檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片以及試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片和試劑盒。本發(fā)明基因芯片和檢測試劑盒可以準(zhǔn)確、有效的檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒，且特異性強(qiáng)、靈敏度高、耗時(shí)短，檢測快速，應(yīng)用前景良好。
【專利說明】檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜 合征病毒的基因芯片以及試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病 毒的基因芯片以及試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 多病原混合感染是當(dāng)前豬場疫病的普遍現(xiàn)象，豬繁殖與呼吸綜合征、豬瘟、豬流行 性乙型腦炎這三種豬病毒引起的疾病癥狀相似且常常呈混合感染，是當(dāng)前危害養(yǎng)豬業(yè)的3 種重要病毒性疾病，因此早期鑒別診斷并及時(shí)了解流行狀況對控制這3種病的流行顯得尤 其重要。目前對這3種病的診斷多采用病原的分離及常規(guī)的血清學(xué)方法，但需時(shí)間較長。最 近國外和國內(nèi)均建立了病原的分離鑒定、免疫膠體金技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、血清中和實(shí) 驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)等，但是還不能更加快速的檢測多種病原的混合感染。
[0003] 基因芯片技術(shù)是近年來新興起的一種生物高新技術(shù)，該技術(shù)可以同時(shí)定量或定性 的檢測成千上萬個(gè)基因信息，具有無選擇性、客觀、高通量的特點(diǎn)。基因芯片計(jì)劃開展后， 許多部門、大學(xué)、重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室及制藥公司參與了該項(xiàng)目的研發(fā)，我國相繼也成立了一大批 基因芯片公司。隨著基因組數(shù)據(jù)的增長以及分子生物學(xué)相關(guān)學(xué)科的快速發(fā)展，基因芯片技 術(shù)得到迅猛發(fā)展和廣泛應(yīng)用。但生物芯片技術(shù)發(fā)展時(shí)間較短，很多技術(shù)還處于初級研發(fā)階 段，要成為實(shí)驗(yàn)室研究或臨床可以普遍采用的技術(shù)仍有諸多關(guān)鍵問題亟待解決。（1)基因芯 片的特異性的提高；(2)增加信號檢測的靈敏度；(3)簡化樣品制備和標(biāo)記操作；(4)設(shè)備 與操作人員的要求較高；(5)應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。
[0004] 目前，昊時(shí)友等，"豬病毒性繁殖障礙綜合征基因芯片診斷方法的建立"，中國畜牧 獸醫(yī)學(xué)會動(dòng)物傳染病學(xué)分會第十二次學(xué)術(shù)研討會，2007年公開了檢測日本乙型腦炎病毒、 豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒等6種病毒的基因芯片，但是該文件中沒有芯片靈敏 度試驗(yàn)，不能說明其可以靈敏地檢出乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種新的特異性強(qiáng)、靈敏度高的可同時(shí)檢測豬 流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片和試劑盒。
[0006] 本發(fā)明檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因 芯片，它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID N0 :1或2所示 任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，SEQ ID N0 :3或4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段， 以及SEQ ID N0 :5或6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段。
[0007] 基因芯片，是指指通過不同方法將生物分子（寡核苷酸、CDNA 、genomic DNA、多肽、 抗體、抗原等）固著于硅片、玻璃片（珠）、塑料片（珠）、凝膠、尼龍膜等固相遞質(zhì)上形成的 生物分子點(diǎn)陣，其突出的特點(diǎn)是微型化、集成化、平行化和高通量。
[0008] 優(yōu)選地，它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID N0:19所示的基因片段。
[0009]本發(fā)明檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑 盒，它包括前述的基因芯片與擴(kuò)增豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合 征病毒的基因的試劑，其中，擴(kuò)增豬流行性乙型腦炎病毒的試劑包括 SEQ ID N0:7?8和/ 或SEQ ID NO :9?10所示引物對；擴(kuò)增豬瘟病毒基因的試劑包括SEq ID N〇:n?12和/ 或SEQ ID N0 :13?14所示引物對；擴(kuò)增豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑 包括SEQ IDN0 :15?I6和/或SEQ ID N0 :17?18所示引物對。
[0010]優(yōu)選地，所述引物對中，SEQ ID NO :7、9、11、13、15、17所示上游引物與3￡〇10腸： 8、10、12、14、16、18所示下游引物的摩爾比分別為50:1、40:1、80:1、80:1、20:1、10:1。
