抗原模擬表位及其用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及模擬伏馬菌素B1的抗原模擬表位，其氨基酸序列為GDGVHKSHDIRG。本發(fā)明FB1抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的FB1標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于FB1的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然FB1分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了FB1對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。
【專利說(shuō)明】一種模擬伏馬菌素I抗原模擬表位及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]伏馬菌素8丨，1?)是一種常見(jiàn)的真菌毒素，主要由串珠鐮刀菌(^11881-111111產(chǎn)生研究表明，即丨對(duì)人類(lèi)及動(dòng)物具有較強(qiáng)的毒性作用，包括神經(jīng)毒性、生殖毒性、胚胎毒性及致畸致癌等，國(guó)際癌癥研究中心已把即工化分為28組，即對(duì)人類(lèi)可能的致癌物。目前，多數(shù)國(guó)家已經(jīng)對(duì)谷物、糧食及食品中？8工的殘留含量設(shè)定了限量標(biāo)準(zhǔn)，如聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織(1^0)規(guī)定每日最大允許攝入總量為2吒/匕體重；瑞士規(guī)定糧食中和？82總殘留限量為1000吒/匕
[0003]目前，檢測(cè)食品中1?的方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、薄層色譜及免疫學(xué)檢測(cè)等方法，免疫學(xué)檢測(cè)方法以其靈敏度高、檢測(cè)方便、成本低廉等優(yōu)勢(shì)在的檢測(cè)中得到了廣泛的應(yīng)用。然而，在建立免疫學(xué)檢測(cè)方法的過(guò)程中，必須使用即工標(biāo)準(zhǔn)品為原料來(lái)制備競(jìng)爭(zhēng)抗原或者固相包被抗原，不僅價(jià)格昂貴而且具有極強(qiáng)的致癌性，對(duì)檢測(cè)人員的健康和環(huán)境造成極大的威脅，從而在一定程度上制約了免疫學(xué)檢測(cè)方法的應(yīng)用和推廣。有鑒于此，人們開(kāi)始采用抗獨(dú)特型抗體及抗原模擬表位技術(shù)來(lái)實(shí)現(xiàn)有害小分子物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)品的替代，并取得了一定的進(jìn)展。噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)的主要特點(diǎn)是可有效地篩選出與目標(biāo)靶體特異結(jié)合的噬菌體展示多肽，該技術(shù)在探索受體與配體之間相互作用結(jié)合位點(diǎn)、尋求高親和力生物活性的配體分子、探索未知蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)表位、新型疫苗的研制等方面應(yīng)用廣泛。
[0004]本發(fā)明通過(guò)用噬菌體展示肽庫(kù)技術(shù)，從肽庫(kù)中篩選出能與靶分子(抗1?單克隆抗體)特異性結(jié)合的多肽(抗原模擬表位),該抗原模擬表位具有與天然分子相似的免疫反應(yīng)特性，通過(guò)獲得的1?抗原模擬表位，以代替價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的1?標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于？8工的免疫學(xué)檢測(cè)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明以抗1?單克隆抗體為靶分子，將靶分子固相包被于酶標(biāo)板上，投入噬菌體隨機(jī)展示十二肽庫(kù)，進(jìn)行親和淘選，獲得了七種？8工的抗原模擬表位。它們的氨基酸序列如下:
麗八艦 1321^0、'邠預(yù)、1^21^111(03？、

1^01(33 祖^ 鼎？。
[0006]本發(fā)明還涉及編碼上述抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸序列，分別對(duì)應(yīng)為: ^1^1606606^161^11066^16601^016^, 1111^1^01^61006661066^06^610^11^1^16
