兔白介素 1 β重組蛋白的制備方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種兔白介素1beta(IL-1β)重組蛋白的制備方法，屬于分子生物領(lǐng)域。本發(fā)明的制備兔白介素1β的方法，包括以下步驟：1)引物設(shè)計(jì)：引物序列如SEQ ID NO：2-3所示；2)PCR擴(kuò)增，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建；4)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)；5)蛋白純化及蛋白復(fù)性。本發(fā)明通過基因重組、重組蛋白表達(dá)純化和復(fù)性技術(shù)獲得可溶性兔白介素1β重組蛋白；用重組蛋白免疫母雞后產(chǎn)生高效價(jià)的抗體：血清抗體效價(jià)為1：64000，卵黃抗體效價(jià)為11.5ng/ml，可見本發(fā)明獲得的重組蛋白具有理想生物學(xué)活性，在國內(nèi)屬首創(chuàng)。
【專利說明】兔白介素1β重組蛋白的制備方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種白介素重組蛋白，尤其涉及一種兔白介素1β重組蛋白，屬于分 子生物領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002]白細(xì)胞介素-I(IL-I)，是一種主要由單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞合成分泌的蛋白質(zhì)多肽。 人的IL-I相對(duì)分子量為15KDa?17KDa，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)和等電點(diǎn)的差異，可將其分為兩個(gè) 分子亞型（IL-1alpha、IL-Ibeta)，這兩個(gè)亞型之間氨基酸序列有很大差別，但他們可識(shí) 別同一個(gè)受體IL-1R。
[0003]IL-I具有廣泛的免疫調(diào)節(jié)作用：促進(jìn)胸腺細(xì)胞、T細(xì)胞的活化增殖和分化；誘導(dǎo)單 核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞產(chǎn)生IL-6和TNFalpha;協(xié)同IL-4等細(xì)胞因子刺激B細(xì)胞的增殖和分 化；通過提高NK細(xì)胞對(duì)IL-2等細(xì)胞因子的敏感性增強(qiáng)其殺傷活性；促進(jìn)IL-2、IL-3、IL-4 等多種免疫分子基因的表達(dá)。白介素1β還具有影響消化吸收等功能。
[0004]目前國內(nèi)對(duì)動(dòng)物細(xì)胞因子的研究較少，兔白介素1β尚無人研究，缺乏重組蛋白 產(chǎn)品。兔子是常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之一，具有重要的醫(yī)學(xué)價(jià)值；由于其重要的臨床醫(yī)學(xué)價(jià)值，白 介素Ιβ已成為研究熱點(diǎn)之一。重組蛋白經(jīng)常以包涵體形式表達(dá)，不能以可溶性蛋白形式 存在，從而降低了其應(yīng)用價(jià)值，而復(fù)性技術(shù)是亟待解決的技術(shù)難題。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本專利根據(jù)已發(fā)表的兔白介素Ibeta(li3)基因序列，設(shè)計(jì)針對(duì)兔白介素1β基 因的特異引物，通過PCR擴(kuò)增和基因重組技術(shù)，經(jīng)原核系統(tǒng)表達(dá)獲得了兔白介素1β重組蛋 白，采用親和吸附柱純化技術(shù)獲得了生物純兔白介素1β重組蛋白，由于該重組蛋白以包 涵體形式表達(dá)，本發(fā)明發(fā)明出蛋白復(fù)性技術(shù)將包涵體還原為可溶性蛋白。該兔白介素1β 重組蛋白可以用于相關(guān)研究也可作為標(biāo)準(zhǔn)品用于ELISA等酶聯(lián)免疫分析和疾病診斷，也可 應(yīng)用于抗體的制備。
[0006] 本發(fā)明首先公開了一種制備兔白介素1β重組蛋白的方法，包括以下步驟：
