鴨瘟病毒UL15基因exonI重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了鴨瘟病毒UL15基因exonI重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用，鴨瘟病毒UL15基因exonI重組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，其制備方法是將含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌Rossetta在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后取菌液轉(zhuǎn)接入新鮮的含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至OD600為0.4時(shí)，加入IPTG誘導(dǎo)培養(yǎng)，得含鴨瘟病毒UL15基因exonI重組蛋白的培養(yǎng)液，所得重組蛋白具有免疫活性，能夠與鴨瘟病毒抗體特異性結(jié)合，可作為鴨瘟病毒抗體的檢測試劑；還可以作為抗原制備多克隆抗體，為鴨瘟病毒的檢測奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】鴨瘟病毒UL15基因 exon I重組蛋白及其制備方法和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物化學(xué)領(lǐng)域，具體涉及鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白，還涉及 該重組蛋白的制備方法和應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 鴨癌（Duck Plague，DP)是由皰疫病毒科中的鴨癌病毒（Duck plague virus，DPV) 引起的鴨、鵝和天鵝等水禽的一種急性、熱性、接觸性傳染的敗血性傳染病。該病可導(dǎo)致商 品水禽產(chǎn)蛋量下降及死亡，對野生水禽也有不同的致死率。近年來，隨著養(yǎng)鴨業(yè)生產(chǎn)向集約 化、規(guī)模化的方向發(fā)展，鴨瘟作為威脅養(yǎng)鴨業(yè)最嚴(yán)重的接觸性傳染病之一，造成了巨大的經(jīng) 濟(jì)損失。
[0003] 臨床和實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)證實(shí)鴨瘟病毒弱毒疫苗是預(yù)防控制鴨瘟病毒的有效生物制劑， 而對鴨瘟病毒特異性抗體的監(jiān)測是評價(jià)鴨瘟病毒弱毒疫苗免疫效果及制定合理的免疫程 序的關(guān)鍵。目前對于檢測鴨瘟病毒抗體的方法多數(shù)是基于鴨瘟病毒全病毒作為抗原的檢測 方法，但是這種方法易散毒，并且抗原制備較為復(fù)雜且純度不夠理想，這些都使這種方法不 具有推廣性。另外對于鴨瘟病毒的檢測研究也需要特異性的抗體。近年來不同的鴨瘟病毒 毒株相繼被報(bào)道如CHv株、2085株、VAC株、Clone-03株、C-KCE株，這些毒株中部分基因存 在明顯差異。那么我們又如何可以快速準(zhǔn)確并簡便的檢測到不同毒株的鴨瘟病毒，使其不 因?yàn)槎局甑牟煌斐蓹z測方法的麻煩，那么就需要選取在不同毒株間都相對保守并特異 的蛋白進(jìn)行其抗體的制備，從而用來檢測鴨瘟病毒。因此研究和應(yīng)用在鴨瘟病毒間保守的 UL15基因原核表達(dá)產(chǎn)物對于鴨瘟病毒的預(yù)防和控制具有重要的理論和臨床意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此,本發(fā)明的目的之一在于提供鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白；本發(fā) 明的目的之二在于提供鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的制備方法，本發(fā)明的目的之三 在于提供鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白在制備鴨瘟病毒抗體捕獲劑中的應(yīng)用；本發(fā)明 的目的之四在于提供鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白在制備抗鴨瘟病毒多克隆抗體的 抗原中的應(yīng)用。
[0005] 為實(shí)現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：
[0006] 1、鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白，所述鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白 的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0007] 優(yōu)選的，編碼所述鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
[0008] 2、所述鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的制備方法，包括如下步驟：將含有重 組表達(dá)載體的大腸桿菌Rossetta在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜，然后取菌液按 體積比為1 :50?1 :100接入含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至0D600為0. 4?0. 6時(shí)，力口 入IPTG至終濃度為0. 2?I. 2mmol/L，在溫度為25?37°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)2?6小時(shí)，收 集培養(yǎng)菌液，培養(yǎng)菌液中含有鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白；