、^110^10^66^61160611^1^01^66^1101006,6666^16666160^1^61060^16^1^10061666,八。1^060110^6^16061^616^6^166016^16^1、、^0X0666^1^6106106^161166^6061166006 上述抗原模擬表位(多肽)結(jié)構(gòu)中，大寫(xiě)英文字母分別代表二十一種已知天然型氨基酸殘基或其0-型異構(gòu)體的一種，0代表半胱氨酸殘基，0代表天冬氨酸殘基，？代表脯氨酸殘基，I？代表精氨酸殘基，X代表賴氨酸殘基，代表組氨酸殘基，I代表異亮氨酸殘基，V代表纈氨酸殘基，^代表酪氨酸殘基，8代表絲氨酸殘基，？代表苯丙氨酸殘基，2代表谷氨酸殘基，I代表甲硫氨酸殘基，6代表甘氨酸殘基，I代表亮氨酸殘基，0代表谷氨酰胺殘基，I代表色氨酸殘基，^代表天冬酰胺殘基，^代表丙氨酸殘基，X代表蘇氨酸殘基。
[0007]本發(fā)明提及的抗原模擬表位(多肽)可通過(guò)噬菌體擴(kuò)增、化學(xué)合成或基因工程重組表達(dá)的方式進(jìn)行大量制備。噬菌體擴(kuò)增是指將展示有？81抗原模擬表位(多肽)的噬菌體，通過(guò)生物擴(kuò)增的方式，大量繁殖生產(chǎn)展示有？81抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子?；瘜W(xué)合成是指依據(jù)公布的抗原模擬表位的氨基酸序列，通過(guò)化學(xué)合成多肽的方式進(jìn)行多肽合成。基因工程重組表達(dá)的方式是指將編碼？81抗原模擬表位的基因，通過(guò)克隆至表達(dá)載體，以多肽-融合蛋白的形式進(jìn)行抗原模擬表位的大量制備。
[0008]本發(fā)明還涉及所述伏馬菌素8工抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。免疫學(xué)檢測(cè)的類(lèi)型包括酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)、膠體金免疫層析、免疫斑點(diǎn)雜交等基于抗原-抗體特異性反應(yīng)的免疫學(xué)分析檢測(cè)類(lèi)型。
[0009]本發(fā)明伏馬菌素8工抗原模擬表位(剛八艦132嫩10、吖13？⑶13冊(cè)1、1^20^11(03？、⑶11?謝32嫩00、3祖10罰0打1！1、1801(33祖^鼎？)在應(yīng)用時(shí)，可以把合成的模擬表位用于免疫學(xué)檢測(cè)分析，將通過(guò)噬菌體擴(kuò)增獲得的展示有抗原模擬表位(多肽)的噬菌體粒子直接用于分析檢測(cè)，當(dāng)然，也可以將抗原模擬表位從噬菌體上切下來(lái)代替即工標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)進(jìn)行免疫學(xué)檢測(cè)分析。
[0010]還涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0011]還涉及伏馬菌素8工抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
[0012]前述伏馬菌素8工抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的即工標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于？8工的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然1?分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。
[0013]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明伏馬菌素8工抗原模擬表位可以替換價(jià)格昂貴且毒性強(qiáng)的標(biāo)準(zhǔn)品，并作為競(jìng)爭(zhēng)抗原或固相包被抗原應(yīng)用于1?的免疫學(xué)檢測(cè)，該抗原模擬表位具有與天然1?分子相似的免疫反應(yīng)特性，效果非常好。減少了 1?對(duì)人體健康的危害，節(jié)約了成本，具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0014]圖1為以？81抗原模擬表位建立的間接競(jìng)爭(zhēng)此標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為7 = -144.5111(^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1匕。值為0.562耶?[，線性檢測(cè)范圍為0.171?2.420叩/爪[，最低檢測(cè)限為0.121叩/齓。

