抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因及其生產(chǎn)方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本發(fā)明利用基因重組的方法來生產(chǎn)DNAJP1的衍生物M-DNAJP1，人工構(gòu)建dnaJP1的基因，并通過首尾相連中間添加蛋氨酸的方法進行串聯(lián)形成如下方式：M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1-M-dnajp1，將其克隆到質(zhì)粒pet31b(+)中，然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中進行表達得到DNAJP1修飾后的多肽：M-DNAJP1的重復(fù)序列如SEQIDNO：2所示。通過發(fā)酵制備該小肽，然后利用溴化氰裂解的方法來得到游離多肽，裂解后的溴化氰通過高溫高壓處理，生成氨水和甲酸鈉，減少對環(huán)境的污染，整個過程成本低，產(chǎn)量高，純化簡單，利于產(chǎn)業(yè)化。
【專利說明】抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因及其生產(chǎn)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽的重組發(fā)酵生產(chǎn)，以及純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎是一種慢性反復(fù)發(fā)作的以全身關(guān)節(jié)炎癥改變?yōu)橹鞯奶弁葱约膊。?英文名稱Rheumatoid arthritis,簡寫RA,是一種常見病、多發(fā)病。發(fā)病時間可以持續(xù)幾 天、幾周或幾個月，并帶有不同程度的活動性，嚴重者病人生活不能自理，往往累及終生，形 成長期病痛，極大地危害著人類的生命和健康，人們期望能研發(fā)和生產(chǎn)出更多高效優(yōu)質(zhì)的 藥物在臨床應(yīng)用。
[0003] 現(xiàn)在應(yīng)用的RA治療藥物有抗炎藥，如阿司匹林、皮質(zhì)類固醇和通過抑制或消滅機 體免疫反應(yīng)而減輕疾病癥狀的藥物，這些藥物雖可改善癥狀，但不能去除風(fēng)濕的基本病理 改變，而且還存在減弱機體的抗病能力的危害。
[0004] DNAJPl是一個通過計算機輔助設(shè)計技術(shù)開發(fā)的新藥多肽，它起源于熱休克蛋白 dnaj.，在該蛋白的基礎(chǔ)上通過合成法得到的。熱休克蛋白細胞在經(jīng)受諸如發(fā)炎、自身免疫 性疾病如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的情況下會產(chǎn)生熱休克蛋白。dnaJPl的作用機制在于通過調(diào)節(jié) T細胞的功能來減少發(fā)炎、增強調(diào)控免疫系統(tǒng)，使得由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎引起的炎癥反應(yīng)受到 抑制，美國160例二期臨床實驗表明，口服該多肽可以降低炎癥反應(yīng)，取得了良好的效果。
[0005] 抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJPl與傳統(tǒng)的治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎物相比，具有無可比 擬的優(yōu)勢。該藥物不會對患者的免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制，通過口服應(yīng)用dnaJPl，因為腸內(nèi)的粘膜 免疫系統(tǒng)可以對患者的免疫系統(tǒng)進行重新馴化，從而有效改善免疫系統(tǒng)。通過模擬反應(yīng)，幫 助患者免疫系統(tǒng)重新識別自身物質(zhì)和外源抗原，保護原來深受破壞的病灶得以恢復(fù)，癥狀 得到緩解，通過使得患者的免疫系統(tǒng)耐受dnaj而起到治療作用，具有安全性高、作用直接 迅速、易被人體吸收、特異性高、持續(xù)時間長、可口服等優(yōu)點，具有極為誘人的廣闊前景。
[0006] 現(xiàn)有的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJPl的純化方法為化學(xué)合成法。美國發(fā)明專利 US5773570A，該技術(shù)利用聚合鏈式反應(yīng)（PCR)從業(yè)和重組的噬菌體質(zhì)粒包含dnaK和dnaj中 擴增了含有dnaj基因的片段，然后將該片段亞克隆到PCG808fX的Xbal位點，作為麥芽糖 結(jié)合融合蛋白進行表達，然后用含有針對該融合蛋白的兔抗血清將用PUC19質(zhì)粒進行表達 的rdnaj進行純化，最后，用固定化的蛋白A，將IgG-MBL-DnaJ進行純化，然后用pH2. 5的 甘氨酸緩沖液進行洗脫出來，SDS電泳結(jié)果表明只有一條帶，融合蛋白符合預(yù)期，分子量在 41KD。