以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽甾烯酮的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽甾烯酮的方法，⑴靜息細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好以后，離心，加入無菌磷酸緩沖液重懸作為轉(zhuǎn)化液；所述靜息細(xì)胞具有將膽固醇氧化生成膽甾烯酮的能力；⑵在轉(zhuǎn)化液中投入膽固醇，并添加低共熔物為促溶劑，乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，采用HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物膽甾-4-烯-3-酮的產(chǎn)率；⑶用柱層析分離法將底物膽固醇與產(chǎn)物膽甾烯酮進(jìn)行分離，并純化得到膽甾烯酮純品。本發(fā)明采用低共熔物(DES)代替甲醇等有機(jī)溶劑作為綠色添加劑，添加低共熔物后，提高底物的分散率，有效促進(jìn)底物膽固醇與菌體的接觸，有效提高了靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化效率，在加入和轉(zhuǎn)化過程中操作條件溫和，步驟簡(jiǎn)單。
【專利說明】以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的 方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于微生物轉(zhuǎn)化【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其是一種以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì) 胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方法。 技術(shù)背景
[0002] 膽留_4_稀_3_麗（4-Cholesten_3-〇ne)，又名膽留稀麗，分子式為C27H44O,是膽固 醇經(jīng)過化學(xué)合成法、微生物轉(zhuǎn)化法等手段得到的重要產(chǎn)物之一，是膽固醇的氧化產(chǎn)物。膽甾 烯酮可用于治療肝病，可以作為減肥促進(jìn)劑，具有防止皮膚角質(zhì)化等作用。除此之外，膽甾 烯酮的特定結(jié)構(gòu)可以作為甾體藥物的中間體，廣泛用于醫(yī)藥行業(yè)。
[0003] 曾有文獻(xiàn)報(bào)道從土樣中篩選出來的鐮刀孢菌，優(yōu)化菌株發(fā)酵過程的培養(yǎng)基以 及發(fā)酵條件，將膽固醇轉(zhuǎn)化成膽留烯酮。也有專利CN1328133A報(bào)道采用一種短桿菌 (Brevibacteriumsp.)突變株DGQ3C-82為產(chǎn)酶菌株，以葡萄糖與酵母膏作為最合適碳源 與氮源，以醋酸銨作為產(chǎn)酶促進(jìn)劑，以膽固醇作為產(chǎn)酶誘導(dǎo)劑和菌體生長(zhǎng)營養(yǎng)因子，生物合 成胞外型膽固醇氧化酶，進(jìn)而通過微生物發(fā)酵培養(yǎng)得到膽留-4-烯-3-酮。
[0004] 膽固醇也叫膽留醇，屬于留體類藥物。這一類底物在水中的溶解度很低，其范圍在KT5?l(T6m〇l/L之間，這種難溶性使得留體與生物酶的有效接觸十分困難，嚴(yán)重影響甾體 轉(zhuǎn)化反應(yīng)的速度和產(chǎn)率。因此，在留體生物轉(zhuǎn)化的過程中，添加一些促溶劑可以有利于底物 與生物酶的有效接觸，提高反應(yīng)速度或增大反應(yīng)速率。在留體藥物微生物轉(zhuǎn)化的過程中，大 多數(shù)采用甲醇、丙酮、二甲基亞砜等有機(jī)溶劑作為促溶劑。低共熔物的化學(xué)性質(zhì)與離子液體 相似，室溫下為液體狀態(tài)，它們無蒸汽壓，不會(huì)對(duì)大氣造成污染。與傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑相比，低 共熔物具有不可燃性，在操作過程中增加了其安全性。因此，研究低共熔物代替有機(jī)溶劑進(jìn) 行微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)具有更重要的意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供了以一種以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的 方法，并將菌體采用靜息細(xì)胞培養(yǎng)，進(jìn)行膽固醇的轉(zhuǎn)化，在轉(zhuǎn)化溶劑中加入低共熔物，有效 提高轉(zhuǎn)化效率。
[0006] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0007] 以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方法，步驟如下：