【具體實(shí)施方式】
[0015]實(shí)施例1.1?抗原模擬表位的親和淘選及其鑒定 1)1?抗原模擬表位的親和淘選:具體方法為:用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，并以終濃度100 ^8/1111包被96孔酶標(biāo)板，41孵育過(guò)夜。第二天用1831 (50禮^01,邱7.5包含0.1% 1^6611-20卜八))洗滌10次后，加入300 988^？88? 41孵育2小時(shí)。2小時(shí)后棄封閉液，用1831洗滌5次，每孔加入100 ^ 1噬菌體肽庫(kù)(噬菌體展示十二肽庫(kù)，購(gòu)自肥8公司，用183 10倍稀釋噬菌體原液，約1.0^10111^11),22-261振蕩反應(yīng)1小時(shí)。棄去未結(jié)合的噬菌體，用1831洗滌10次，結(jié)合上的噬菌體用 0.2 1 61^01116-1101 (邱 2.2)洗脫，并立即用 15 ^111 11-18-1101 (邱 9.1)中和。取10 ^1洗脫噬菌體測(cè)滴度，其余的用于感染20 III[生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)前期的X 0011 ￡82738菌株進(jìn)行擴(kuò)增。第三天用？％7^乂1沉淀純化噬菌體，并測(cè)定擴(kuò)增后噬菌體的滴度。
[0016]在第二、第三輪的淘選過(guò)程中，包被的抗？8工單克隆抗體濃度分別為75 4 [和50 11 所用的丁83丁濃度為0.25%和0.5%，其余步驟同上。
[0017]2)陽(yáng)性噬菌體克隆的鑒定:從第三輪淘選后測(cè)定噬菌體滴度的平板中隨機(jī)挑取20個(gè)曬菌體斑,進(jìn)行曬菌體的擴(kuò)增，采用間接酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)方法￡112711161111^6(1 1111111111108801-136111: 88887,3八)進(jìn)行陽(yáng)性卩遼菌體克隆的鑒定，具體方法為:首先，用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10呢/此包被96孔酶標(biāo)板，41孵育過(guò)夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進(jìn)行封閉，371孵育1小時(shí)；投入100耵噬菌體斑擴(kuò)增液(1.0 X 1011時(shí)10，以原始噬菌體肽庫(kù)作為陰性對(duì)照，37 I孵育1小時(shí)；加入1:5000倍稀釋的！II？？標(biāo)記抗113噬菌體二抗100沿，37。。孵育1小時(shí)；加入10041 118底物液，避光顯色5-11,酶標(biāo)儀8016111:1^10 11111:18^811 ？0讀取450 11111處的吸收值。選取0045。大于陰性對(duì)照2倍的卩遼菌體克隆為陽(yáng)性克隆。
[0018]3) 抗原模擬表位的鑒定:采用間接競(jìng)爭(zhēng)此的方法進(jìn)行1?抗原模擬表位的鑒定，具體方法為:用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10呢/111[包被酶標(biāo)板，41孵育過(guò)夜；第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進(jìn)行封閉，371孵育1小時(shí)；投入50沿經(jīng)間接此鑒定為陽(yáng)性的丨邀菌體克隆(1.(^1011時(shí)11)和50耵1?標(biāo)準(zhǔn)品(濃度范圍為0-20
時(shí)；加入1:5000稀釋冊(cè)？標(biāo)記的抗肌3噬菌體二抗100沿，371孵育1小時(shí)；加入100沿118底物液，避光顯色5111111，讀取0045。，能結(jié)合抗叩工單克隆抗體，且能被1?標(biāo)準(zhǔn)品所阻斷的噬菌體，鑒定為1?的抗原模擬表位。
[0019]實(shí)施例2.1?抗原模擬表位編碼基因的測(cè)序及其氨基酸序列的確定