[0011] SEQ ID N0 :7 ?8、SEQ ID N0 :9 ?10、SEQ ID N0 :11 ?12、SEQ ID N0 :13 ?14、 SEQ ID NO :15?l6和SEQ ID NO :17?l8所示引物對以及SEQ ID NO :1?6所示寡核苷 酸片段。 _2] SEQ ID N0 :1或2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，SEq ID N0 :3或4所示 任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，以及SEQ ID N0 :5或6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸 片段在制備檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片 中的用途。優(yōu)選地，它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID N0:19所示的基因片段。
[0013] SEQ ID N0 :7 ?8 和 / 或 SEQ ID N0 :9 ?10 所示引物對、SEQ ID N0 :11 ?12 和 /或SEQ ID N0 :13?14所示引物對以及SEQ ID N0 :15?16和/或SEQ ID N0 :17?18 所示引物對，與SEQ ID N0 :1?2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段、SEQ ID N0 :3?4所示 任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段以及SEQ ID N0 :5?6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段在制備 檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒中的用途；其 中，引物對為擴(kuò)增試劑；SEQ ID N0 :1?6為檢測探針。
[0014] 所述試劑盒還包括SEQ ID N0 :20?21所示引物對以及SEQ ID N0 :19所示定位 探針。
[0015] 本發(fā)明基因芯片和試劑盒可以有效檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁 殖與呼吸綜合征病毒，敏感性高，三種病毒的最低檢測濃度均為10 4c〇PieS/μ L，特異性強(qiáng)， 耗時(shí)短，檢測快速，具有良好的應(yīng)用前景。
[0016] 以下通過實(shí)施例形式的【具體實(shí)施方式】，對本發(fā)明的上述內(nèi)容作進(jìn)一步的詳細(xì)說 明。但不應(yīng)將此理解為本發(fā)明上述主題的范圍僅限于以下的實(shí)施例。凡基于本發(fā)明權(quán)利要 求書記載的內(nèi)容所實(shí)現(xiàn)的技術(shù)均屬于本發(fā)明的范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0017] 圖1DNA微陣列的矩陣排列情況；
[0018] 圖2Prm/M基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0019] 圖3JEV-C基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0020] 圖4Erns基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0021] 圖5CSF1基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0022] 圖6PS9基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0023] 圖7Y11基因熒光與非熒光引物工作濃度的優(yōu)化；
[0024] 圖8特異性實(shí)驗(yàn)檢測結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 一、實(shí)驗(yàn)材料和儀器
[0026] 毒株：
[0027] 豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV)毒株、豬瘟病毒（CSFV)毒株和豬流行性乙型腦 炎病毒（JEV)毒株，購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0028] 試劑：
[0029] 總RNA抽提試劑盒，為天根（北京）生化科技有限公司產(chǎn)品；primeScriptTMRT reagent Kit(Perfect Real Time)，為寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品；小量質(zhì)粒提取試 劑盒、小量膠回收試劑盒，均為OMEGA(美國）生物技術(shù)公司產(chǎn)品。
[0030] :B__氨基載玻片、2X點(diǎn)樣緩沖液、Baio?預(yù)雜交緩沖液、Baio? 雜交緩沖液，均購自上海百傲科技有限公司；Cy3-dCTP:25nmol，PA53021, Lot300989, Amersham Biosciences，UK ;洗液 I :〇. 1% SDS 2XSSC ;洗液 Π :〇· 1% SDS 0· 2XSSC ;洗 液III :0. 2XSSC ;洗液4 :雙蒸水。
[0031] 儀器：
[0032] 超凈工作臺：SW-CJ-2FD，蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司；
[0033] 超純水儀：Milli Qplus，法國產(chǎn)；
[0034] 梯度 PCR 儀：PX2, Thermo hybaid，美國產(chǎn)；
[0035] 高速冷凍離心機(jī)3K18型：SiffiiaR，德國產(chǎn)；
[0036] Mini-SUB凝膠電泳裝置：Bio-Radlb意大利產(chǎn)；
[0037] 電泳儀：POWER Pac300，Bk-RADR,意大利產(chǎn)；
[0038] 凝膠電泳圖像分析系統(tǒng)2〇〇〇型：Bio-RAD?，意大利產(chǎn)；
[0039] 丨旦溫?fù)u床：Thermo Forma,美國產(chǎn)；
[0040]核酸蛋白檢測儀：Bi〇-RAD，SmartSpaee TM 3010 ;
[0041 ] 分子雜交儀：Thermo,美國產(chǎn)；
[0042]多樣品圍欄、多樣品圍欄粘貼工具、多樣品圍欄蓋片，芯片雜交盒均為北京博奧生 物公司；
[0043]晶芯? SmartArrayer?48,微陣列芯片點(diǎn)樣系統(tǒng)：Capitalbio Corporation，北京 博奧生物公司；
[0044]晶芯傷LUXScan?10K微陣列芯片掃描儀：Capitalbio Corporation，北京博奧生 物公司；
[0045] 真空機(jī)：SinBo,香港；
[0046] C02恒溫培養(yǎng)箱：Thermo,美國產(chǎn)。
