香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光pcr檢測(cè)方法與應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，依次進(jìn)行以下步驟：①待鑒定樣品基因組DNA的提??；②以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用特異性引物和Taqman探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)；引物為：F-Primer:5’-CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3’，R-Primer:5’-AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3’，探針為：Probe：5’-(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3’。本發(fā)明能用于有效地從蛀果性害蟲(包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟等)中區(qū)分出香梨優(yōu)斑螟。
【專利說(shuō)明】香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法與應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種香梨優(yōu)斑螟污染的分子檢測(cè)方法，具體地說(shuō)，涉及一種香梨優(yōu)斑 螟熒光PCR檢測(cè)方法，其屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 香梨優(yōu)斑螟（Euzophera pyriella Yang)屬鱗翅目螟蛾科斑螟亞科優(yōu)斑螟屬的雜 食性害蟲，是1994年經(jīng)楊集昆教授定名的害蟲新種，為新疆特有的果樹蛀千害蟲。自20世 紀(jì)8〇^年代后期首次發(fā)現(xiàn)以來(lái)，擴(kuò)散蔓延，危害嚴(yán)重，其中庫(kù)爾勒香梨被害株率最高，受害株 率常高達(dá)100%，是香梨的主要害蟲之一。主要危害梨、蘋果、無(wú)花果、棗、杏、巴旦杏、桃等果 木，嚴(yán)重影響果品產(chǎn)量和品質(zhì)。
[0003]以幼蟲危#果樹和林木的枝、干，在寄主的靭皮部與木質(zhì)部之間蛀食為害，形成不 規(guī)則的隧道，影響寄主的生長(zhǎng)，嚴(yán)重時(shí)造成死枝。蛀孔外常堆集褐色顆粒狀糞便，較易識(shí)別。 幼蟲還危害果實(shí)，蛀食果肉，果心和種子，在新疆梨園、蘋果園中與其他食心蟲混合危害，使 蟲果率上升。該蟲危害可以引起梨樹腐爛病發(fā)生，造成樹勢(shì)衰弱，甚至死亡。
[0004] 香梨優(yōu)斑螟形態(tài)特征，成蟲：體長(zhǎng)6?10mm，翅展14?20mm。體大部分呈灰褐色 至暗褐色被鱗光滑。復(fù)眼大而圓赤褐色。前翅狹長(zhǎng)灰褐色，兩條灰白色橫線之間顏色較暗。 后翅灰褐，外緣較深，緣毛灰白。卵：橢圓形，長(zhǎng)約0. 55?0· 60mm，寬0· 30?0. 55圓，表面 密布網(wǎng)紋，初產(chǎn)時(shí)乳白色，孵化前暗紅色。幼蟲：老熟幼蟲體長(zhǎng)8?17mm，體色深灰色（灰 黑色），頭部棕褐色，腹足趾鉤 2序，全環(huán)式。蛹：長(zhǎng)約7mm，腹面黃褐色，背面褐色，臀刺12 或13個(gè)。
[0005]香梨優(yōu)斑螟的發(fā)生特點(diǎn)：一年發(fā)生3代，以老熟幼蟲在樹干的翹皮、裂縫、樹洞中 結(jié)灰白色長(zhǎng)形薄繭越冬，也有的在為害蛀食處或蘋果、梨的果實(shí)內(nèi)越冬。翌年3月下旬開始 化蛹，4月上、中旬為化蛹盛期，4月下旬為羽化盛期。第1、2代成蟲羽化高峰分別在 6月上 中旬和7月中下旬，第3代幼蟲7越下旬和8月上旬發(fā)生。 10月份幼蟲逐漸進(jìn)入越冬狀態(tài)。 幼蟲蛻皮4次，共5齡，幼蟲歷期25?40天，主要為害香梨樹枝桿和香梨果實(shí)。十幾年前 只在新疆局部個(gè)別香梨園為害，現(xiàn)已遍布天山南北，成為香梨等果樹的重要害蟲之一。
[0006]蘋果蠹蛾（Cydia pomonella L.)，梨小食心蟲（Grapholitha molesta(Busck))和 香梨優(yōu)斑螟為我國(guó)常見的蛀果性害蟲，此三種害蟲的低齡幼蟲在外部形態(tài)上非常相似，沒 有顯著差異，目前,我國(guó)檢疫部門對(duì)梨小食心蟲的分類鑒定主要是以老熟幼蟲或成蟲的外 部形態(tài)特征為依據(jù)，在果品出口、運(yùn)輸和實(shí)施檢疫控制前準(zhǔn)確地區(qū)分檢疫性害蟲是相當(dāng)必 要的，目前大多憑借形態(tài)學(xué)特征只能區(qū)分成蟲、晚齡期害蟲，大多數(shù)的檢疫性有害生物較短 暫的幼蟲階段很難依靠形態(tài)學(xué)特征精確區(qū)分，但蘋果蠹蛾、梨小食心蟲和香梨優(yōu)斑螟等有 舍·生物的幼蟲基本是在水果采收時(shí)大量出現(xiàn)，同時(shí)中、外雙方截獲的害蟲形態(tài)特點(diǎn)都不明 顯，有時(shí)以殘?bào)w形式出現(xiàn)，給種類的鑒定帶來(lái)很大困難。