將經(jīng)過(guò)間接競(jìng)爭(zhēng)此鑒定展示有？81抗原模擬表位的噬菌體進(jìn)行擴(kuò)增，提取噬菌體的0嫩測(cè)序模板。簡(jiǎn)要過(guò)程如下:進(jìn)行噬菌體擴(kuò)增，在第一步離心后，將800沿含噬菌體上清轉(zhuǎn)入一新離心管。加入200耵[郎/似口沉淀噬菌體。離心后將沉淀重懸于100耵碘化物緩沖液(10禮11-18-1101 (邱8.0), 1禮￡01^, 4 I耵無(wú)水乙醇沉淀0嫩，離心后再用70%乙醇洗滌沉淀(0嫩測(cè)序模板沉淀最終重懸于20耵滅菌水，取2沿進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析；取5叱噬菌體模板進(jìn)行0嫩測(cè)序，其-96 8111測(cè)序引物為:5,-0?^^ 1^6 11^ 606 06~3\依據(jù)0嫩測(cè)序結(jié)果及密碼子表可獲得1?抗原模擬表位的氨基酸序列。它們的氨基酸序列如下:
麗八艦 1321^10、？打3？訓(xùn)！'邠預(yù)、1^21^111(03？、
1^01(33 祖^ 鼎？。
[0020]實(shí)施例3.1?抗原模擬表位作為競(jìng)爭(zhēng)抗原在此1“中的應(yīng)用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關(guān)食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊(cè)1號(hào)濾紙進(jìn)行過(guò)濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0021](2)包被及封閉
用10禮？88 (邱7.4)稀釋抗1?單克隆抗體，10吒/此包被酶標(biāo)板，41孵育過(guò)夜。第二天用？831 (10 1111 ^88, 0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？88進(jìn)行封閉，371孵育1小時(shí)后，用洗板6次待用。
[0022]( 3 )標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50沿展示有1?抗原模擬表位的噬菌體(1.(^1011時(shí)11)和一系列不同濃度的50耵即工標(biāo)準(zhǔn)品，371孵育1小時(shí)。加入1:5000稀釋！II？？標(biāo)記的抗113噬菌體二抗，371孵育1小時(shí)。然后用118底物顯色，讀取0045。。以濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的00450父100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果顯示標(biāo)準(zhǔn)曲線呈3型，線性相關(guān)性較好(圖0。如圖1，以？81抗原模擬表位(氨基酸序列為剛—鮮32嫩10)建立的間接競(jìng)爭(zhēng)此13八標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性回歸方程為 7 = -144.5111^) + 196.18，尺2 = 0.9609，1(350^^ 0.5621^/01，線性檢測(cè)范圍為0.17廣2.420叩/^，最低檢測(cè)限為0.121叩/齓。
[0023](4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50沿展示有1?抗原模擬表位的噬菌體(1.(^1011 口血)和待測(cè)樣品提取液，371孵育1小時(shí)。加入1:5000稀釋冊(cè)？標(biāo)記的抗113噬菌體二抗，371孵育1小時(shí)。然后用118底物顯色，讀取0045。，計(jì)算結(jié)合率，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線，倒推出樣品中？^工的含量。
[0024]實(shí)施例4.1?抗原模擬表位作為固相抗原在此1“中的應(yīng)用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關(guān)食品),加入25毫升60 %的甲醇-？83溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊(cè)1號(hào)濾紙進(jìn)行過(guò)濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0025](2)包被及封閉
用10禮？88 (邱7.4)稀釋展示有即工抗原模擬表位的噬菌體(2.0^1011時(shí)11), 100微升包被于酶標(biāo)板，41孵育過(guò)夜。第二天用？831 (10禮？83，0.05% 1^6611-20卜八))洗滌3次后，用含有3%脫脂奶粉的？83進(jìn)行封閉，371孵育1小時(shí)后，用洗板6次待用。