[0009] 所述重組表達(dá)載體為將SEQ ID NO. 3所示核酸序列通過BamHI和XhoI連接原核 表達(dá)質(zhì)粒PPAL7而得。
[0010] 優(yōu)選的，所述IPTG的終濃度為0? 2mmol/L。
[0011] 優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)為在37°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)4小時(shí)。
[0012] 更優(yōu)選的，誘導(dǎo)培養(yǎng)后還包括純化步驟，將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，收集菌體，菌體 用pH8. 0的20mmolTris-HCl懸浮；置-20°c過夜后按lmg/mL加溶菌酶，4°C攪拌30min，冰 浴下超聲波間歇破碎菌體，然后離心收集包涵體，收集的包涵體用含lOmmol/L PBS、2mol/L 尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為〇. 2%的Triton X-100的洗液重復(fù)洗滌5-10次，洗滌后離心收集沉淀， 最后沉淀用含lOmmol/L PBS和8mol/L尿素溶液溶解沉淀；得純化的鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白。
[0013] 優(yōu)選的，純化后還包括復(fù)性步驟：將純化好的鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋 白加入復(fù)性稀釋緩沖液，然后裝入透析袋中依次置于尿素濃度為8mol/L、6mol/L、4mol/L、 2mol/L、lmol/L和0mol/L的復(fù)性透析緩沖液中進(jìn)行復(fù)性，每12小時(shí)更換一次透析液，再 用PBS緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，最后用超濾管進(jìn)行超濾得復(fù)性的鴨瘟病毒UL15基因exonl 重組蛋白；所述復(fù)性稀釋緩沖液含 50mmol/L Tris-base、lmmol/L EDTA> lOOmmol/L NaCl> 0. 25mol/L L-精氨酸、0. lmmol/L氧化型谷胱甘肽、lmmol/L還原型谷胱甘肽和5%甘油（V/ V);所述復(fù)性透析緩沖液含含有 50mmol/L Tris_base、0. 5mol/L EDTA、150mmol/L NaCl 和 0.6mol/L L-精氨酸。
[0014] 最優(yōu)選的，所述離心是在4°C、10000r/min條件下離心10min。
[0015] 3、所述鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白在制備鴨瘟病毒抗體捕獲劑中的應(yīng)用。
[0016] 4、所述鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白在制備抗鴨瘟病毒多克隆抗體的抗原 中的應(yīng)用。
[0017] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明公開了鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白，該 蛋白是選取鴨瘟病毒中保守的UL15基因的exonl部分編碼的蛋白進(jìn)行表達(dá)，分子量約為 48kDa。通過基因工程技術(shù)，將鴨瘟病毒UL15基因exonl與原核表達(dá)載體pPAL7連接，轉(zhuǎn)化 大腸桿菌Rossetta表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行誘導(dǎo)，該方法適于工業(yè)化大規(guī)模生產(chǎn)，能夠?qū)崿F(xiàn)產(chǎn)品的標(biāo) 準(zhǔn)化。將表達(dá)獲得的產(chǎn)品經(jīng)Western blot進(jìn)行鑒定后，其表面具有與天然蛋白相似的免疫 反應(yīng)活性，可以與鴨瘟病毒抗體進(jìn)行特異性結(jié)合，作為檢測鴨瘟病毒抗體的檢測抗原，并且 由于該抗原非全病毒，用其檢測時(shí)無散毒危險(xiǎn)。此外鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白進(jìn) 行純化后可以作為抗原免疫小鼠，獲得了鼠抗UL15exonI重組蛋白多克隆抗體,該抗體可 以作為檢測鴨瘟病毒的檢測抗體，用于鴨瘟病毒的檢測，用其檢測鴨瘟病毒具有特異性強(qiáng)、 無交叉反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0018] 為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案和有益效果更加清楚，本發(fā)明提供如下附圖：
[0019] 圖1為鴨瘟病毒UL15基因exonl的PCR擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1為DNA Marker ;2為鴨瘟病毒UL15基因exonl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特異性 DNA條帶。
[0020] 圖2為pMD18-T_UL15exonI質(zhì)粒PCR及酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1為 DNA Marker ;2為鴨瘟病毒UL15基因exonl的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的特 異性DNA條帶；3為重組質(zhì)粒pMD18-T-UL15exonI用BamH I和Xho I雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng) 瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。
