焦磷酸測序法檢測sil-tal1融合基因的引物對及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種焦磷酸測序法檢測SIL-TAL1融合基因的引物對及包含所述引物對的試劑盒，該試劑盒能夠一次性檢測SIL-TAL1(type II)和SIL-TAL1(type III)兩種融合基因。通過對SIL-TAL1融合基因的mRNA設計引物，經(jīng)過逆轉錄PCR后對產(chǎn)物進行測序分析，本試劑盒可以實現(xiàn)SIL-TAL1融合基因的快速、準確、高通量的檢測。
【專利說明】焦磷酸測序法檢測SIL-TAL1融合基因的引物對及試劑盒

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明屬于分子生物學領域，具體涉及一種焦磷酸測序法檢測SIL-TALl融合基 因的引物對，包含所述引物對的試劑盒及該試劑盒的應用。

【背景技術】
[0002] SIL-TALl融合基因包括SIL-TALl(typeII)、SIL-TALl(typeIII)等多種類型， 常見于T細胞急性淋巴細胞白血?。═-ALL)中。
[0003] 當前國內外廣泛使用的分子生物學檢測SIL-TALl融合基因的方法中，熒光原位 雜交技術（FISH)只能進行定性檢測、操作復雜；突光定量PCR存在著檢測通量的局限性，所 以都還不能真正滿足臨床診斷檢測的需要。傳統(tǒng)的固相生物芯片（Biochip)或基因芯片技 術存在著可重復性差、靈敏度不夠好以及操作繁瑣的突出弱點。
[0004] 焦磷酸測序技術（Pyrosequencing)是新一代DNA序列分析技術，具備同時對大量 樣品進行測序分析的能力，為高通量、低成本、快速、直觀地進行核苷酸分析和臨床檢驗提 供了非常理想的技術操作平臺。


【發(fā)明內容】

[0005] 發(fā)明目的：針對現(xiàn)有技術中存在的技術問題，本發(fā)明提出一種焦磷酸測序法 同時檢測SIL-TALl融合基因的引入對以及含有所述引物對的試劑盒，可以同時檢測 SIL-TALUtypeII)和SIL-TALUtypeIII)兩種融合基因，具有高靈敏度、高特異性、高準 確度、檢測迅速等優(yōu)點。
[0006] 技術方案：為實現(xiàn)上述技術目的，本發(fā)明提出了一種焦磷酸測序法同時檢測 SIL-TALl融合基因的引物對，所述的SIL-TALl為SIL-TALl(typeII)和SIL-TALUtype III)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對包括：
[0007] (1)對于SIL-TALl(typeII)基因，
[0008] 擴增引物為：
[0009]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0010]下游引物：5，-TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3，，
[0011] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0012] 測序引物為：
[0013] 5， -AGAGGCCTGCAGTTAC-3，；
[0014] (2)對于SIL-TALl(typeIII)基因：
[0015] 擴增引物：
[0016]上游引物：5'-CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'，
[0017]下游引物：5'-GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0018] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0019] 測序引物：
[0020] 5'-GGCCTGCAGTTACGCT-Si 。
[0021] 本發(fā)明進一步提出了一種焦磷酸測序法檢測SIL-TALl融合基因的試劑盒，該試 劑盒包含上述的引物，具體地，所述試劑盒包含如下引物：
[0022] (1)對于SIL-TALl(typeII):
[0023] 擴增引物：
[0024]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0025]下游引物：5，-TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3，，
[0026] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0027] 測序引物：
[0028] 5; -AGAGGCCTGCAGTTAC-3;；
[0029] (2)對于SIL-TALl(typeIII):
[0030] 擴增引物：
[0031]上游引物：5'-CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'，
[0032]下游引物：5'-GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0033] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0034] 測序引物：