[0007] 1)引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增兔白介素1β的引物，引物序列如SEQIDNO:2_3 所示；
[0008] 2)PCR擴(kuò)增：以含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，PCR擴(kuò) 增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性15min;94°C45s，58°C45s，72°C60s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延續(xù) lOmin，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0009] 3)重組質(zhì)粒的構(gòu)建：采用內(nèi)切酶酶切前述擴(kuò)增產(chǎn)物后連接到同一內(nèi)切酶酶切的 原核表達(dá)載體pET32a質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5α，篩選重組質(zhì)粒并測序；
[0010]4)蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-rabbitIL-Iβ，轉(zhuǎn)化感 受態(tài)細(xì)胞BL21，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)；
[0011] 5)蛋白純化：菌體裂解后收集包涵體，鎳柱純化后經(jīng)蛋白復(fù)性，獲得純化的兔白 介素1β重組蛋白。
[0012] 優(yōu)選的，步驟5)所述蛋白純化具體包括以下步驟：
[0013]Α.包涵體處理：采用裂解液裂解菌體后離心棄上清，采用BufferBl溶解沉淀并 離心，上清含有兔白介素1β包涵體蛋白用于下一步的分離純化；
[0014]Β.分離純化：分離純化采用鎳柱親和層析，層析介質(zhì)為Ni-NTA，以20ml滅菌水清 洗Ni-NTA預(yù)裝柱，然后用IOmlBufferB2平衡Ni-NTA預(yù)裝柱后上樣；再用IOmlBuffer B2和20mlWashBuffer清洗Ni-NTA預(yù)裝柱；最后用IOmlBufferE洗脫Ni-NTA預(yù)裝柱， 收集洗脫液，獲得純化的兔白介素1β包涵體蛋白；
[0015] C.蛋白復(fù)性：將兔白介素1β包涵體蛋白稀釋到濃度在0.Iyg/μ 1以下，經(jīng)TGE 緩沖液透析，濃縮，收集獲得復(fù)性后的兔白介素1β蛋白。
[0016] 更優(yōu)的，步驟A所述裂解液的配方為：50mMNaH2P04、300mMNaCUlOmM咪唑、0. 5mM PMSF，pH8.0;所述BufferBI的配方為：100mMNaH2P04、10mMTris、6M鹽酸胍，ρΗ8·0。
[0017]更優(yōu)的，步驟B所述BufferΒ2 的配方為：100mMNaH2P04、10mMTris、8M尿素， ρΗ8· 0 ;所述WashBuffer的配方為：IOOmMNaH2PO4UOmMTris、20mM咪唑、8M尿素，ρΗ8· 0 ; 所述BufferE的配方為：100mMNaH2P04、10mMTris、250mM咪唑、8Μ尿素，ρΗ8· 0。
[0018]更優(yōu)的，步驟C所述TGE緩沖液的配方為：50mMTris-HCl、50mMNaCl、0. 5mM EDTA、5%甘油、1%甘氨酸、ΙΟπιΜβ-巰基乙醇、0· 5mMPMSF，pH8. 0。
[0019] 對(duì)重組蛋白免疫原性進(jìn)行測定，用重組蛋白免疫母雞后產(chǎn)生高效價(jià)的抗體（血清 抗體效價(jià)為1 =64000,卵黃抗體效價(jià)為11. 5ng/ml)，表明所獲得的重組蛋白具有理想生物 學(xué)活性。
[0020] 本發(fā)明第二方面公開了一種用于擴(kuò)增兔白介素1β的引物序列，包括上游引物Fl 和下游引物F2,上游引物Fl的序列如SEQIDNO:2所示，下游引物F2的序列如SEQIDNO: 3所示。
[0021] 進(jìn)一步的，前述引物擴(kuò)增的模板為含有SEQIDNO:1所示基因序列的DNA。
[0022] 更進(jìn)一步的，前述引物擴(kuò)增的模板為pUC57_rabbitIL-Iβ質(zhì)粒。