[0008] ⑴靜息細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好以后，離心，加入無菌磷酸緩沖液重懸作為轉(zhuǎn) 化液；所述靜息細(xì)胞具有將膽固醇氧化生成膽留烯酮的能力；
[0009] ⑵在轉(zhuǎn)化液中投入膽固醇，并添加低共熔物為促溶劑，乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，采用HPLC法檢測(cè)產(chǎn)物膽留-4-烯-3-酮的產(chǎn)率；
[0010] ⑶用柱層析分離法將底物膽固醇與產(chǎn)物膽留烯酮進(jìn)行分離，并純化得到膽留烯酮 純品。
[0011] 而且，所述靜息細(xì)胞為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌（Arthrobactersimplex)。
[0012] 而且，所述簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的斜面培養(yǎng)基為g/L:葡萄糖8?10,玉米漿8?9,蛋白 胨4?5，KH2P042,瓊脂20，pH7. 0?7. 2,115°C高壓滅菌20min;發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L:葡萄糖 8?10,玉米漿8?9,蛋白胨4?5,KH2P042,pH7. 0?7. 2,115°C高壓滅菌20min。
[0013] 而且，所述簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的培養(yǎng)方法為將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌刮一環(huán)到無菌水中，振蕩混勻， 按照OD為0. 440?0. 520的濃度算好比例加入到50ml/250ml搖瓶中進(jìn)行反應(yīng)，菌種發(fā)酵 培養(yǎng)時(shí)間為18h?22h，溫度為25°C?35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm?200rpm。
[0014] 而且，所述無菌磷酸緩沖液的pH為7. 0?7. 2,濃度為的磷酸緩沖液。
[0015] 而且，加入無菌磷酸緩沖液重懸后的轉(zhuǎn)化液其菌體濃度為0. 35-0. 45gDW/mL。
[0016] 而且，所述低共熔物為氯化膽堿/乙二醇混合摩爾比為1:2、1:1、2:1中的一種， 或氯化膽堿/甘油混合摩爾比為1:2、1:1、2:1中的一種，或氯化膽堿/尿素混合摩爾比為 1:2、1:1、2:1 中的一種。
[0017] 而且，所述低共熔物的添加濃度為1 %?5%。
[0018] 而且，所述底物膽固醇的投料濃度后，采用轉(zhuǎn)化溫度為25°C?35°C，搖床轉(zhuǎn)速為 150rpm?200rpm，反應(yīng)時(shí)間為48?72h的方式進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。
[0019] 而且，所述柱層析分離法分離底物產(chǎn)物，采用石油醚：乙酸乙酯=10 :1V:v的比例 進(jìn)行分離，將收集得到的液體采用減壓旋蒸法進(jìn)行產(chǎn)物的純化收集。
[0020] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和積極效果：
[0021] 1、本發(fā)明采用低共熔物（DES)代替甲醇等有機(jī)溶劑作為綠色添加劑，添加低共熔 物后，提高底物的分散率，有效促進(jìn)底物膽固醇與菌體的接觸，有效提高了靜息細(xì)胞的轉(zhuǎn)化 效率，在加入和轉(zhuǎn)化過程中操作條件溫和，步驟簡(jiǎn)單。
[0022] 2、本發(fā)明解決了微生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)中留體底物溶解度低，難與生物酶有效接觸進(jìn)行 轉(zhuǎn)化反應(yīng)，添加的有機(jī)溶劑毒性大、易揮發(fā)、對(duì)菌體毒性大等問題，為膽留-4-烯-3-酮的生 產(chǎn)開辟了新的途徑，同時(shí)對(duì)于留體藥物的綠色環(huán)保、高效生產(chǎn)提供了一條新的途徑，工業(yè)化 意義重大。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023] 圖1為本發(fā)明底物膽固醇在205nm下檢測(cè)，保留時(shí)間為25. 455min;
[0024] 圖2為本發(fā)明產(chǎn)物膽甾烯酮在240nm下檢測(cè)，保留時(shí)間為22. 989min;
[0025] 圖3為本發(fā)明不同DES百分含量的轉(zhuǎn)化率對(duì)比圖；