[0026](3)標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50耵抗1?單克隆抗體(0.5叩/“)和一系列不同濃度的50耵標(biāo)準(zhǔn)品，371孵育1小時(shí)。加入1:2000稀釋！?。?？？標(biāo)記的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小時(shí)。然后用118底物顯色，讀取0045。。以1?濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0027](4)樣品的檢測(cè)
取出經(jīng)步驟(2)處理好的板條，每孔分別投入50耵抗1?單克隆抗體(0.5叩/“)和一系列不同濃度的50耵標(biāo)準(zhǔn)品，371孵育1小時(shí)。加入1:2000稀釋?。。?？？標(biāo)記的羊抗鼠I姊二抗，371孵育1小時(shí)。然后用118底物顯色，讀取0045。。以1?濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，結(jié)合率(加入％的孔的00-/未加入％的孔的0045。父100%)為縱坐標(biāo)，建立間接競(jìng)爭(zhēng)標(biāo)準(zhǔn)曲線。
[0028]實(shí)施例5.1?抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析分析中的應(yīng)用 (1)樣品提取
稱取如樣品(谷物及其相關(guān)食品),加入25毫升60 %的甲醇溶液，200印111振蕩5分鐘；將提取液用—￡1飽冊(cè)1號(hào)濾紙進(jìn)行過(guò)濾后，取1毫升濾液加入4毫升？83 (磷酸鹽緩沖液，邱=7.2)混勻后，即為樣品提取液，待用。
[0029](2)噬菌體及控制線的點(diǎn)陣
用10禮？88 (邱7.4)稀釋展示有本發(fā)明即工抗原模擬表位的噬菌體(2.(^1011口血)，用點(diǎn)陣儀或微量移液器將噬菌體劃線于硝酸纖維素膜上(孔徑0.2-0.45微米),作為檢測(cè)線；將0丨5呢/“的冊(cè)？標(biāo)記的羊抗鼠I姊二抗，用點(diǎn)陣儀或微量移液劃線于同一張硝酸纖維素膜上(位于檢測(cè)線的上方，距離大于5毫米),作為控制線。
[0030]( 3 )膠體金標(biāo)記1?抗體
將抗體逐滴加入膠體金溶液(邱=8.2)中，邊滴邊攪拌，30分鐘后，取1% ？26加入上述溶液中，繼續(xù)攪拌15分鐘后加入十分之一體積的10% 8“溶液，攪拌15分鐘后，靜置30分鐘，離心后去上清，得到膠體金標(biāo)記的1?抗體溶液。
[0031](4)膠體金檢測(cè)卡的組裝
將膠體金標(biāo)記的抗體點(diǎn)噴于膠金墊上(1.0微克/毫升),將樣品墊、膠金墊，點(diǎn)陣了檢測(cè)線和控制線的硝酸纖維素膜和吸收紙進(jìn)行組裝，切成試紙條，裝入檢測(cè)卡中待用。
[0032](5)樣品的檢測(cè)
將樣品提取液加入樣品墊中，靜置10分鐘，若樣品中含有1?且超過(guò)膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域不顯色，而控制線區(qū)域顯色；若樣品中不含有？8工且低于膠體金檢測(cè)試紙的檢測(cè)閾值，則檢測(cè)線區(qū)域顯色，控制線區(qū)域也顯色。若控制線區(qū)域不顯色，表明試紙條失效。
[0033]實(shí)施例5 抗原模擬表位的大量制備 (1)以曬菌體擴(kuò)增的方式
將展示有？81抗原模擬表位的噬菌體加入至20 “接種有21？ 2738的培養(yǎng)物中，37度220 11)111振蕩培養(yǎng)4.5卜。將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4 V 10000 1~卿離心10 ―!!，將上清的上部80 %轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的？I下靜置120砧!!。400 10000印111離心？郎/似⑶靜置溶液15舊!!。棄上清，短暫離心后吸去殘留上清液。加入1此188進(jìn)行重懸，即為噬菌體擴(kuò)增液。
[0034](2)以1?抗原模擬表位-融合蛋白的方式進(jìn)行制備八.擴(kuò)增抗原模擬表位的外源編碼基因
反應(yīng)體系:(50虬) 10 X Pyrobest Buffer (Mg2+ plus)5 M-L
dNTP Mixture (each for 2.5 mM)4 M-L
M13KE insert extens1n primer (10 mM)I M-L
-96 gill sequencing primer (10 mM)I M-L
噬菌體DNA模板I μ?
Pyrobest DNA Polymerase0.5 M-L
滅菌 ddH2037.5 μ?