國(guó)外在截獲有害生物時(shí)，截獲檢疫 性有害生物和截獲一般有害生物，對(duì)貨物處理，產(chǎn)地的制裁，出口的限制有很大的區(qū)別。從 收到的國(guó)外通報(bào)看，對(duì)方國(guó)對(duì)截獲有害生物的鑒定結(jié)果五花八門，我方想對(duì)對(duì)方結(jié)果進(jìn)行 質(zhì)疑，缺乏有力的證據(jù)和方法。檢驗(yàn)方法的不成熟和低分辨率依然會(huì)造成進(jìn)口國(guó)在截獲檢 疫性有害生物時(shí)采取嚴(yán)厲制裁措施的風(fēng)險(xiǎn)。帶來(lái)過(guò)多的技術(shù)糾紛，增加禁止出口的風(fēng)險(xiǎn)，增 加檢疫性處理或者退貨會(huì)產(chǎn)生較大的費(fèi)用消耗。因此，建立一種香梨優(yōu)斑螟快速、靈敏、準(zhǔn) 確的分子生物學(xué)檢測(cè)方法是十分必要和緊迫的，對(duì)口岸檢疫和防治監(jiān)測(cè)都有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法。本發(fā)明 具體給出了用于香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的引物和Taqman探針，本發(fā)明能用于有效地 從蛀果性害蟲（包括梨小食心蟲、蘋果蠹蛾和香梨優(yōu)斑螟等）中區(qū)分出香梨優(yōu)斑螟。
[0008] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法， 檢測(cè)中所用的特異性引物和探針的核苷酸分別為 ：
[0009] 特異性引物為：
[0010] F-Pr imer: 5 ' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3，
[0011] R-Primer: 5，-MTAGGGTCTCCCCCTCCT-3，
[0012] 探針為：
[0013] Probe : 5 ' _ (FAM) CGGMTCTTMTACTTCTTTTTTTGACCCTG (TAMRA) -3 '。
[0014] B卩，本發(fā)明給出了一種香梨優(yōu)斑螟的鑒定引物，其核酸序列如SEQ ID No. 1和2所 示，其中，SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列為正向引物，SEQ ID No. 2所示的核苷酸序列為反 向引物。
[0015] YB-FP :5' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3'（SEQ ID No· 1)或其互補(bǔ)鏈；
[0016] YB-RP :5' -AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3'（SEQ ID No. 2)或其互補(bǔ)鏈；
[0017] 本發(fā)明用于香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)的Taqman探針，該探針針對(duì)上述引物的 擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)，其核苷酸序列如SEQ ID No. 3所示，即本發(fā)明所述的Taqman探針為：5'-(FAM) CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)_3'（SEQ ID No. 3)或其互補(bǔ)鏈。
[0018] 本發(fā)明所述的引物和Taqman探針由Takara(大連，中國(guó)）公司委托合成及標(biāo)記。
[0019] 特別地，本發(fā)明利用通用引物對(duì)不同地區(qū)的31次采樣的近500只香梨優(yōu)斑螟、蘋 果蠹蛾和梨小食心蟲樣本進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物純化、克隆、測(cè)序后，分別得到527bp，504bp 和517bp的序列，各物種的C0I基因長(zhǎng)片段用CLUSTAL 2. 1和DNA-star等軟件進(jìn)行比對(duì) 分析，篩選出差異位點(diǎn)較多的區(qū)段，進(jìn)而在該區(qū)段使用Primer premier 5.0和ABI Primer ExpreSS3. 0軟件設(shè)計(jì)特異性引物和熒光探針，并用BLAST程序驗(yàn)證引物特異性。該引物/ 探針組合具有較高的檢測(cè)靈敏度和擴(kuò)增特異性，能高效的將香梨優(yōu)斑螟與其他相似的檢驗(yàn) 檢疫性害蟲區(qū)分開。
[0020] 本發(fā)明還提供了一種使用上述香梨優(yōu)斑螟特異性引物和Taqman探針鑒定香梨優(yōu) 斑螟的方法，包括以下步驟：