[0035]5'-GGCCTGCAGTTACGCT-3，。
[0036] 更具體地，所述試劑盒還包括質控品。所述質控品包括陽性對照品和陰性對照 品，其中，所述的陽性對照品為含有SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)的質粒 的混合液，所述的陰性對照品作為對照，與陽性對照品相比為不含SIL-TALUtypeII)和 SIL-TALl(typeIII)的質粒溶液。
[0037] 本發(fā)明還提出了上述引物對及包含上述引物對的試劑盒在制備檢測SIL-TALl融 合基因的試劑中的應用。
[0038] 有益效果：與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的焦磷酸測序法檢測SIL-TALl融合基因的試 劑盒能夠實現(xiàn)快速、簡便、高效、準確的檢測SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)融 合基因，為制備用于檢測SIL-TALl(typeII)和SIL-TALl(typeIII)融合基因的試劑提供 了理論基礎。

【具體實施方式】
[0039] 實驗材料：
[0040] 引物由invitrogen公司合成；Trizol購自invitrogen公司；逆轉錄cDNA合成試 劑盒購置于Fermentas公司；多重PCR試劑盒購置于QIAGEN公司；焦磷酸測序試劑購置于 QIAGEN公司。
[0041] 一種焦磷酸測序法檢測SIL-TALl融合基因的試劑盒，所述的SIL-TALl為 SIL-TALUtypeII)和SIL-TALl(typeIII)中的任意一種或兩種，包括質控品和如下引 物：
[0042] (I)SIL-TALl(typeII)：
[0043] 擴增引物：
[0044]上游引物：5，-TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3，，
[0045]下游引物：5' -TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-S'，
[0046] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0047] 測序引物：
[0048]5'-AGAGGCCTGCAGTTAC-3，，
[0049] (2)SIL-TALl(type III)：
[0050] 擴增引物：
[0051]上游引物：5' -CCTCCCAAAATGCTGATCG-3，，
[0052]下游引物：5' -GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，，
[0053] 其中下游引物的5'端進行生物素標記；
[0054] 測序引物：
[0055]5'-GGCCTGCAGTTACGCT-3，。
[0056] 其中，質控品（質控品DNA)包括陽性對照品和陰性對照品，所述的陽性對照品為 含有SIL-TALl (type II)和SIL-TALl (type III)的質粒的混合液；所述的陰性對照品作 為陰性對照，與陽性對照品相比，陰性對照品為不含SIL-TALl (type II)和SIL-TALl (type III)的質粒溶液。
[0057] 檢測方法包括如下步驟：
[0058] ( -）RNA提?。?br> [0059] 取20個T-ALL患者的臨床樣本；1-20號患者的臨床樣本分別按照下面的步驟提 取RNA :
[0060] (1)淋巴細胞提?。喝⌒迈r全血2ml加Iml3wt%檸檬酸鈉，混勻后在4°C下 3000r/min離心lOmin，取血球層上淺黃色層即為淋巴細胞，得到淋巴細胞液；
[0061] (2)取1個離心管（經(jīng)DEPC水處理）加入⑴中的淋巴細胞液150μ1，然后加 ImlTrizol，室溫放置5min，使其充分裂解；
[0062] (3) 12,OOOr/min離心 5min，取上清；
[0063] (4)向上清中加入200μ1氯仿，劇振蕩混勻后室溫放置15min;
[0064] (5) 4°C12,OOOg下離心 15min;
[0065](6)吸取上層水相，將水相轉移至另一離心管中；
[0066] (7)向水相中加入500μ1異丙醇混勻，室溫放置5?IOmin;
[0067] (8)4°C12,OOOg下離心IOmin,棄上清，RNA沉于管底；
[0068] (9)向步驟⑶的管中加入Iml75% (v/v)乙醇，溫和振蕩離心管，懸浮沉淀；
[0069](10)4°C8,OOOg離心 5min，盡量棄上清；
[0070] (11)室溫晾干或真空干燥5?IOmin ;
[0071] (12)用50ulRNase-freedH20 溶解RNA樣品，55 ?6(TC，5 ?IOmin;
[0072] (13)測OD值定量RNA濃度。
[0073] 按照上述步驟，分別獲得1-20號樣本的mRNA。
[0074](二）多重逆轉錄PCR擴增：
[0075] 按照如下方法對上述的1-20號樣本的mRNA進行多重逆轉錄PCR擴增：
[0076] (l)cDNA第一鏈的合成
[0077] ①取一RNase-free的離心管，置于冰上，建立下列反應體系；
[0078]TotalRNA 5~10 μg/3μ I