[0023] 本發(fā)明第三方面公開了前述制備兔白介素1β的方法以及用于擴(kuò)增兔白介素1β 的引物對(duì)在兔白介素1β重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0024] 本發(fā)明公開了制備兔白介素1β的方法以及純化復(fù)性技術(shù)，制備的高純度產(chǎn)品可 用于ELISA酶聯(lián)免疫分析，疾病診斷，或白介素1β抗體制備等領(lǐng)域。
[0025] 本發(fā)明的有益效果是：本專利通過基因重組、重組蛋白表達(dá)純化和復(fù)性技術(shù)獲得 可溶性高純度的兔白介素1β重組蛋白，所獲得的重組蛋白具有理想的免疫原性（生物活 性），在國內(nèi)屬首創(chuàng)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1為兔白介素1β基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，其中M為Marker，1為PCR擴(kuò)增出的兔白 介素1β基因；
[0027] 圖2為PCR擴(kuò)增兔白介素1β基因雙酶切和原核表達(dá)載體pET32a雙酶切結(jié)果。其 中M為Marker，1為pET32a雙酶切后條帶，大小為5. 9kb;2為PCR擴(kuò)增兔白介素1β基因 雙酶切條帶基因大小為807bp;
[0028] 圖3為兔白介素1 β原核表達(dá)載體的克隆篩選及鑒定結(jié)果；
[0029] 圖4為編號(hào)①的陽性克隆測序結(jié)果和NCBI公布的目的基因序列比對(duì)；
[0030] 圖5為兔白介素1 β蛋白表達(dá)和檢測結(jié)果，其中1為陰性對(duì)照，2為誘導(dǎo)表達(dá)后的 裂解液上清，3為誘導(dǎo)表達(dá)后的裂解液沉淀（包涵體）；
[0031] 圖6為兔白介素1β蛋白鎳柱純化結(jié)果，其中1為Marker, 2-15分別代表純化收 集的1-14管兔白介素1β重組蛋白；
[0032] 圖7為兔白介素1β蛋白的復(fù)性結(jié)果，其中1為包涵體兔白介素1β蛋白經(jīng)透析 復(fù)性后的結(jié)果；
[0033] 圖8為兔白介素1β蛋白活性檢測結(jié)果；其中，A為雞血清中抗體效價(jià)（血清稀釋 64000倍），B為卵黃抗體效價(jià)；血清和卵黃均顯示隨著免疫次數(shù)增加，抗體滴度增加。

【具體實(shí)施方式】
[0034] 以下結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并 非用于限定本發(fā)明的范圍。
[0035] 實(shí)施例1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
[0036]LPCR擴(kuò)增
[0037] 根據(jù)已知的兔白介素1β基因序列（SEQIDNO: 1所示）設(shè)計(jì)PCR上游引物和下 游引物如下：
[0038]上游引物Fl5' -CGGGATCCATGGCAACAGTACC-3' (SEQIDNO: 2)
[0039]下游引物F2 5, -CCGCTCGAGTTAGGAAGACACG-3' (SEQIDNO: 3)
[0040] 以pUC57_rabbitIL-Ιβ質(zhì)粒（購自煙臺(tái)基諾萊斯生物科技有限公司，商品 RabbitILbetacDNAPlasmid)為模板，采用上游引物Fl和下游引物F2,在PCR儀中擴(kuò)增 兔白介素1β基因。PCR擴(kuò)增程序見下表1，基因擴(kuò)增結(jié)果見圖1，目的基因?yàn)?07bp。
[0041] 表IPCR擴(kuò)增程序
[0042]

【權(quán)利要求】
1. 一種制備兔白介素10重組蛋白的方法，包括以下步驟： 1) 引物設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)并合成擴(kuò)增兔白介素10的引物，引物序列如SEQ ID NO :2-3所示； 2. PCR擴(kuò)增：以含有SEQ ID NO : 1所示基因序列的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò) 增程序?yàn)椋?5°C預(yù)變性15min ;94°C 45s，58°C 45s，72°C 60s，共30個(gè)循環(huán)；最后72°C延續(xù) lOmin，獲得擴(kuò)增產(chǎn)物； 3) 