[0021] ①待鑒定樣品基因組DNA的提?。?br> [0022] ②實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置：
[0023] 以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用上述特異性引物和探針（Taqman探針），進(jìn)行實(shí)時(shí)熒 光PCR檢測(cè)；
[0024] ③擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷：根據(jù)實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線判定樣品檢測(cè)結(jié)果。
[0025] 其中，步驟①提取樣品基因組DNA的具體步驟為：將待鑒定樣品放入研缽內(nèi)，導(dǎo) 入液氮，充分研磨后，加入裂解液，待溶化后用移液器轉(zhuǎn)移至1. 5mL離心管內(nèi)，采用試劑盒 離心柱法提取基因組DNA，試劑盒共采用了北京全式金（EE111)、天根（DP304)、北京鼎國(guó) (NEP001)、Qiagen (69504)等4種植物DNA提取試劑盒。DNA濃度及純度通過(guò)ND-2000C核 酸蛋白分析伩檢測(cè)。
[0026] 所述的樣品為香梨優(yōu)斑螟成蟲，老熟幼蟲，小齡幼蟲，蛹和殘?bào)w，或經(jīng)糖醋液捕捉 到的蟲體。
[0027] 作為本發(fā)明的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的改進(jìn)：
[0028] 探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料（根據(jù)所采用的實(shí)時(shí)熒光PCR儀的配置而定）， 所述報(bào)告熒光染料為FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、CY3或CY5,探針的3'端標(biāo)記有淬滅熒 光染料，所述淬滅熒光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ或ECLIPSE。
[0029] 作為本發(fā)明的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的進(jìn)一步改進(jìn)：
[0030] 步驟②所用檢測(cè)試劑的具體組成如下：25 μ L總體積中含有10XPCR Buffer (含 Mg2+) 2. 5 μ L，dNTP (2. 5 mM，each) 2 μ L，上下游引物（10 μ Μ)各 0· 5 μ L，探 針（10μΜ)0. 5uL，500 U Taq DNA聚合酶0. 25uL和DNA模板（由步驟①提取得到的溶 液）2μ L，補(bǔ)水至25μ L。
[0031] 在本發(fā)明中，同時(shí)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)和陽(yáng)性對(duì)照、陰性對(duì)照以及空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，陽(yáng)性對(duì) 照由經(jīng)形態(tài)學(xué)專家驗(yàn)證的香梨優(yōu)斑螟體提取的DNA為模板，可確保核酸提取和擴(kuò)增反應(yīng)的 有效性；空白對(duì)照中不加模板DNA，而以滅菌蒸餾水代替，用于檢驗(yàn)是否存在PCR污染和較 高的引物二聚體污染；陰性對(duì)照為蘋果蠹蛾、梨小食心蟲提取的DNA為模板，避免出現(xiàn)假陰 性結(jié)果；設(shè)置三個(gè)重復(fù)確保數(shù)據(jù)可靠準(zhǔn)確。
[0032] 步驟②所述的實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)時(shí)的反應(yīng)參數(shù)為：95°C預(yù)處理15s,再以95°C變性 5s，60°C退火/延伸34s，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的60°C退火/延伸階段收集熒光信號(hào)。
[0033] 步驟③中檢測(cè)結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)為：根據(jù)樣品擴(kuò)增出具有指數(shù)增長(zhǎng)型的熒光擴(kuò)增曲 線，當(dāng)其Ct值小于35,且陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)熒光信號(hào)，說(shuō)明該樣品受到香梨優(yōu)斑螟污 染，否則不是香梨優(yōu)斑螟污染；當(dāng)檢測(cè)樣品Ct值小于35,但陰性對(duì)照/空白對(duì)照有熒光信 號(hào)，說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果不可信，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要重新做。
