q層析柱；所述活性組分包括Mtb-Ag高M(jìn)r蛋白組分(Mtb-HW-Ag)、Mtb低Mr多肽組分(Mtb-LW-Ag)和Mtb-Ag峰3單一主肽(Mtb-Ag-Pk3)。
[0057]殺傷活性檢測(cè)
[0058]對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的細(xì)胞的殺傷活性進(jìn)行測(cè)試，具體操作及結(jié)果如下:
[0059]取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的K562細(xì)胞株作為靶細(xì)胞，并調(diào)整細(xì)胞密度為2 X 105/ml、I X 15/ml、5X 104/ml，每孔取100 μ I鋪于96孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24小時(shí)，取本發(fā)明制備的細(xì)胞調(diào)密度為I XlOfVml，加入96孔培養(yǎng)板中，使效靶比分別為10:1、20:1和40:1，各密度設(shè)3個(gè)復(fù)孔并分別設(shè)置空白對(duì)照，培養(yǎng)48小時(shí)后每孔加入濃度為5mg/ml的MTT20 μ I，繼續(xù)培養(yǎng)4小時(shí)后棄上清，每孔加入DMS0100 μ 1，于A570nm和A630nm處測(cè)吸光度(A)值，計(jì)算出絕對(duì)A值(A = A570-A630)，按下式計(jì)算殺傷活性:殺傷活性(％ ) = (A靶細(xì)胞+A效應(yīng)細(xì)胞一A效靶混合細(xì)胞)/A靶細(xì)胞X 100% ;
[0060]結(jié)果顯示:實(shí)施例1制備的Y δ T細(xì)胞對(duì)Κ562細(xì)胞株具有較高的殺傷活性，殺傷率平均為95% (η = 8);實(shí)施例2制備的Y δ T細(xì)胞對(duì)Κ562細(xì)胞株具有較高的殺傷活性，殺傷率平均為98% (η = 8)。
[0061]純度檢測(cè)
[0062]對(duì)實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的Y δ T細(xì)胞的純度進(jìn)行測(cè)試:分別取培養(yǎng)7天的實(shí)施例1、實(shí)施例2制備的Y δ T細(xì)胞，用PE標(biāo)記Y δ T細(xì)胞單抗及流式細(xì)胞儀分析所制備的YδT細(xì)胞的純度；
[0063]結(jié)果顯示:實(shí)施例1的Y δ T細(xì)胞純度為92.8% ;實(shí)施例1的Y δ T細(xì)胞純度為93.5%。
[0064]細(xì)朐增葙諫率檢測(cè)
[0065]對(duì)實(shí)施例1制備人Y δ T細(xì)胞過(guò)程中細(xì)胞增殖速率進(jìn)行檢測(cè)，具體方法如下:分別在Y 3!'細(xì)胞過(guò)程中的第1、3、5、7天取樣，酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為45011111的吸光度(A)，并用以下公式計(jì)算增值率:
[0066]增值率=[(八第3天-八第1天)/八第1天+ (八第5天-八第3天)/八第3天+ (八第7天-八第5天)/八第5
天]/3X100% ;重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次；
[0067]結(jié)果顯示:本發(fā)明方法制備人Y δ T細(xì)胞過(guò)程中，細(xì)胞增值率接近20%。
[0068]以上對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以在權(quán)利要求的范圍內(nèi)做出各種變形或修改，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。
【權(quán)利要求】
1.一種人Y S T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟: 步驟一、用培養(yǎng)的結(jié)核桿菌制備結(jié)核桿菌耐熱性抗原； 步驟二、用純化所得結(jié)核桿菌耐熱性抗原活性組分刺激外周血單個(gè)核細(xì)胞，同時(shí)加入含舒林酸和甘草多糖的RPMI1640培養(yǎng)液對(duì)外周血單個(gè)核細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)； 步驟三、培養(yǎng)2?3天后半量更換所述培養(yǎng)液； 步驟四、根據(jù)細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)，第6?8天收獲，即得人Y δΤ細(xì)胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟一中具體包括如下步驟: Α、將預(yù)處理過(guò)的結(jié)核桿菌培養(yǎng)物，接種于蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)，于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)I?2周；然后將其分裝到含有新生牛血清的蘇通式液體培養(yǎng)基內(nèi)；再繼續(xù)于37°C培養(yǎng)箱內(nèi)靜止培養(yǎng)I?2周；收集培養(yǎng)的細(xì)菌懸液，離心得核桿菌菌體； B、將收集的核桿菌菌體經(jīng)生理鹽水洗滌，再用蒸餾水重懸浮菌體，高壓蒸汽處理，取上清經(jīng)0.22 μ m微孔微孔濾膜得結(jié)核桿菌耐熱性抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述預(yù)處理的時(shí)間為5?15分鐘。
4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟A中，所述預(yù)處理具體為:將備用結(jié)核桿菌培養(yǎng)物加入到硫酸溶液或者氫氧化鈉溶液中，震蕩混勻，離心收集菌體。
5.根據(jù)權(quán)利要求2所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟B中，所述高壓蒸汽處理的條件為120°C、15分鐘。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述步驟二具體包括: 采集外周靜脈血，經(jīng)聚蔗糖-泛影葡糖胺密度梯度離心獲得單個(gè)核細(xì)胞；將單個(gè)核細(xì)胞置于含有唑來(lái)膦酸、舒林酸、甘草多糖、0.05mg/ml自體血衆(zhòng)、50?100IU/ml結(jié)核桿菌耐熱性純化抗原活性組分的RPMI1640培養(yǎng)液內(nèi)，調(diào)細(xì)胞密度為I?2X 105/ml，轉(zhuǎn)入細(xì)胞培養(yǎng)板，于37°C、5% CO2和飽和濕度的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述唑來(lái)膦酸的濃度為 0.01 ?lng/ml。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人YS T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟二中，所述純化具體包括:將步驟一所得核桿菌耐熱性抗原快速通過(guò)蛋白液相色譜儀的分子篩型S-100層析柱和離子交換型Mono Q層析柱。
9.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，步驟二中，所述活性組分包括Mtb-Ag高M(jìn)r蛋白組分、Mtb低Mr多肽組分或Mtb-Ag峰3單一主肽中的一種或幾種。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或6所述的人Yδ T細(xì)胞的制備方法，其特征在于，所述舒林酸、甘草多糖的濃度為0.1?0.5ng/ml。
【文檔編號(hào)】C12N5/0783GK104293734SQ201410510228
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年9月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月28日
【發(fā)明者】馬孟 申請(qǐng)人:上海云舜生物技術(shù)有限公司