重組質(zhì)粒的構(gòu)建：采用內(nèi)切酶酶切前述擴(kuò)增產(chǎn)物后連接到同一內(nèi)切酶酶切的原核 表達(dá)載體pET32a質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞DH5 a，篩選重組質(zhì)粒并測序； 4) 蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)：測序正確的重組質(zhì)粒命名為pET32a-rabbit IL-1 0，轉(zhuǎn)化感受態(tài) 細(xì)胞BL21，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白表達(dá)； 5) 蛋白純化：菌體裂解后收集包涵體，鎳柱純化后經(jīng)蛋白復(fù)性，獲得純化的兔白介素 重組蛋白。
2. 如權(quán)利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟5)所述蛋白純化具體包括以下步 驟： A. 包涵體處理：采用裂解液裂解菌體后離心棄上清，采用Buffer B1溶解沉淀并離心， 上清含有兔白介素10包涵體蛋白用于下一步的分離純化； B. 分離純化：分離純化采用鎳柱親和層析，層析介質(zhì)為Ni-NTA，以20ml滅菌水清洗 Ni-NTA預(yù)裝柱，然后用10ml Buffer B2平衡Ni-NTA預(yù)裝柱后上樣；再用10ml Buffer B2 和20ml Wash Buffer清洗Ni-NTA預(yù)裝柱；最后用10ml Buffer E洗脫Ni-NTA預(yù)裝柱，收 集洗脫液，獲得純化的兔白介素10包涵體蛋白； C. 蛋白復(fù)性：將兔白介素10包涵體蛋白稀釋到濃度在0. ly g/yl以下，經(jīng)TGE緩沖 液透析，濃縮，收集獲得復(fù)性后的兔白介素10蛋白。
3. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟A所述裂解液的配方為：50mM NaH2P04、300mM NaCl、10mM 咪唑、0? 5mM PMSF, pH8. 0 ;所述 Buffer B1 的配方為：100mM NaH2P04、10mM Tris、6M 鹽酸胍，pH8. 0。
4. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟B所述Buffer B2的配方為：100mM NaH2P04、10mM Tris、8M 尿素，pH8. 0 ;所述 Wash Buffer 的配方為：100mM NaH2P04、10mM Tris、20mM咪唑、8M尿素，pH8.0 ;所述Buffer E 的配方為：100mM NaH2P04、10mM Tris、250mM 咪唑、8M尿素，pH8. 0。
5. 如權(quán)利要求2所述的制備方法，其特征在于，步驟C所述TGE緩沖液的配方為： 50mM Tris-HCl、50mM NaCl、0.5mM EDTA、5% 甘油、1% 甘氨酸、lOmMP-巰基乙醇、0.5mM PMSF，pH8. 0。
6. -種用于擴(kuò)增兔白介素 IP的引物序列，包括上游引物F1和下游引物F2,上游引物 F1的序列如SEQ ID NO :2所示，下游引物F2的序列如SEQ ID NO :3所示。
7. 如權(quán)利要求6所述的引物序列，其特征在于，所述弓丨物擴(kuò)增的模板為含SEQ ID NO: 1所示序列的質(zhì)?；蚧蚱?。
8. 如權(quán)利要求7所述的引物序列，其特征在于，所述引物擴(kuò)增的模板為pUC57-rabbit IL-1P質(zhì)粒。
9. 權(quán)利要求1-5任一權(quán)利要求所述制備方法以及權(quán)利要求6-8任一權(quán)利要求所述引物 在兔白介素10重組蛋白生產(chǎn)中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/70GK104357473SQ201410529417
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月9日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月9日
【發(fā)明者】陳金文, 李文靜, 張文文, 陳凌燕, 路雅麗, 姜自彬 申請(qǐng)人:煙臺(tái)基諾萊斯生物科技有限公司