[0034] 本發(fā)明中所述的水均為無(wú)核酸酶污染的雙蒸水。
[0035] 在本發(fā)明中，步驟①的香梨優(yōu)斑螟待檢樣品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、 高鹽低pH法或試劑盒法進(jìn)行提取。
[0036] 本發(fā)明中還可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)曲線驗(yàn)證所設(shè)計(jì)引物和探針的擴(kuò)增效率以及對(duì)建立的 熒光PCR反應(yīng)進(jìn)行重復(fù)性和靈敏性分析。所述標(biāo)準(zhǔn)曲線是以前述的DNA擴(kuò)增模板的連續(xù)的 6個(gè)濃度梯度為樣品，每個(gè)樣品設(shè)置3個(gè)重復(fù)，擴(kuò)增得到的Ct值為縱坐標(biāo)，模板起始濃度的 對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)的關(guān)系曲線。
[0037] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：
[0038] 特異性高：本發(fā)明利用香梨優(yōu)斑螟C0I基因中的差異性序列設(shè)計(jì)特異性引物，用 該引物擴(kuò)增蘋果蠹蛾、香梨優(yōu)斑螟和梨小食心蟲，1 %瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果僅有香梨優(yōu)斑螟 樣本中出現(xiàn)一條114bp的清晰條帶，其它對(duì)照樣品均無(wú)條帶產(chǎn)生。此外，本發(fā)明還設(shè)計(jì)了一 條特異性熒光探針，在實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)過(guò)程中對(duì)靶片段進(jìn)行雙重質(zhì)控，利用上述的引物和探 針序列進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增驗(yàn)證，僅有香梨優(yōu)斑螟樣品出現(xiàn)了指數(shù)型的擴(kuò)增曲線，其余 對(duì)照樣品無(wú)熒光信號(hào)，本發(fā)明設(shè)計(jì)的引物和探針可以保證擴(kuò)增的特異性，避免假陽(yáng)性檢測(cè) 結(jié)果。
[0039] 重復(fù)性好：本發(fā)明使用DNA擴(kuò)增模板的連續(xù)6個(gè)濃度梯度樣品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，每個(gè) 樣品設(shè)置三個(gè)重復(fù)，這三個(gè)重復(fù)之間的變異系數(shù)在0. 114-0. 375之間，標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值為 0. 998,試驗(yàn)數(shù)據(jù)具有良好的線性關(guān)系，重復(fù)性較好。
[0040] 靈敏度高：本發(fā)明香梨優(yōu)斑螟C0I基因擴(kuò)增效率為92%，在可接受的PCR擴(kuò)增效 率范圍內(nèi)（9〇-11〇% )。DNA溶液在1. 91X10-3?mng/μ L的檢測(cè)范圍內(nèi)熒光定量PCR起 始模板濃度和Ct值之間具有較好的線性關(guān)系，本發(fā)明建立的分子檢測(cè)體系靈敏度較高，最 低檢出限在1· 91X 10 3ng/ μ L，即1. 91pg/ μ L，滿足檢驗(yàn)檢疫日常檢測(cè)需求。
[0041] 本發(fā)明所涉及的操作方法簡(jiǎn)單，易行，能夠在較短時(shí)間內(nèi)（約3小時(shí)）完成香梨優(yōu) 斑螟的鑒定，一次可檢測(cè)多個(gè)樣品，特別適合于大批量的抽樣檢查，可應(yīng)用到實(shí)際檢疫工作 中，不僅能大大縮短進(jìn)出口物品的通關(guān)時(shí)間，而且還能降低檢疫人員的工作強(qiáng)度，為進(jìn)出口 安全提供了技術(shù)保障。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0042] 下面結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明的【具體實(shí)施方式】作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。
[0043]圖1為使用本發(fā)明特異性引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增待檢樣本，陽(yáng)性對(duì)照，陰性 對(duì)照等成蟲樣本以及空白對(duì)照的擴(kuò)增曲線圖譜；
[0044] 1.通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為香梨優(yōu)斑螟成蟲的樣本為陽(yáng)性對(duì)照；
