的抗原模擬表位及其應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術領域】，涉及針對伏馬菌素B1的抗原模擬表位，其氨基酸序列為TTLQMRSEMADD。本發(fā)明FB1抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的FB1標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于FB1的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了FB1對人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應用價值。
【專利說明】針對伏馬菌素I的抗原模擬表位及其應用

【技術領域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術領域】，具體涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位及其應用。

【背景技術】
[0002]伏馬菌素8丨，1?)是一種常見的真菌毒素，主要由串珠鐮刀菌(^11881-111111產(chǎn)生研究表明，即丨對人類及動物具有較強的毒性作用，包括神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性及致畸致癌等，國際癌癥研究中心已把即工化分為28組，即對人類可能的致癌物。目前，多數(shù)國家已經(jīng)對谷物、糧食及食品中？8工的殘留含量設定了限量標準，如聯(lián)合國糧農(nóng)組織(1^0)規(guī)定每日最大允許攝入總量為2吒/匕體重；瑞士規(guī)定糧食中和？82總殘留限量為1000吒/匕
[0003]目前，檢測食品中1?的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學檢測等方法，免疫學檢測方法以其靈敏度高、檢測方便、成本低廉等優(yōu)勢在的檢測中得到了廣泛的應用。然而，在建立免疫學檢測方法的過程中，必須使用即工標準品為原料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，不僅價格昂貴而且具有極強的致癌性，對檢測人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學檢測方法的應用和推廣。有鑒于此，人們開始采用抗獨特型抗體及抗原模擬表位技術來實現(xiàn)有害小分子物質標準品的替代，并取得了一定的進展。噬菌體展示肽庫技術的主要特點是可有效地篩選出與目標靶體特異結合的噬菌體展示多肽，該技術在探索受體與配體之間相互作用結合位點、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質空間結構表位、新型疫苗的研制等方面應用廣泛。
[0004]本發(fā)明通過用噬菌體展示肽庫技術，從肽庫中篩選出能與靶分子(抗1?單克隆抗體)特異性結合的多肽(抗原模擬表位),該抗原模擬表位具有與天然分子相似的免疫反應特性，通過獲得的1?抗原模擬表位，以代替價格昂貴且毒性強的1?標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于？8工的免疫學檢測。


【發(fā)明內容】

[0005]本發(fā)明以抗1?單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標板上，投入噬菌體隨機展示十二肽庫，進行親和淘選，獲得了七種？8工的抗原模擬表位。它們的氨基酸序列如下:
麗八艦 1321^0、'邠預、1^21^111(03？、

1^01(33 祖^ 鼎？。
[0006]本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對應為: ^1^1606606^161^11066^16601^016^, 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^16
、^110^10^66^61160611^1^01^66^1101006,6666^16666160^1^61060^16^1^10061666,八。1^060110^6^16061^616^6^166016^16^1、、^0X0666^1^6106106^161166^6061166006 上述抗原模擬表位(多肽)結構中，大寫英文字母分別代表二十一種已知天然型氨基酸殘基或其0-型異構體的一種，0代表半胱氨酸殘基，0代表天冬氨酸殘基，？代表脯氨酸殘基，I？代表精氨酸殘基，X代表賴氨酸殘基，代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，^代表酪氨酸殘基，8代表絲氨酸殘基，？代表苯丙氨酸殘基，2代表谷氨酸殘基，I代表甲硫氨酸殘基，6代表甘氨酸殘基，I代表亮氨酸殘基，0代表谷氨酰胺殘基，I代表色氨酸殘基，^代表天冬酰胺殘基，^代表丙氨酸殘基，X代表蘇氨酸殘基。
[0007]本發(fā)明提及的抗原模擬表位(多肽)可通過噬菌體擴增、化學合成或基因工程重組表達的方式進行大量制備。噬菌體擴增是指將展示有？81抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過生物擴增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有？81抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子?；瘜W合成是指依據(jù)公布的抗原模擬表位的氨基酸序列，通過化學合成多肽的方式進行多肽合成。基因工程重組表達的方式是指將編碼？81抗原模擬表位的基因，通過克隆至表達載體，以多肽-融合蛋白的形式進行抗原模擬表位的大量制備。
[0008]本發(fā)明還涉及所述伏馬菌素8工抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。免疫學檢測的類型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測、膠體金免疫層析、免疫斑點雜交等基于抗原-抗體特異性反應的免疫學分析檢測類型。