該專利采用了融合蛋白和目的多肽融合生產(chǎn)的方法，融合標簽本身的分子量為40KD， 而目的多肽的分子量僅有1.76KD，相差20多倍，也就是說即使產(chǎn)生大量的融合蛋白，其實 含有目的蛋白的產(chǎn)量很低（占總蛋白含量的4%)，造成不必要的浪費，不利于大規(guī)模生產(chǎn)。 另外他純化出來的是融合蛋白（41KD)，而不是真正的dnaJPl多肽（I. 76KD)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是：抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽dnaJPl是由幾個氨基酸組 成的短肽，而要實現(xiàn)短肽直接在宿主菌中的表達并分離出來非常困難，而采取融合表達方 式也因采用較大的融合標簽和較低的抗炎基因拷貝導(dǎo)致表達量很低。本發(fā)明構(gòu)建具有合適 高拷貝數(shù)的基因，通過將其基因進行6個重復(fù)串聯(lián)的方法來增加產(chǎn)量，并采用較小的融合 標簽來融合表達該基因已增加在表達產(chǎn)物中的相對比重，對實現(xiàn)抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小肽的高 效表達，相對比重約為50%，由于生成的融合蛋白是包涵體，所以非常容易純化，純化后的包 涵體蛋白，采用溴化氰裂解，專一性強，成本低，本發(fā)明采用高壓裂解的方法清除溴化氰，成 本低，污染小，操作簡單，易于產(chǎn)業(yè)化。
[0008] 本發(fā)明的技術(shù)方案為：一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
[0009] 所述的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，核苷酸序列所編碼的多肽如SEQ ID NO :2所 /Jn 〇
[0010] 所述的表達抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因的多肽串聯(lián)生產(chǎn)方法，利用大腸桿菌的 pET31b(+)表達體系，將SEQ ID N0:1基因序列亞克隆到質(zhì)粒pET31b(+)融合標簽KSI的 基因序列的后面，限制性內(nèi)切酶為AwnI，然后將亞克隆得到的轉(zhuǎn)化進大腸桿菌BL21 (DE3) PlysS中進行表達，并進行發(fā)酵生產(chǎn)，得到的菌體通過低溫高壓裂解得到包涵體，洗滌后的 包涵體利用溴化氰（CNBr)或者蛋氨酸裂解酶進行裂解成單個多肽，裂解完畢后加堿水猝 滅反應(yīng)，采用高溫高壓水解法，除去溴化氰等雜質(zhì)，通過納濾除鹽，得到純品。
[0011] 所述的表達抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因的多肽串聯(lián)生產(chǎn)方法，所述高溫高壓水解 法的條件為，103. 4kPa，I. 05kg/cm2,在溫度121. 3° C的條件下處理15?20分鐘。
[0012] 本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明利用基因重組的方法來生產(chǎn)DNAJPl的衍生物 M-DNAJPl，人工構(gòu)建dnaJPl的基因，并通過首尾相連中間添加蛋氨酸的方法進行串聯(lián)形成 如下方式：M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl- M-dnajpl，將其克隆到 質(zhì)粒pet31b(+)中，然后轉(zhuǎn)化進大腸桿菌中進行表達得到DNAJPl修飾后的多肽：M-DNAJP1 的重復(fù)序列如SEQ ID NO :2所示。通過發(fā)酵制備該小肽，然后利用溴化氰裂解的方法來得 到游離多肽，裂解后的溴化氰通過高溫高壓處理，生成氨水和甲酸鈉，減少對環(huán)境的污染， 整個過程成本低，產(chǎn)量高，純化簡單，利于產(chǎn)業(yè)化。
[0013] 本發(fā)明利用pet-31 (b+)上較小的His標簽片段融合表達串聯(lián)6次目的小肽，增加 了表達出來的重組蛋白中目的多肽所占的比例（?50%)，形成融合蛋白包涵體，以減少表 達蛋白的細胞毒性，大大增加了表達效率和減小了小肽的分離難度。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 圖1為工程菌發(fā)酵表達中5升小試實驗結(jié)果； 圖2為中試50升發(fā)酵過程中生長曲線； 圖3為發(fā)酵SDS-PAGE ; 圖4為菌體經(jīng)過低溫高壓破碎后的樣品電泳圖； 圖5為包涵體洗漆后產(chǎn)物電泳圖； 圖6為小肽溴化氰裂解電泳圖； 圖7為小肽MALDI-T0F/T0F質(zhì)譜聯(lián)機檢測圖。

【具體實施方式】
[0015] 工程菌的構(gòu)建： 內(nèi)容包括根據(jù)密碼子偏愛性設(shè)計序列、合成全基因序列、利用Alwn I酶切質(zhì)粒，導(dǎo)入 目的序列，構(gòu)建了以以pet-31(b+)為表達載體的、大腸桿菌BL21(DE3) pLysS為宿主菌的 MDNAJP1融合表達系統(tǒng)。6個重復(fù)的MDNAJP1的氨基酸序列，按照大腸桿菌密碼子偏愛性。 確定基因序列如SEQ ID NO :1所不。