[0021] 圖3為pPAL7-UL15ex〇nI質(zhì)粒的PCR及雙酶切鑒定的瓊脂糖凝膠電泳圖；其中1 為DNA Marker ;2為鴨瘟病毒UL15基因exon I的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得 的特異性DNA條帶；3為重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7-UL15exonI用BamH I和Xho I雙酶切，酶切 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳所獲得的兩條特異性條帶。
[0022] 圖4為重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI表達(dá)的鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋 白的SDS-PAGE電泳圖；其中1為蛋白Marker ;2為重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7-UL15exonI用IPTG 誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果；3為空載 體PPAL7用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離心后，所得沉淀進(jìn)行SDS-PAGE電泳 的結(jié)果；4為重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7-UL15e X〇nI用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn)行超聲波破碎、離 心后，所得上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果；5為空載體pPAL7用IPTG誘導(dǎo)，得到的菌液進(jìn) 行超聲波破碎、離心后所得上清進(jìn)行SDS-PAGE電泳的結(jié)果。
[0023] 圖5為不同IPTG濃度下含有重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exon I的宿主菌Rossetta表 達(dá)鴨瘟病毒UL15exon I重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中1為蛋白Marker ;2為IPTG的 終濃度為Ommol/L ;3為IPTG的終濃度為0. 2mmol/L ;4為IPTG的終濃度為0. 4mmol/L ;5 為IPTG的終濃度為0. 6mmol/L ;6為IPTG的終濃度為0. 8mmol/L ;7為IPTG的終濃度為 I. Ommol/L ;8 為 IPTG 的終濃度為 I. 2mmol/L。
[0024] 圖6為不同溫度下含有重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的宿主菌Rossetta表達(dá)鴨瘟 病毒UL15基因exon I重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中1為蛋白Marker ;2為誘導(dǎo)溫度 為37°C ;3為誘導(dǎo)溫度為30°C ;4為誘導(dǎo)溫度為25°C。
[0025] 圖7為不同誘導(dǎo)時(shí)間下含有重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exon I的宿主菌Rossetta表達(dá) 鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的SDS-PAGE電泳圖；其中1為蛋白質(zhì)Marker ;2為誘導(dǎo) Oh ;3為誘導(dǎo)2h ;4為誘導(dǎo)4h ;5為誘導(dǎo)6h ;6為誘導(dǎo)過夜。
[0026] 圖8為尿素洗滌純化后的鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白SDS-PAGE電泳圖； 1為蛋白Marker ;2為未純化的鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白；2為純化后的鴨瘟病 毒UL15基因exonl重組蛋白。
[0027] 圖9為鴨抗鴨瘟血清與鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的western-blot圖； 1為鴨抗鴨瘟IgG與鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白的反應(yīng)條帶，2為蛋白Marker。
[0028] 圖10為鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白鼠抗多克隆抗體的效價(jià)檢測結(jié)果圖； 中間孔為鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白液，周邊孔為血清，稀釋的比例依次為：未稀 釋、1 :2、1 :4、1 :8、1 :16、1 :32。
[0029] 圖11為鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白鼠抗多克隆抗體對鴨瘟病毒的檢測 結(jié)果圖；其中a、b、c為感染鴨瘟病毒12h的細(xì)胞飛片，d、e、f為感染鴨瘟病毒24h的細(xì)胞 飛片，g、h、i為感染鴨瘟病毒48h的細(xì)胞飛片，j、k、1為未感染鴨瘟病毒的陰性對照。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面將結(jié)合附圖，對本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例進(jìn)行詳細(xì)的描述。實(shí)施例中未注明具體 條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如分子克隆實(shí)驗(yàn)指南（第三版，J.薩姆布魯克等 著）中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