[0009]本發(fā)明伏馬菌素8工抗原模擬表位(剛八艦132嫩10、吖13？⑶13冊1、1^20^11(03？、⑶11?謝32嫩00、3祖10罰0打1！1、1801(33祖^鼎？)在應用時，可以把合成的模擬表位用于免疫學檢測分析，將通過噬菌體擴增獲得的展示有抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測，當然，也可以將抗原模擬表位從噬菌體上切下來代替即工標準品來進行免疫學檢測分析。
[0010]還涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
[0011]還涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
[0012]前述伏馬菌素8工抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的即工標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于？8工的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然1?分子相似的免疫反應特性，效果非常好。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明伏馬菌素8工抗原模擬表位可以替換價格昂貴且毒性強的標準品，并作為競爭抗原或固相包被抗原應用于1?的免疫學檢測，該抗原模擬表位具有與天然1?分子相似的免疫反應特性，效果非常好。減少了 1?對人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應用價值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014]圖1為以？81抗原模擬表位建立的間接競爭此標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為7 = -144.5111(^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1匕。值為0.562耶?[，線性檢測范圍為0.171?2.420叩/爪[，最低檢測限為0.121叩/齓。

【具體實施方式】
[0015]實施例1.抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定 1)1?抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，并以終濃度100 ^8/1111包被96孔酶標板，41孵育過夜。第二天用1831 (50禮^01,邱7.5包含0.1% 1^6611-20卜八))洗滌10次后，加入300 988^？88? 41孵育2小時。2小時后棄封閉液，用1831洗滌5次，每孔加入100 ^ 1噬菌體肽庫(噬菌體展示十二肽庫，購自肥8公司，用183 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0^10111^11),22-261振蕩反應1小時。棄去未結合的噬菌體，用1831洗滌10次，結合上的噬菌體用 0.2 1 61^01116-1101 (邱 2.2)洗脫，并立即用 15 ^111 11-18-1101 (邱 9.1)中和。取10 ^1洗脫噬菌體測滴度，其余的用于感染20 III[生長至對數(shù)前期的X 0011 ￡82738菌株進行擴增。第三天用？％7^乂1沉淀純化噬菌體，并測定擴增后噬菌體的滴度。
[0016]在第二、第三輪的淘選過程中，包被的抗？8工單克隆抗體濃度分別為75 4 [和50 11 所用的丁83丁濃度為0.25%和0.5%，其余步驟同上。
[0017]2)陽性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測定噬菌體滴度的平板中隨機挑取20個曬菌體斑,進行曬菌體的擴增，采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測方法￡112711161111^6(1 1111111111108801-136111: 88887,3八)進行陽性卩遼菌體克隆的鑒定，具體方法為:首先，用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10呢/此包被96孔酶標板，41孵育過夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進行封閉，371孵育1小時；投入100耵噬菌體斑擴增液(1.0 X 1011時10，以原始噬菌體肽庫作為陰性對照，37 I孵育1小時；加入1:5000倍稀釋的！II？？標記抗113噬菌體二抗100沿，37。。孵育1小時；加入10041 118底物液，避光顯色5-11,酶標儀8016111:1^10 11111:18^811 ？0讀取450 11111處的吸收值。選取0045。大于陰性對照2倍的卩遼菌體克隆為陽性克隆。
[0018]3) 抗原模擬表位的鑒定:采用間接競爭此的方法進行1?抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10呢/111[包被酶標板，41孵育過夜；第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進行封閉，371孵育1小時；投入50沿經(jīng)間接此鑒定為陽性的丨邀菌體克隆(1.(^1011時11)和50耵1?標準品(濃度范圍為0-20
時；加入1:5000稀釋冊？標記的抗肌3噬菌體二抗100沿，371孵育1小時；加入100沿118底物液，避光顯色5111111，讀取0045。，能結合抗叩工單克隆抗體，且能被1?標準品所阻斷的噬菌體，鑒定為1?的抗原模擬表位。
[0019]實施例2.抗原模擬表位編碼基因的測序及其氨基酸序列的確定
將經(jīng)過間接競爭此鑒定展示有？81抗原模擬表位的噬菌體進行擴增，提取噬菌體的0嫩測序模板。簡要過程如下:進行噬菌體擴增，在第一步離心后，將800沿含噬菌體上清轉入一新離心管。加入200耵[郎/似口沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100耵碘化物緩沖液(10禮11-18-1101 (邱8.0), 1禮￡01^, 4 I耵無水乙醇沉淀0嫩，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(0嫩測序模板沉淀最終重懸于20耵滅菌水，取2沿進行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5叱噬菌體模板進行0嫩測序，其-96 8111測序引物為:5,-0?^^ 1^6 11^ 606 06~3\依據(jù)0嫩測序結果及密碼子表可獲得1?抗原模擬表位的氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下:
麗八艦 1321^10、？打3？訓！'邠預、1^21^111(03？、
1^01(33 祖^ 鼎？。
[0020]實施例3.1?抗原模擬表位作為競爭抗原在此13八中的應用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊1號濾紙進行過濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0021](2)包被及封閉
用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10吒/此包被酶標板，41孵育過夜。第二天用？831 (10 1111 ^88, 0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？88進行封閉，371孵育1小時后，用洗板6次待用。
[0022]( 3 )標準曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50沿展示有1?抗原模擬表位的噬菌體(1.(^1011時11)和一系列不同濃度的50耵即工標準品，371孵育1小時。加入1:5000稀釋！II？？標記的抗113噬菌體二抗，371孵育1小時。然后用118底物顯色，讀取0045。。以濃度對數(shù)為橫坐標，結合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的00450父100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。結果顯示標準曲線呈3型，線性相關性較好(圖0。如圖1，以？81抗原模擬表位(氨基酸序列為剛—鮮32嫩10)建立的間接競爭此13八標準曲線。標準曲線的線性回歸方程為 7 = -144.5111^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1(350^^ 0.5621^/01，線性檢測范圍為0.17廣2.420叩/^，最低檢測限為0.121叩/齓。
[0023](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50沿展示有1?抗原模擬表位的噬菌體(1.(^1011 口血)和待測樣品提取液，371孵育1小時。加入1:5000稀釋冊？標記的抗113噬菌體二抗，371孵育1小時。然后用118底物顯色，讀取0045。，計算結合率，并根據(jù)標準曲線，倒推出樣品中？^工的含量。
[0024]實施例4.抗原模擬表位作為固相抗原在此13八中的應用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊1號濾紙進行過濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0025](2)包被及封閉
用10禮？88 (邱7.4)稀釋展示有即工抗原模擬表位的噬菌體(2.0^1011時11), 100微升包被于酶標板，41孵育過夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進行封閉，371孵育1小時后，用洗板6次待用。
[0026](3)標準曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50耵抗1?單克隆抗體(0.5叩/“)和一系列不同濃度的50耵標準品，371孵育1小時。加入1:2000稀釋?。。?？？標記的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小時。然后用118底物顯色，讀取0045。。以1?濃度對數(shù)為橫坐標，結合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。
[0027](4)樣品的檢測
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50耵抗1?單克隆抗體(0.5叩/“)和一系列不同濃度的50耵標準品，371孵育1小時。加入1:2000稀釋?。。?？？標記的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小時。然后用118底物顯色，讀取0045。。以1?濃度對數(shù)為橫坐標，結合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)為縱坐標，建立間接競爭標準曲線。
[0028]實施例5.1?抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關食品),加入25毫升60 %的甲醇溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊1號濾紙進行過濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0029](2)噬菌體及控制線的點陣
用10禮？88 (邱7.4)稀釋展示有本發(fā)明即工抗原模擬表位的噬菌體(2.(^1011口血)，用點陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米),作為檢測線；將0丨5呢/“的冊？標記的羊抗鼠I姊二抗，用點陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測線的上方，距離大于5毫米),作為控制線。
[0030]( 3 )膠體金標記1?抗體
將抗體逐滴加入膠體金溶液(邱=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% ？26加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% 8“溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標記的1?抗體溶液。
[0031](4)膠體金檢測卡的組裝