PCR 反應(yīng)條件:95°C 5 min，接著 95°C 30 sec, 55°C 30 sec, 72°C 40sec，72°C10 min 共 30 cycles。
[0035]采用PCR產(chǎn)物回收試劑盒純化PCR產(chǎn)物，微量核酸定量?jī)x定量。FBI抗原模擬表位的編碼基因序列分別對(duì)應(yīng)為:
AATAATGCGGCGATGTATTCGGAGATGGCTACTGA、TTTTATACTAGTCCGGGTCGGACGAGTCATTATATG、ATTCATCAGGAGTTGCGTTATACTAAGGATTCTCCG、GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG、ACTACGCTTCAGATGCGTAGTGAGATGGCTGATGAT、TCGATGCTTAATGATTATCGTGATTATACTACTCAT、ACTCGGGATAAGTCGTCGATGTTGGAGCGTTGGCCG
B.外源編碼基因及表達(dá)載體的雙酶切
分別采用ACC65I和Eag I酶對(duì)外源編碼基因和表達(dá)載體(pMAl-pIII，NEB公司，可表達(dá)MBP融合蛋白)進(jìn)行雙酶切。
[0036]C.酶切后產(chǎn)物的連接及轉(zhuǎn)化
將質(zhì)粒pMal-ΡΙΙΙ和目的片段以1: 10(摩爾比)混勻，于16 °C水浴連接12 h,取10 μ L連接產(chǎn)物加至100 μ L感受態(tài)細(xì)胞TBl中，充分混勻。冰浴30 min后，42 V水浴熱激90 S，立即冰浴5 min后補(bǔ)加600 μ L LB液體培養(yǎng)液，37 °C, 200 rpm培養(yǎng)I h，10000rpm離心2 min,吸去上清留取約200 μ L,涂布于LB-A固體(Ampr)培養(yǎng)基中，37 °C過(guò)夜培養(yǎng)，得到陽(yáng)性克隆。
[0037]D.FB1抗原模擬表位-MBP融合蛋白的表達(dá)
將上述獲得的陽(yáng)性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5 mL LB-A，0.2%蔗糖中，37°C，220 r/min，振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，將過(guò)夜培養(yǎng)物按I %接種量(v/v)接種于50 mL的LB_A，0.2 %蔗糖培養(yǎng)基中，分別接種3瓶，37°C，220 r/min振蕩培養(yǎng)，當(dāng)培養(yǎng)物細(xì)菌濃度0D600達(dá)到0.6時(shí)，向三瓶培養(yǎng)物中加入IPTG至終濃度為0.2 mmol/L,220 r/min振蕩培養(yǎng)，將誘導(dǎo)物(PEG溶液)于4 0C, 4000 g，離心20 min收集菌體沉淀，棄上清。重懸細(xì)胞于400 mL 30mM Tris-HCl，20%蔗糖，pH 8.0 (80 mL/g細(xì)胞濕重)，加入EDTA至I mM，室溫下震蕩5-10min,8000 g,4°C,離心20 min,棄上清,沉淀重懸于400 ml預(yù)冷的5 mM MgS04,冰上震蕩10min,8000 g,4°C,離心20 min,保留上清，向上清液中加入8 mL I M Tris-HCl, pH 7.4,獲得FBl抗原模擬表位-MBP融合蛋白。
【權(quán)利要求】
1.一種模擬伏馬菌素B1抗原模擬表位，其特征在于氨基酸序列為:GDGVHKSHDIRG。
2.編碼權(quán)利要求1所述模擬伏馬菌素B1抗原模擬表位氨基酸序列的核苷酸。
3.如權(quán)利要求2所述的核苷酸，序列對(duì)應(yīng)為: GGGGATGGGGTGCATAAGTCGCATGATATCCGTGGG。
4.權(quán)利要求1所述模擬伏馬菌素B1抗原模擬表位在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
5.如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于模擬伏馬菌素B1抗原模擬表位以固相抗原或競(jìng)爭(zhēng)抗原在免疫學(xué)檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
6.如如權(quán)利要求4所述應(yīng)用，其特征在于模擬伏馬菌素B1抗原模擬表位作為固相抗原在膠體金免疫層析檢測(cè)分析中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104311636SQ201410529623
【公開(kāi)日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2013年3月6日 優(yōu)先權(quán)日:2013年3月6日
【發(fā)明者】何慶華, 許楊 申請(qǐng)人:南昌大學(xué)