[0079] Oligo (dT) 18 Primer (0. 5 μ g/μ I) I μ I
[0080] RNase-free dH20 加至12 μ I
[0081] 輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；
[0082] ②離心管于70°C溫育5分鐘，之后迅速取出置于冰中冷卻，用冷凍離心機稍微離 心收集管壁上的反應液到管底；
[0083] ③將離心管放置于冰上，按順序加入以下反應液；
[0084] 5Xreactionbuffer 4μI
[0085]RNaseInhibitor(20U/μI) IμI
[0086] IOmMdNTPsMix 2 μ I
[0087] 輕輕混勻反應液，用冷凍離心機稍微離心收集管壁上的反應液到管底；
[0088] ④離心管于37°C溫育5分鐘；
[0089]⑤加入 1μIRevertAidTMReverseTranscriptase(200U/μ1)，終體積為 20μ1;
[0090] ⑥離心管于42°C反應60分鐘；
[0091] ⑦離心管于70°C加熱10分鐘終止反應，之后迅速取出置于冰中冷卻。
[0092]如此，合成cDNA第一鏈，即模板cDNA(Template cDNA)。
[0093] (2)多重PCR
[0094] 采用的是QIAGEN公司的MultiplexPCR試劑盒，體系如下
[0095]TemplatecDNA或質控品DNA 10μ1
[0096] 2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix 25μI
[0097]IOXPrimermix 5μI
[0098] RNase-free dH20 10 μ I
[0099] 終體積為50μI
[0100]其中，2XQIAGENMultiplexPCRMasterMix中含熱啟動TaqDNA酶、MgCljPdNTP Mix;10XPrimermix為包含上述三種融合基因引物對的混合物。
[0101]PCR擴增程序：95°C 15min ;94°C 30s，55°C 90s，72°C 90s，35個循環(huán)；72°C IOmin ; 4 C保溫。
[0102] 通過上述步驟，獲得PCR產(chǎn)物。
[0103] (三）焦磷酸測序
[0104] 首先，用微珠固定PCR產(chǎn)物，其主要是將生物素標記的PCR產(chǎn)物固定到鏈霉親和素 包被的瓊脂糖微珠（StreptavidinSepharoseHighPerformance)上，包括如下步驟：
[0105](1)輕搖包被鏈霉親和素的瓊脂糖微珠，直至獲得均質溶液；
[0106] (2)在一個試管中混合鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠總量（2μ1/樣品）與結合緩 沖液（40μ1/樣品），添加超純水至一定體積，該體積與后續(xù)所要添加優(yōu)化好的生物素標記 的PCR產(chǎn)物的體積的總和為80μ1/孔；
[0107] (3)將⑵中得到的一定體積的溶液添加至24孔PCR孔板中；
[0108] (4)根據(jù)孔板設置，添加5?20μ1優(yōu)化好的生物素標記的PCR產(chǎn)物至PCR孔板的 每個孔槽，使其中每孔所含溶液為80μ1;
[0109] (5)使用孔板條蓋密封PCR孔板，確?？撞壑g沒有泄漏；
[0110] (6)使用振蕩混合器（HOOrpm)不斷振蕩PCR孔板至少5?10分鐘。
[0111] 經(jīng)過上述步驟，生物素標記的PCR產(chǎn)物被固定到鏈霉親和素包被的瓊脂糖微珠 上。
[0112] 接著，開始真空工作站準備工作，包括如下步驟：
[0113] (1)準備以下試劑：大約50ml70% (v/v)乙醇；大約40ml變性溶液（QIAGEN公 司）；大約50mlIX洗滌緩沖液（QIAGEN公司））；大約50ml超純水；大約70ml超純水；
[0114] (2)打開真空泵：打開真空開關，進行測試試驗，以確定過濾探針是否正常工作；
[0115] (3)每次使用真空泵前要用超純水檢測過濾探針的通透性，將事先準備好的裝好 超純水的離心管插在PCR裝置上，將過濾探針降入超純水中，超純水如在20秒內被抽空則 表明過濾探針正常，可以使用，反之則需更換過濾探針；
[0116] (4)取下振蕩好的PCR孔板，將樣品放入PCR裝置中，小心降下過濾探針至PCR孔 板中，停留15秒；確保溶液全部被吸走，以捕獲含有固定模板的微珠；
[0117] (5)將真空裝置移至含有70% (v/v)乙醇的第一試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0118] (6)將真空裝置移至含有變性溶液的第二試劑槽，沖洗過濾探針5秒；
[0119] (7)將真空裝置移至含有洗滌緩沖液的第三試劑槽，沖洗過濾探針10秒；
[0120] (8)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0121] (9)握持真空裝置到Q24孔板上，關閉裝置上的真空開關并懸空停留5秒，讓負壓 散去；
[0122] (10)通過左右輕搖真空裝置，釋放珠子至含3種測序引物的孔板中；