[0031] 本發(fā)明中部分氨基酸相應(yīng)的縮寫如下：
[0032] 谷酰胺gin Q ;甘氨酸gly G ;絲氨酸ser S ;丙氨酸ala A ;蘇氨酸t(yī)hr T ;繳氨酸 val V ;異亮氨酸ile I ;亮氨酸leu L ;酪氨酸t(yī)yr Y ;苯丙氨酸phe F ;組氨酸his H ;脯氨 酸pro P ;天冬酰胺asn N ;甲硫氨酸met M ;谷氨酸glu E ;色氨酸t(yī)rp W ;賴氨酸Iys K ;半 胱氨酸cys C;精氨酸arg R;天冬氨酸Asp D。
[0033] 實(shí)施例1、鴨瘟病毒UL15基因exonl重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建
[0034] (1)菌株、質(zhì)粒和毒株
[0035] 質(zhì)粒PMD18-T購自大連寶生物工程有限公司；原核表達(dá)質(zhì)粒pPAL7購自Bio-Rad 公司（貨號(hào)為：156_3002);大腸桿菌（Escherichia coli)DH5 a、大腸桿菌（Escherichia coli) Rossetta和鴨瘟病毒（DPV) CHv強(qiáng)毒株由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)禽病研究中心提供。
[0036] (2)試驗(yàn)動(dòng)物
[0037] 10日齡鴨胚，鴨胚的種鴨DPV和DPV抗體均為陰性。
[0038] (3)鴨瘟病毒UL15基因exonl的克隆
[0039] 根據(jù)鴨瘟病毒UL15基因exon I的DNA序列設(shè)計(jì)一對引物，上游引物為5' -Rgat ccatcagtggcgtattatgtg-3' (SEQ ID NO. 1)，下劃線表示 BamH I 酶切位點(diǎn)，共 25bp，5' 端 位于起始密碼子前第45位；下游引物為5' -ctcgagaaagcattactcaagactcaag-3' (SEQ ID NO. 2)，下劃線表示Xho I酶切位點(diǎn)，共28bp，5'端位于終止密碼子后第36位，預(yù)期產(chǎn)物為 1158bp (不包括內(nèi)切酶序列則為1146bp)。將設(shè)計(jì)的引物序列提交上海生工生物工程有限 公司合成，將合成的引物用滅菌去離子水溶解，使其終濃度為20mmol/L，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0040] 鴨瘟病毒基因組DNA的提取，具體步驟如下：
[0041] a、鴨胚成纖維細(xì)胞（DEF)的制作方法：取IOd日齡健康鴨胚，分別用體積分?jǐn)?shù)為 5%碘酒和體積分?jǐn)?shù)為75%酒精消毒蛋殼表面，無菌條件下將胚體取出并用PBS將胚體洗 凈,剪去頭、翅、腿和內(nèi)臟,PBS沖洗后將胚體剪成Imm 3大小的小塊，加PBS適量，之后置于三 角瓶內(nèi)，加細(xì)胞分散劑（體積分?jǐn)?shù)為2. 5 %胰蛋白酶）150 ii L/胚，于37°C水浴中消化3min， 消化后將細(xì)胞懸液以4000r/min離心5min，傾棄上清，細(xì)胞沉淀用適量的MEM懸浮后，用6 層紗布過濾，向?yàn)V液中加入體積分?jǐn)?shù)為10%小牛血清和100IU/mL雙抗（青霉素和鏈霉素終 濃度分別為l〇〇IU/mL和IOOii g/mL)后，分裝于IOOmL細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，7mL/瓶，然后水平靜 置于37°C細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)；
[0042] b、鴨瘟病毒增殖：取剛剛長成致密單層的DEF，棄生長營養(yǎng)液，用滅菌PBS清洗細(xì) 胞表面2次后，加入DPV CHv 0. 1M0I覆蓋細(xì)胞表面進(jìn)行吸附，37°C吸附Ih后棄病毒液，然后 加含3%小牛血清和100幾/1^雙抗（青霉素和鏈霉素終濃度分別為100幾/1^和10011 8/ mL)的MEM維持營養(yǎng)液，之后37°C培養(yǎng)；同時(shí)以未接毒的DEF對照；
[0043] c、DNA提取方法：直接從感染的DEF中提取DPV基因組DNA，具體步驟如下：（1)選 取用DPV種毒感染后細(xì)胞病變（CPE)達(dá)80 %的DEF ;⑵傾去細(xì)胞培養(yǎng)液，加入500 ii L的細(xì) 胞裂解液，同時(shí)加蛋白酶K至終濃度為200 ii g/mL，輕輕混勻后，37°C孵育10分鐘；（3)將細(xì) 胞懸浮液倒入EP離心管中，并用500 L的飽和酚洗滌殘存于細(xì)胞瓶內(nèi)的裂解物，倒入離心 管中；（4)用飽和酚：氯仿（I: 1)及氯仿抽提2次，再用水飽和乙醚處理2次；（5)加1/10倍 體積3mol/L NaAC，混勻后，加入2倍體積冷無水乙醇，-20°C放置30-60分鐘；（6) 13000r/ 分鐘離心20分鐘，沉淀用預(yù)冷的體積分?jǐn)?shù)為70 %的乙醇洗滌兩次；（7)真空抽干后，溶于適 量TE緩沖液中，加入I ii L RNA酶，37°C作用30分鐘，-20°C保存?zhèn)溆谩?br> [0044] 同時(shí)選取細(xì)胞形態(tài)正常的DEF作對照。