[0016] 基因序列由本實驗室自己合成。將質(zhì)粒用AlwnI內(nèi)切酶切開，將目的基因片段進 行亞克隆，連接到質(zhì)粒中去，然后轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中，宿主菌和表達載體均購自Novagen 公司。工程菌構(gòu)建完成后，經(jīng)表達質(zhì)粒酶切鑒定、目的片段DNA測序鑒定，結(jié)果表明工程菌 構(gòu)建正確。
[0017] 工程菌發(fā)酵表達 構(gòu)建了工程菌株后，基因重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS劃線接種于含氨芐青霉素 (80ug/ml)的LB固體平板上，首先進行小試表達：搖瓶培養(yǎng)，然后進行了 5升發(fā)酵罐培養(yǎng)。 以便對種子培養(yǎng)基、接種濃度進行摸索。
[0018] 5升小試實驗結(jié)果如圖1所示。從左至右點樣順序為：二級種、0hr、3 hr、5 hr(誘 導(dǎo) 0hr)、MARK、8 hr (誘導(dǎo) 3hr)、ll hr (誘導(dǎo) 6hr)、17 hr (誘導(dǎo) 12hr)、20 h (誘導(dǎo) 15hr) 最終確定工藝步驟如下： 一級、二級種子培養(yǎng)基為LB，發(fā)酵培養(yǎng)基為TB (修改版)，接種前Amp濃度為lOOPg/mL 本項目碳源為甘油，因為其做碳源產(chǎn)生更少的雜質(zhì)蛋白。
[0019] 中試50升發(fā)酵過程： 一發(fā)酵過程 (1) 將基因重組大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS劃線接種于含氨芐青霉素（80ug/ml)的LB 固體平板上，置37°C恒溫箱倒置培養(yǎng)12h ; (2) 挑取平板上的大腸桿菌BL21 (DE3) pLysS 接種到20ml含氨芐青霉素（80ug/ml)的LB培養(yǎng)基中，37°C下200rpm. min - 1振蕩培 養(yǎng)8h至對數(shù)生長期，將上述培養(yǎng)液20ml接種于200ml含氨芐青霉素（80ug/ml)的LB培養(yǎng) 基中，37?下220rpm. min - 1振蕩培養(yǎng)4h，得到發(fā)酵種子液； (3) 發(fā)酵罐空消后，校正pH電極、溶氧電極，倒入溶解好的TB培養(yǎng)基，按發(fā)酵罐滅菌操 作進行滅菌（121°C，30min)，待料液溫度降至37°C時，加入準備好的氨芐青霉素（80ug/ml) 和葡萄糖（3%)，按10%比例接進種子液，控制溫度37°C、溶氧30%以上，用氨水調(diào)節(jié)pH7. 0， 攪拌速率和通氣量調(diào)節(jié)由溶氧濃度決定。當(dāng)發(fā)酵液中菌密度達到0D600值為15時加入誘 導(dǎo)劑IPTG達0. 2mM，繼續(xù)培養(yǎng)10 - 16h左右，最終OD約42。
[0020] 表1發(fā)酵記錄

【權(quán)利要求】
1. 一種抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO :1所示。
2. 如權(quán)利要求1所述的抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因，核苷酸序列所編碼的多肽如SEQ ID NO :2 所示。
3. 如權(quán)利要求2所述的表達抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因的多肽串聯(lián)生產(chǎn)方法，其特 征在于：利用大腸桿菌的pET31b(+)表達體系，將SEQ ID NO :1基因序列亞克隆到質(zhì)粒 pET31b(+)融合標簽KSI的基因序列的后面，限制性內(nèi)切酶為AwnI，然后將亞克隆得到的轉(zhuǎn) 化進大腸桿菌BL21 (DE3)plysS中進行表達，并進行發(fā)酵生產(chǎn)，得到的菌體通過低溫高壓裂 解得到包涵體，洗滌后的包涵體利用溴化氰（CNBr)或者蛋氨酸裂解酶進行裂解成單個多 肽，裂解完畢后加堿水猝滅反應(yīng)，采用高溫高壓水解法，除去溴化氰等雜質(zhì)，通過納濾除鹽， 得到純品。
4. 如權(quán)利要求3所述的表達抗類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的小肽基因的多肽串聯(lián)生產(chǎn)方法，其特征 在于：所述高溫高壓水解法的條件為，103. 4kPa，I. 05kg/cm2,在溫度121. 3° C的條件下處 理15?20分鐘。
【文檔編號】C12N15/70GK104313028SQ201410521516
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】李相魯, 張嚴冬, 孟建軍, 梁莊嚴 申請人:北京生科東方科技有限公司