將膠體金標記的抗體點噴于膠金墊上(1.0微克/毫升),將樣品墊、膠金墊，點陣了檢測線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進行組裝，切成試紙條，裝入檢測卡中待用。
[0032](5)樣品的檢測
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有1?且超過膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有？8工且低于膠體金檢測試紙的檢測閾值，則檢測線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。
[0033]實施例5 抗原模擬表位的大量制備
(1)以曬菌體擴增的方式
將展示有？81抗原模擬表位的噬菌體加入至20 “接種有21？ 2738的培養(yǎng)物中，37度220 11)111振蕩培養(yǎng)4.5卜。將培養(yǎng)物轉入另一離心管中，4 V 10000 1~卿離心10 ―!!，將上清的上部80 %轉入一新鮮管中，加入1/6體積的？I下靜置120砧!!。400 10000印111離心？郎/似⑶靜置溶液15舊!!。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入1此188進行重懸，即為噬菌體擴增液。
[0034](2)以1?抗原模擬表位-融合蛋白的方式進行制備八.擴增抗原模擬表位的外源編碼基因
反應體系:(50虬) 10 X ？71~013681:(1^2+ ￠1118)5 此
伽??？ 11x1:111-6 (68011 ？01~ 2.5 禮)4 1^-1
1131(2 111861-1: 6X1:61181011 ^1~111161~ (10 1111)1 1^-1
-96 ^111 86^116110111? ^1~111161~ (10 1111)1 1^-1
噬菌體0嫩模板1此
？71~013681: 0嫩？01齊61~已860.5 1^-1
滅菌(1(1112037.5 虬
？邙反應條件:95。0 5 111111，接著 951 30 860, 5500 30 860, 7200 40860，720010 111111 共 30 070168。
[0035]采用產(chǎn)物回收試劑盒純化產(chǎn)物，微量核酸定量儀定量。？81抗原模擬表位的編碼基因序列分別對應為:
^1^1606606^161^11066^16601^016^, 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^16、^110^10^66^61160611^1^01^66^1101006,6666^16666160^1^61060^16^1^10061666,八。1^060110^6^16061^616^6^166016^16^1、、^0X0666^1^6106106^161166^6061166006
8.外源編碼基因及表達載體的雙酶切
分別采用八￠^651^2^ I酶對外源編碼基因和表達載體㈧嫩1-1)111，肥8公司，可表達18？融合蛋白)進行雙酶切。
[0036]0.酶切后產(chǎn)物的連接及轉化
將質粒？此1-？111和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 00水浴連接12卜，取10 連接產(chǎn)物加至100 ^ [感受態(tài)細胞181中，充分混勻。冰浴30 ―!!后，42 V水浴熱激90 8，立即冰浴5 111111后補加600 111 18液體培養(yǎng)液，37 00, 200印111培養(yǎng)1 11,10000印111離心2 111111，吸去上清留取約200 9 I，涂布于03-八固體(八卹1~)培養(yǎng)基中，37 過夜培養(yǎng)，得到陽性克隆。
[0037]0.抗原模擬表位-18？融合蛋白的表達
將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 18-^,0.2%蔗糖中，371，220 17111111，振蕩培養(yǎng)過夜，將過夜培養(yǎng)物按1 %接種量“八)接種于50 III[的18-八，0.2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，371，220 1-/111111振蕩培養(yǎng)，當培養(yǎng)物細菌濃度00600達到0.6時，向三瓶培養(yǎng)物中加入1？%至終濃度為0.2 11111101/1,220 1-/111111振蕩培養(yǎng)，將誘導物(戶郎溶液)于4 00,4000 8，離心20爪化收集菌體沉淀，棄上清。重懸細胞于400此30禮11~18-此1，20%蔗糖，邱8.0 (80齓/8細胞濕重)，加入八至1禮，室溫下震蕩5-10111111,8000 8，41^,離心20 0111,棄上清，沉淀重懸于400 1111預冷的5禮1妨04，冰上震蕩10111111, 8000 8，4。。，離心 20 111111,保留上清，向上清液中加入 8 1111 1 I 11-18-1101,邱 7.4，獲得？81抗原模擬表位-18？融合蛋白。
【權利要求】
1.針對伏馬菌素Bi的抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為:TTLQMRSEMADD。
2.編碼權利要求1所述針對伏馬菌素&的抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如權利要求2所述的核苷酸，序列對應為: ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGATo
4.權利要求1所述針對伏馬菌素&的抗原模擬表位在免疫學檢測分析中的應用。
5.如權利要求4所述應用，其特征在于針對伏馬菌素&的抗原模擬表位以固相抗原或競爭抗原在免疫學檢測分析中的應用。
6.如如權利要求4所述應用，其特征在于針對伏馬菌素&的抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測分析中的應用。
【文檔編號】C12N15/11GK104311635SQ201410529360
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2013年3月6日 優(yōu)先權日:2013年3月6日
【發(fā)明者】何慶華, 許楊 申請人:南昌大學