[0045] 然后以提取的鴨瘟病毒基因組DNA為模板，SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示 序列為引物擴(kuò)增鴨瘟病毒UL15基因exon I序列，PCR反應(yīng)體系如下：ddH20 7 iiL，模板 I ii L，PrimcSTAR? Max DNA聚合酶10 ii L，引物各I ii L，用水補(bǔ)齊20 ii L ;PCR反應(yīng)條件 為：98°C變性10sec，55°C退火15sec，72°C延伸30sec，循環(huán)數(shù)為35,然后取L PCR產(chǎn) 物在1%瓊脂糖凝膠上電泳，觀察擴(kuò)增片段的長度，結(jié)果如圖1所示。結(jié)果顯示，擴(kuò)增獲得 一條約1146bp的特異性DNA條帶，即獲得鴨瘟病毒UL15基因第一外顯子exonl，命名為 UL15ex 〇nI。目的條帶使用北京賽百盛基因技術(shù)有限公司DNA回收試劑盒回收，回收后取 7.51^膠回收產(chǎn)物加2.51^2\了 &9?〇?1^1，721：反應(yīng)30111111進(jìn)行加4，之后冰上放置2? 3min，然后與pMD18-T vector進(jìn)行連接，在16°C的條件下連接過夜，得pMD18-UL15exon I。
[0046] (4) DH5 a感受態(tài)細(xì)胞的制備
[0047] 采用氯化鈣法制備大腸桿菌DH5 a感受態(tài)細(xì)胞，具體步驟如下：（1)無菌挑取平板 上新鮮培養(yǎng)的DH5 a單克隆菌落接種于5mL LB培養(yǎng)液中，于37°C振蕩培養(yǎng)過夜；（2)取ImL 上述培養(yǎng)液接種于IOOmL LB培養(yǎng)液中，37°C 200r/min振蕩培養(yǎng)2. 5?3h，使0D600 = 0. 5 左右；⑶將細(xì)菌培養(yǎng)物倒入滅菌后用冰預(yù)冷的離心管中，冰浴IOmin ; (4)于4°C 4000r/ min離心8min，棄上清；（5)加IOmL冰預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2，溫和懸起細(xì)菌沉淀，冰浴 30min ; (6)于4°C 4000r/min離心8min，棄上清，加4mL冰預(yù)冷的0. lmol/L的CaCl2再次重 懸沉淀，加入終濃度為15%的滅菌甘油，混勻后分裝為200 ii L/管，-4°C冰箱中保存過夜以 提高轉(zhuǎn)化效率。
[0048] (5)轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞
[0049] 將15iiL連接體系全部取出加到200iiL DH5a感受態(tài)細(xì)胞中，冰浴30min ;再置 于42°C溫浴90s，之后再冰浴2min ;然后立即加入0. 8mL LB培養(yǎng)基中，37°C水浴振蕩培養(yǎng) 45min，取200 ii L涂于含Amp的培養(yǎng)基上，置37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。次日挑取單個(gè)白色菌 落接種于含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C水浴振蕩培養(yǎng)18h后進(jìn)行質(zhì)粒抽提。
[0050] (6)重組質(zhì)粒的鑒定
[0051] 將上述抽提得到的重組質(zhì)粒pMD18-UL15exonI進(jìn)行PCR檢測，同時(shí)以BamH I和 Xho I雙酶切消化，然后米用1.0*%?規(guī)|父電泳觀察結(jié)果，結(jié)果如圖2所不。結(jié)果顯tj^，PCR檢 測和酶切得到預(yù)期的片段，表明UL15exon I成功連入pMD18-T載體中。然后將經(jīng)PCR和酶 切驗(yàn)證正確的質(zhì)粒送上海英駿生物有限公司進(jìn)行測序，測序獲得UL15ex 〇n I的核苷酸序列 如SEQ ID NO. 3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
[0052] (7)原核表達(dá)質(zhì)粒pPAL7_UL15exon I的構(gòu)建
[0053] 將 pMD18_UL15exon I 質(zhì)粒用 BamH I 和 Xho I 雙酶切，回收 UL15exon I 片段；同 時(shí)用BamH I和Xho I雙酶切原核表達(dá)載體pPAL7,回收載體骨架，將回收的UL15exon I片 段和載體骨架在16°C條件下連接過夜，得pPAL7-UL15exonI重組質(zhì)粒。
[0054] (8)原核表達(dá)質(zhì)粒pPAL7_UL15exon I的轉(zhuǎn)化
[0055] 將獲得的pPAL7_UL15exonI重組質(zhì)粒按照上述相同的方法轉(zhuǎn)化DH5 a感受態(tài)細(xì) 胞，同時(shí)使用原核表達(dá)載體PPAL7轉(zhuǎn)化DH5a感受態(tài)細(xì)胞和未轉(zhuǎn)化的DH5a感受態(tài)細(xì)胞作 為對照。然后將轉(zhuǎn)化細(xì)菌接種于5mL含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C水浴振搖培養(yǎng)過夜， 培養(yǎng)液用于提取重組質(zhì)粒，提取的重組質(zhì)粒用BamH I和Xho I雙酶切鑒定該重組質(zhì)粒，同 時(shí)進(jìn)行PCR檢測，將酶切產(chǎn)物和PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測，結(jié)果如圖3所示。 結(jié)果顯示，酶切結(jié)果和PCR檢測結(jié)果均與預(yù)期結(jié)果一致，表明重組原核表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功。
[0056] 實(shí)施例2、鴨瘟病毒UL15基因exonl的誘導(dǎo)表達(dá)
[0057] (1)重組質(zhì)粒 pPAL7_UL15exonI 的提取
[0058] 挑取已鑒定含陽性重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的DH5 a菌種劃線接種于含Amp 的LB瓊脂平板上，37°C培養(yǎng)過夜，次日取單個(gè)菌落接種于LB液體培養(yǎng)基上，劇烈振蕩培養(yǎng) 10?16小時(shí)，離心收集菌液，按UltraPureTM質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒說明進(jìn)行重組質(zhì)粒 的提取與純化。