[0047] 實(shí)施例1本發(fā)明基因芯片的制備
[0048] 1、材料和儀器
[0049]同前述實(shí)驗(yàn)材料和儀器。
[0050] 2、實(shí)驗(yàn)方法 t〇〇51] 2· 1PCR引物、檢測探針的制備
[0052] (1)設(shè)計(jì)病原特異性探針：通過對GenBnak中收錄的豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟 病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒核酸序列對位排列分析，選定保守區(qū)域序列：J EV c、M、E、 NS1、NS5;CSFV 5，UTR、3，UTR、Npro、Erns、E2;PRRSV 5，UTR、0RFlb、0RF5、0RF6、0RF7。針 對保守序列設(shè)計(jì)檢測探針，從中挑選出特異性強(qiáng)的探針序列。
[0053] (2)設(shè)計(jì)探針序列的特異性引物：針對上述保守探針序列，利用生物信息學(xué)軟件 Primer5設(shè)計(jì)特異性引物。特異性引物由大連寶生物公司合成。
[0054] (3)探針制備：用小量病毒/液體樣本RNA/DNA抽提試劑盒提取豬流行性乙型腦 炎病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒，利用上述特異性引物對三種病原核酸進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，純化濃度測定。
[0055] PCR擴(kuò)增體系及條件：
[0056]
[0057]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯 片，其特征在于：它包括固相載體以及固定在固相載體上的探針；所述探針包括SEQ ID NO: 1或2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，SEQ ID NO :3或4所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核 苷酸片段，以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基因芯片，其特征在于：它還包括定位探針，定位探針是SEQ ID NO :19所示的基因片段。
3. -種檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒， 其特征在于：它包括權(quán)利要求1或2所述的基因芯片與擴(kuò)增豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病 毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因的試劑；其中，擴(kuò)增豬流行性乙型腦炎病毒基因的試 劑包括SEQ ID NO :7?8和/或SEQ ID NO :9?10所示引物對；擴(kuò)增豬瘟病毒基因的試 齊抱括SEQ ID NO : 11?12和/或SEQ ID NO :13?14所示引物對；擴(kuò)增豬瘟病毒和豬繁 殖與呼吸綜合征病毒基因的試劑包括SEQ ID NO: 15?16和/或SEQ ID NO: 17?18所示 引物對。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：它還包括SEQ ID NO :20?21所示引 物對。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的試劑盒，其特征在于：所述引物對中，SEQ ID N0:7、9、ll、13、 15、17所示上游引物與SEQ ID NO :8、10、12、14、16、18所示下游引物的摩爾比分別為50:1、 40:1、80:1、80:1、20:1、10:1。 6. SEQ ID NO :7 ?8、SEQ ID NO :9 ?10、SEQ ID NO : 11 ?12、SEQ ID NO :13 ?14、 SEQ ID NO :15?16和SEQ ID NO :17?18所示引物對以及SEQ ID NO :1?6所示寡核苷 酸片段。 7. SEQ ID NO :1或2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，SEQ ID NO :3或4所示任 意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片段，以及SEQ ID NO :5或6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)寡核苷酸片 段在制備檢測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的基因芯片中 的用途。
8. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的用途，其特征在于：所述基因芯片還包括定位探針，定位探針 是SEQ ID N0:19所示的基因片段。 9. SEQ ID NO :7 ?8 和 / 或 SEQ ID NO :9 ?10 所示引物對、SEQ ID NO :11 ?12 和 / 或SEQ ID N0:13?14所示引物對以及SEQ ID N0:15?16和/或SEQ ID N0:17?18所 示引物對，與SEQ ID NO :1?2所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段、SEQ ID NO :3?4所示任 意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段以及SEQ ID NO :5?6所示任意一個(gè)或者兩個(gè)基因片段在制備檢 測豬流行性乙型腦炎病毒、豬瘟病毒和豬繁殖與呼吸綜合征病毒的試劑盒中的用途；其中， 引物對為擴(kuò)增試劑；SEQ ID NO :1?6為檢測探針。
10. 根據(jù)權(quán)利要求9所述的用途，其特征在于：所述試劑盒還包括SEQ ID NO :20?21 所示引物對以及SEQ ID NO :19所示定位探針。
【文檔編號】C12R1/93GK104232800SQ201410513328
【公開日】2014年12月24日 申請日期:2014年9月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月29日
【發(fā)明者】文心田, 曹三杰, 黃小波, 鄧靜, 文翼平, 伍銳, 姜來生, 尹人杰, 趙松, 常曉霞 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)