[0123](11)在真空裝置關閉的情況下將真空裝置轉移至含有超純水的第四試劑槽，振蕩 10秒；
[0124] (12)降下探針至另一個含超純水的第五試劑槽中并施加真空，清洗探針，用70ml 超純水沖洗過濾探針；
[0125] (13)抬高真空裝置超過90°垂線5秒，從過濾探針中排液；
[0126] (14)關閉真空裝置上的開關，并將其置于靜止（P)位。
[0127] 如此變完成了真空站的準備工作，接著開始分離DNA單鏈并將樣品釋放到 PyroMarkQ24孔板中，具體地包括如下步驟：
[0128] (1)將PyroMarkQ24孔板放置在預熱的孔板底座上80°C精確加熱2分鐘；
[0129] (2)從孔板底座上取下孔板，使樣本在室溫下至少冷卻5分鐘。
[0130] 經(jīng)過上述步驟，樣品被杯釋放到PyroMarkQ24孔板中。接著準備PyroMarkQ24 試劑，按下述步驟進行：
[0131] (1)打開PyroMarkQ24試劑盒并取出含有酶和底物凍干粉的小瓶，以及含有核苷 酸的試管；
[0132] (2)按照試劑盒說明書用超純水溶解并分裝酶和底物，所有試劑需恢復室溫后再 使用；
[0133] (3)依照電腦程序計算出的體積，向試劑倉內加入酶、底物和核苷酸A、T、G、C(試 劑倉最多使用30次，試劑倉在使用前必須是干燥的）。
[0134] 準備好PyroMarkQ24試劑后，在PyroMarkQ24儀器上按下述步驟進行測試：
[0135] (1)打開PyroMarkQ24 軟件，點擊newassay(新測試）一newAQassay(新 AQ測試）一在sequencetoanalyze(待分析序列）中輸入突變點序列，點擊Generate DispensationOrder(產(chǎn)生分配順序），點擊保存；
[0136] (2)點擊newrun(新運行）一Instrumentmethod(儀器方法）一007,然后點擊 要測序的格子，點擊保存至U盤；
[0137] (3)將含有運行文件的U盤插入儀器前面的USB端口中；
[0138] (4)把加熱好的孔板放到儀器上；
[0139] (5)將試劑倉（酶、底物和核苷酸）的標簽面面向自己放入儀器，打開孔板支座架 放入孔板，關閉孔板支座架和儀器蓋；
[0140] (6)選擇Run(運行），并按OK;
[0141] (7)在進入Run(運行）后，按select(選擇）選擇要運行的文件；
[0142] (8)儀器運行結束并確認運行文件已保存至U盤后，按close，取出U盤；
[0143] (9)打開儀器，取出試劑倉，并對其進行反復清洗，廢棄孔板；
[0144] (10)當儀器不運行時，從主菜單選擇shutdown(關機）并按OK;
[0145] (11)當Itisnowsafetoturnofftheinstrument(現(xiàn)在可以安全關機）出現(xiàn) 時，即可關閉儀器，電源開關位于儀器后面。
[0146] (四）結果分析：
[0147] 打開PyromarkQ24 軟件，分析SIL-TAL1(typeII)和SIL-TAL1(typeIII)融合 基因的類型，分析結果如下表：
[0148]

【權利要求】
1. 一種焦磷酸測序法檢測SIL-TAL1融合基因的引物對，所述的SIL-TAL1為 SIL-TALl(type II)和SIL-TALl(type III)中的任意一種或兩種，其特征在于，所述引物對 包括： (1) 對于 SIL-TALl(type II)基因， 擴增引物為： 上游引物：5' -TACCCTGCAAACAGACCTCAGCT-3'， 下游引物：5' -TTCCCCCTTTTTCGCTGAGA-3'， 其中下游引物的5'端進行生物素標記； 測序引物為： 5; -AGAGGCCTGCAGTTAC-3;； (2) 對于 SIL-TALl(type III)基因： 擴增引物為： 上游引物：5' -CCTCCCAAAATGCTGATCG-3'， 下游引物：5' -GTCTTTGCTTTCCCCCTTTTTC-3，， 其中下游引物的5'端進行生物素標記； 測序引物： 5' -GGCCTGCAGTTACGCT-3'。
2. -種焦磷酸測序法檢測SIL-TAL1融合基因的試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含 如權利要求1所述的引物對。
3. 根據(jù)權利要求2所述的試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括質控品，所述質控品 包括陽性對照品和陰性對照品。
4. 根據(jù)權利要求3所述的試劑盒，其特征在于，所述的陽性對照品為含有 SIL-TALl(type II)、SIL-TALl(type III)的質粒的混合液，所述的陰性對照品為不含 SIL-TAL1 (type II)、SIL-TAL1 (type III)的質粒溶液。
5. 權利要求1所述的引物對在制備檢測SIL-TAL1融合基因的試劑中的應用。
6. 權利要求2或3所述的試劑盒在制備檢測SIL-TAL1融合基因的試劑中的應用。
【文檔編號】C12Q1/68GK104278093SQ201410510911
【公開日】2015年1月14日 申請日期:2014年9月28日 優(yōu)先權日:2014年9月28日
【發(fā)明者】邵棠, 李玲, 陳慶, 段彪 申請人:南京百捷生物科技有限公司