[0059] (2)重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI轉(zhuǎn)化表達(dá)菌
[0060] 采用氯化鈣法制備大腸桿菌Rossetta感受態(tài)細(xì)胞，并將上述提取的重組質(zhì)粒 pPAL7-UL15exonI轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌大腸桿菌Rossetta中，并用含Amp的LB培養(yǎng)基篩選陽 性克隆。
[0061] (3)重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的誘導(dǎo)表達(dá)及可溶性分析
[0062] 將含有重組質(zhì)粒和含有PPAL7空載質(zhì)粒的大腸桿菌Rossetta，分別接種于5mL含 Amp的LB液體培養(yǎng)基，37°C培養(yǎng)過夜，次日取菌液按體積比為1:50的比例接入200ml含Amp 的LB液體培養(yǎng)基中，劇烈振蕩培養(yǎng)至0D600 = 0. 4時(shí)，分別加入IPTG至終濃度為0. 2_〇1/ L誘導(dǎo)培養(yǎng)，收集含有重組質(zhì)粒和含有PPAL7空載質(zhì)粒的菌液，分別按下步驟處理：4°C， lOOOOr/min離心 lOmin，菌體沉淀用 20mL 20mmol Tris-HCl(pH8.0)懸??；置-20°C過夜后， 加溶菌酶至終濃度為lmg/mL，4°C攪拌30min，超聲波（冰?。╅g歇破碎菌體（600w，3〇 sec/ 次，10次），4°C，10000r/min離心IOmin,取上清備用；沉淀用適量的8mol/L的尿素溶液 (10mm 〇l/L PBS+8mol/L尿素）溶解沉淀，低溫保存?zhèn)溆谩７謩e取適量的上清和尿素溶液 溶解的沉淀，向其中加入40 ii L超純水和10 ii L IOX SDS上樣緩沖液，KKTC水浴加熱變性 lOmin，進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色后觀察，結(jié)果如圖4所示，含 重組表達(dá)質(zhì)粒pPAL7-UL15eX〇nI的表達(dá)菌株在48kDa處有目的蛋白，而含pPAL7空載體的 表達(dá)菌株未見目的條帶表達(dá)。且表達(dá)的重組蛋白主要存在于沉淀中，表明重組表達(dá)蛋白在 菌體中以不溶的包涵體形式存在。
[0063] (4)重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI表達(dá)條件的優(yōu)化
[0064] a.誘導(dǎo)劑IPTG的濃度優(yōu)化
[0065] 取含重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的表達(dá)宿主菌大腸桿菌Rossetta,接種于5mL含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日按體積比為1:50轉(zhuǎn)接種于6份200ml 含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37 °C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D600值約0. 4?0. 6時(shí)，于6份培養(yǎng)基中分 別加入 IPTG 至終濃度為 0mmol/L、0. 2mmol/L、0. 5mmol/L、0. 8mmol/L> I. Ommol/L> I. 2mmol/ L，于37°C誘導(dǎo)4h后，然后按上述方法對樣品進(jìn)行處理，處理后用12%的SDS-PAGE電泳檢 測，結(jié)果如圖5所示。結(jié)果顯示，IPTG濃度為Ommol/L時(shí)無特異性蛋白條帶；當(dāng)IPTG濃度 為0. 2mmol/L時(shí)出現(xiàn)特異性蛋白條帶，但是隨IPTG濃度的增高，蛋白的表達(dá)量沒有繼續(xù)增 力口。因此，考慮到節(jié)約試劑材料，選擇0. 2mmol/L的IPTG濃度作為誘導(dǎo)表達(dá)濃度。
[0066] b.溫度條件優(yōu)化
[0067] 取含重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的表達(dá)宿主菌大腸桿菌Rossetta,接種于5mL含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日按體積比為1:50轉(zhuǎn)接種于3份200ml 含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C培養(yǎng)培養(yǎng)至0D600值約0. 4時(shí)，于3份培養(yǎng)基中加入IPTG 至終濃度為〇. 2mmol/L，然后分別置于25°C、30°C和37°C誘導(dǎo)2h，按上述方法對樣品進(jìn)行 處理，處理后用12%的SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖6所示。結(jié)果顯示，當(dāng)IPTG終濃度為 0. 2mmol/L時(shí)，當(dāng)溫度在25°C和30°C時(shí)，重組蛋白表達(dá)量較少，而當(dāng)穩(wěn)定為37°C時(shí)重組表達(dá) 量最多。因此，選擇溫度37°C作為最佳誘導(dǎo)溫度。
[0068] c.誘導(dǎo)時(shí)間優(yōu)化
[0069] 取含重組質(zhì)粒pPAL7_UL15exonI的表達(dá)宿主菌大腸桿菌Rossetta,接種于5mL含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振搖培養(yǎng)過夜。次日按體積比為1 :50轉(zhuǎn)接種于7份200ml含 Amp的LB液體培養(yǎng)基中，繼續(xù)培養(yǎng)至0D600值約0. 4時(shí)，加入IPTG至終濃度為0. 2mmol/L， 然后于37°C條件下分別誘導(dǎo)0h、2h、3h、4h、5h、6h和過夜，按上述方法對樣品進(jìn)行處理，處 理后用12%的SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖7所示。結(jié)果顯示，在誘導(dǎo)4h時(shí)重組蛋白的表 達(dá)量相對較高，2h和6h的表達(dá)量略低于4h的表達(dá)量，而在過夜誘導(dǎo)后的條帶中沒有明顯的 目的條帶。因此，選擇4h作為最佳誘導(dǎo)時(shí)間。