[0026] 圖4為本發(fā)明底物濃度不同的轉(zhuǎn)化率對(duì)比圖；
[0027] 圖5為本發(fā)明的轉(zhuǎn)化率隨菌體添加量的變化情況圖。
[0028] 具體的實(shí)施方式
[0029] 為了理解本發(fā)明，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明：下述實(shí)施例是說明性 的，不是限定性的，不能以下述實(shí)施例來限定本發(fā)明的保護(hù)范圍。
[0030] 本發(fā)明采用的靜息細(xì)胞為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，以膽固醇為底物，添加低共 熔物為促溶劑的微生物轉(zhuǎn)化反應(yīng)式如下：
[0031]

【權(quán)利要求】
1. 以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方法，其特征在于：步驟 如下： ⑴靜息細(xì)胞在發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)好以后，離心，加入無菌磷酸緩沖液重懸作為轉(zhuǎn)化液； 所述靜息細(xì)胞具有將膽固醇氧化生成膽留烯酮的能力； ⑵在轉(zhuǎn)化液中投入膽固醇，并添加低共熔物為促溶劑，乙酸乙酯萃取轉(zhuǎn)化液，采用HPLC 法檢測(cè)產(chǎn)物膽留-4-烯-3-酮的產(chǎn)率； ⑶用柱層析分離法將底物膽固醇與產(chǎn)物膽留烯酮進(jìn)行分離，并純化得到膽留烯酮純 品。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述靜息細(xì)胞為簡(jiǎn)單節(jié)桿菌（Arthrobacter simplex)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的斜面培養(yǎng)基為g/L :葡萄糖8?10,玉米楽8?9,蛋白 胨4?5，KH2P042,瓊脂20，pH7. 0?7. 2,115°C高壓滅菌20min ;發(fā)酵培養(yǎng)基為g/L :葡萄糖 8?10,玉米漿8?9,蛋白胨4?5, KH2P042, pH7. 0?7. 2,115°C高壓滅菌20min。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述簡(jiǎn)單節(jié)桿菌的培養(yǎng)方法為將簡(jiǎn)單節(jié)桿菌刮一環(huán)到無菌水中，振蕩混 勻，按照0D為0. 440?0. 520的濃度算好比例加入到50ml/250ml搖瓶中進(jìn)行反應(yīng)，菌種發(fā) 酵培養(yǎng)時(shí)間為18h?22h，溫度為25°C?35°C，搖床轉(zhuǎn)速為150rpm?200rpm。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述無菌磷酸緩沖液的pH為7. 0?7. 2,濃度為的磷酸緩沖液。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：加入無菌磷酸緩沖液重懸后的轉(zhuǎn)化液其菌體濃度為0. 35?0. 45gDW/mL。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述低共熔物為氯化膽堿/乙二醇混合摩爾比為1:2、1:1、2:1中的一種， 或氯化膽堿/甘油混合摩爾比為1:2、1:1、2:1中的一種，或氯化膽堿/尿素混合摩爾比為 1:2、1:1、2:1 中的一種。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述低共熔物的添加濃度為1%?5%。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述底物膽固醇的投料濃度后，采用轉(zhuǎn)化溫度為25°C?35°C，搖床轉(zhuǎn)速為 150rpm?200rpm，反應(yīng)時(shí)間為48?72h的方式進(jìn)行微生物轉(zhuǎn)化培養(yǎng)。
10. 根據(jù)權(quán)利要求1所述以低共熔物作為促溶劑利用靜息細(xì)胞轉(zhuǎn)化制備膽留烯酮的方 法，其特征在于：所述柱層析分離法分離底物產(chǎn)物，采用石油醚：乙酸乙酯=10 :1V :V的比 例進(jìn)行分離，將收集得到的液體采用減壓旋蒸法進(jìn)行產(chǎn)物的純化收集。
【文檔編號(hào)】C12P33/02GK104357526SQ201410522163
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年9月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年9月30日
【發(fā)明者】路福平, 毛淑紅, 于璐, 吉少嫻, 張會(huì)圖, 劉曉光 申請(qǐng)人:天津科技大學(xué)