[0070] (5)鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白的大量制備與純化
[0071] 將UL15exon I蛋白在最佳的誘導(dǎo)表達(dá)條件下進(jìn)行大量的表達(dá)，于4°C、10000r/ min離心IOmin收集菌體后將菌體沉淀用20mmol Tris-HCl (pH8. 0)懸浮，置-20°C過夜 后按lmg/mL加溶菌酶，4°C攪拌30min，超聲波（冰?。╅g歇破碎菌體（200w，3〇 sec/次， 5?10次），4°C lOOOOr/min離心IOmin以收集包涵體。將收集到的包涵體用2mol/L尿 素溶液（10mm〇l/LPBS+2mol/L尿素+0? 2% Triton X-100)進(jìn)行洗滌，約洗滌5-10次，每次 洗漆后4°C，10000r/min離心IOmin,最后的沉淀用適量的8mol/L的尿素溶液（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）溶解，然后用SDS-PAGE電泳檢測，結(jié)果如圖8所示。結(jié)果顯示，純化樣品 在45kDa條帶附近有目的條帶，與未純化的樣品相比，純化的條帶有且只有一條，表明本發(fā) 明的方法能夠獲得高純度的目的蛋白。
[0072] 實(shí)施例3、鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白檢測鴨瘟病毒抗體
[0073] (1)鴨抗鴨瘟病毒IgG的提取
[0074] 取5ml鴨抗鴨瘟病毒血清置于50ml的離心管中，加生理鹽水5ml，再逐滴加入 (NH4)2SO4飽和溶液2. 5ml，使其成為20%的（NH4)2SO4溶液，邊加邊攪拌，充分混勻后，靜 置30min ;然后于4 °C、3000r/min離心20min，棄沉淀，在上清液中再加入（NH4) 2S04溶液 7.51111，使其成為50%的（順4)304溶液，充分混勻后，靜置301^11;然后于41：，300017 /1^11 離心20min，棄上清，沉淀中加入5ml的生理鹽水，使之溶解，再加入飽和（NH4)2SO 4溶液 2. 5ml，使其成為33. 3 %的（NH4) 2S04溶液，充分混勻后靜置30min ;再在4°C，3000r/min離 心20min，棄上清，重復(fù)此步驟2-3次，最后用2. 5ml生理鹽水溶解沉淀后裝入透析袋，再用 生理鹽水進(jìn)行透析，得鴨抗鴨瘟病毒IgG。透析后以質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1 %的BaCl2溶液檢查透析 后的抗體溶液中是否還存在硫酸根離子。將抗體小體積分裝后于_20°C保存?zhèn)溆?，盡量避免 抗體反復(fù)凍融。
[0075] (2)鴨瘟病毒UL15基因exonl重組蛋白對鴨瘟病毒抗體的檢測
[0076] 按照實(shí)驗(yàn)例2優(yōu)選的條件表達(dá)UL15基因exonl重組蛋白并進(jìn)行SDS-PAGE電泳， 以UL15基因exonl重組蛋白作為鴨瘟病毒抗體捕獲劑，并采用western-blot對鴨抗鴨瘟 IgG進(jìn)行檢測。具體操作步驟如下：將PVDF膜按照所需剪成合適的大小，于使用前浸泡于 100 %的甲醇中15s，再于雙蒸水中清洗2min，使用前再將其浸于轉(zhuǎn)膜緩沖液中不少5min ; 將凝膠及濾紙剪成合適大小并浸泡于轉(zhuǎn)膜緩沖液中，將其按照以下順序進(jìn)行安裝：將黑色 的板放置于最下一層，其上一次疊放海棉1張、濕潤的濾紙3張、凝膠、PVDF膜、濕潤的濾紙 3張、海棉1張；將所需的材料疊放好后，將其夾緊放入轉(zhuǎn)印槽中，注意正、負(fù)極的放置。將 注滿轉(zhuǎn)膜緩沖轉(zhuǎn)印槽置于冰水混合物中，以防止轉(zhuǎn)膜過程中產(chǎn)熱過多，起到降溫的作用；轉(zhuǎn) 膜的程序?yàn)?0v,60min。將轉(zhuǎn)印好的PVDF膜浸泡于100%的甲醇中IOs,之后于濾紙上晾干 約15min ;將鴨抗鴨瘟病毒IgG用PBS緩沖液進(jìn)行I :1000倍稀釋，其中加1 %的BSA，將膜 置于其中，37°C孵育Ih ;用PBS緩沖液輕輕漂洗PVDF膜，每次洗10s，共洗兩次；將HRP標(biāo)記 的羊抗鴨IgG用PBS緩沖液進(jìn)行I :500倍稀釋，不加BSA，將PVDF膜浸泡于其中，37°C孵育 Ih ;用PBS緩沖液清洗PVDF膜2次，每次IOs ;用DAB顯色液對PVDF膜避光顯色，結(jié)果如圖 9所示。結(jié)果顯示，在48kDa的條帶附近有一條清晰的特異性目的條帶出現(xiàn)，說明鴨抗鴨瘟 病毒IgG與UL15基因exon I重組蛋白反應(yīng)原性良好，因此UL15基因exon I重組蛋白可 以用來作為鴨瘟病毒抗體的檢測試劑。
[0077] 實(shí)施例4、鴨瘟病毒UL15基因exon I重組蛋白鼠抗多克隆抗體的制備
[0078] 按實(shí)施例2優(yōu)選的條件對UL15基因exonl重組蛋白進(jìn)行大量表達(dá)并純化。將純化 好的UL15基因exonl重組蛋白用8mol/L尿素溶解（10mmol/L PBS+8mol/L尿素）后加入 復(fù)性稀釋緩沖液（50mmol/L Tris-base、lmmol/L EDTA> lOOmmol/L NaCl、0. 25mol/L L-精 氨酸、0. lmmol/L氧化型谷胱甘肽、lmmol/L還原型谷胱甘肽、5%甘油）。將稀釋后的蛋白 液裝入處理好的透析袋中置于復(fù)性透析緩沖液（不同濃度的尿素、50mmol/L Tris-base、 0.5mol/L EDTA、150mmol/L NaCl、0.6mol/L L-精氨酸）中進(jìn)行尿素梯度復(fù)性。復(fù)性透析緩 沖液中的尿素濃度由 8mol/L-6mol/L-4mol/L-2mol/L-lmol/L-〇mol/L，每 12h 更換一次透 析液，最后用PBS緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，將復(fù)性好的蛋白液吸到超濾管中進(jìn)行超濾。將超濾 后的復(fù)性蛋白與完全弗氏佐等量混合并乳化充分，對小鼠進(jìn)行一免。一免過后14天將超濾 后的復(fù)性蛋白與不完全弗氏佐齊等量混合并充分乳化后對小鼠進(jìn)行二免、三免。四免時(shí)使 用不加弗氏佐劑的超濾后的復(fù)性蛋白進(jìn)行免疫。四免過后7天，摘取小鼠的眼球進(jìn)行采血， 采血后將其在37°C放置lh，之后4°C過夜。析出血清后，4000r/min離心IOmin收集血清， 放于-20°C保存?zhèn)溆?。具體免疫程序如表1所示：
[0079] 表1、UL15基因exonl重組蛋白免疫小鼠程序
[0080]

【權(quán)利要求】
1. 鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白，其特征在于：所述鴨瘟病毒UL15基因 exonl重 組蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 4所示。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白，其特征在于：編碼所述 鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
3. 權(quán)利要求1或2所述鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白的制備方法，其特征在于， 包括如下步驟：將含有重組表達(dá)載體的大腸桿菌Rossetta在含有Amp的LB液體培養(yǎng)基中 培養(yǎng)過夜，然后取菌液按體積比為1 :50?1 :100接入含Amp的LB液體培養(yǎng)基中，培養(yǎng)至 0D600為(λ 4?(λ 6時(shí)，加入IPTG至終濃度為(λ 2?L 2mmol/L，在溫度為25?37°C條件 下誘導(dǎo)培養(yǎng)2?6小時(shí)，收集培養(yǎng)菌液，培養(yǎng)菌液中含有鴨瘟病毒UL15基因 exon I重組蛋 白； 所述重組表達(dá)載體為將SEQ ID NO. 3所示核酸序列通過BamHI和Xhol連接原核表達(dá) 質(zhì)粒pPAL7而得。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：所述IPTG的終濃度為0. 2mmol/L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的制備方法，其特征在于：誘導(dǎo)培養(yǎng)為在37°C條件下誘導(dǎo)培養(yǎng) 4小時(shí)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求3-5任一項(xiàng)所述的制備方法，其特征在于：誘導(dǎo)培養(yǎng)后還包括純化步 驟， 將誘導(dǎo)表達(dá)的菌液離心，收集菌體，菌體用PH8. 0的20mm〇lTris-HCl懸??；置-20°C過 夜后按lmg/mL加溶菌酶，4°C攪拌30min，冰浴下超聲波間歇破碎菌體，然后離心收集包涵 體，收集的包涵體用含10mm〇l/L PBS、2mol/L尿素和質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0· 2%的Triton X-100的 洗液重復(fù)洗滌5-10次，洗滌后離心收集沉淀，最后沉淀用含10mm〇l/L PBS和8mol/L尿素 溶液溶解沉淀；得純化的鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于，純化后還包括復(fù)性步驟：將純化好的 鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白加入復(fù)性稀釋緩沖液，然后裝入透析袋中依次置于尿 素濃度為8mol/L、6mol/L、4mol/L、2mol/L、lmol/L和Omol/L的復(fù)性透析緩沖液中進(jìn)行復(fù) 性，每12小時(shí)更換一次透析液，再用PBS緩沖液進(jìn)行透析復(fù)性，最后用超濾管進(jìn)行超濾得 復(fù)性的鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白；所述復(fù)性稀釋緩沖液含50mmol/L Tris-base、 lmmol/LEDTA、100mmol/L NaCl、0. 25mol/L L_ 精氛酸、0· lmmol/L 氧化型谷胱;甘膚、lmmol/ L還原型谷胱甘肽和5%甘油（V/V);所述復(fù)性透析緩沖液含含有50mmol/L Tris-base、 0. 5mol/LEDTA、150mmol/L NaCl 和 0· 6mol/L L-精氛酸。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的制備方法，其特征在于：所述離心是在4°C、lOOOOr/min條件 下離心10min。
9. 權(quán)利要求1或2所述鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白在制備鴨瘟病毒抗體捕獲 劑中的應(yīng)用。
10. 權(quán)利要求1或2所述鴨瘟病毒UL15基因 exonl重組蛋白在制備抗鴨瘟病毒多克隆 抗體的抗原中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P21/02GK104292310SQ201410520084
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】楊喬, 程安春, 汪銘書, 孫昆峰, 賈仁勇, 朱德康, 陳舜, 劉馬峰 申請人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)