[0045] 2.疑似香梨優(yōu)斑螟成蟲的待檢樣本；
[0046] 3·通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為蘋果蠹蛾成蟲的樣本為陰性對(duì)照；
[0047] 4.通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為梨小食心蟲成蟲的樣本為陰性對(duì)照；
[0048] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對(duì)照。
[0049]圖2為使用本發(fā)明特異性引物和探針實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增待檢樣本，陽(yáng)性對(duì)照，陰性 對(duì)照等幼蟲（老熟幼蟲）樣本以及空白對(duì)照的擴(kuò)增曲線圖譜；
[0050] 1·通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為香梨優(yōu)斑螟幼蟲的樣本為陽(yáng)性對(duì)照；
[0051] 2.疑似香梨優(yōu)斑螟幼蟲的待檢樣本；
[0052] 3·通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為蘋果蠹蛾幼蟲的樣本為陰性對(duì)照；
[0053] 4·通過(guò)形態(tài)學(xué)專家鑒定為梨小食心蟲幼蟲的樣本為陰性對(duì)照；
[0054] 5.以滅菌蒸餾水為模板的空白對(duì)照。 ^ '
[00551圖3為使用10倍梯度稀釋的標(biāo)準(zhǔn)品在實(shí)時(shí)熒光PCR體系中擴(kuò)增的標(biāo)準(zhǔn)曲線圖譜；
[0056]

【權(quán)利要求】
1. 香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 檢測(cè)中所用的特異性引物和探針的核苷酸分別為： 特異性引物為： F-Primer:5 ' -CTGCCTTATTACTACTTCTTTCACTACCT-3 ' R-Primer:5 ' -AATAGGGTCTCCCCCTCCT-3 ' 探針為： Probe :5' -(FAM)CGGAATCTTAATACTTCTTTTTTTGACCCTG(TAMRA)-3'。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是依次進(jìn)行以下 步驟： ① 、待鑒定樣品基因組DNA的提?。? ② 、實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置： 以基因組DNA為擴(kuò)增模板，用上述特異性引物和探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)； ③ 、擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 探針的5'端標(biāo)記有報(bào)告熒光染料，所述報(bào)告熒光染料為FAM、HEX、JOE、VIC、NED、FITC、 CY3或CY5,探針的3'端標(biāo)記有淬滅熒光染料，所述淬滅熒光染料為TAMRA、ROX、dabcyl、BHQ 或ECLIPSE。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2或3所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 所述步驟②實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增體系設(shè)置為： 25. L 總體積中含有 10 XPCR Buffer2. 5 μ L，dNTP (2. 5mM，each) 2 μ L，上下游引物 (10 μ Μ)各 0· 5 μ L，探針（10 μ Μ) 0· 5 μ L，500U Taq DNA 聚合酶 0· 25 μ L 和 DNA 模板 2 μ L， 補(bǔ)水至25 μ L。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增條件為：95°C預(yù)處理15s ;再以95°C變性5s，60°C退火/延伸34s，進(jìn) 行40個(gè)循環(huán)，在每個(gè)循環(huán)的60°C退火/延伸階段收集熒光信號(hào)。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 所述步驟③的擴(kuò)增結(jié)果分析及結(jié)果判斷為：根據(jù)樣品擴(kuò)增出具有指數(shù)增長(zhǎng)型的熒光擴(kuò) 增曲線，當(dāng)其Ct值小于35,且陰性對(duì)照和空白對(duì)照無(wú)熒光信號(hào)，說(shuō)明該樣品受到香梨優(yōu)斑 螟污染，否則不是香梨優(yōu)斑螟污染；當(dāng)檢測(cè)樣品Ct值小于35,但陰性對(duì)照/空白對(duì)照有熒 光信號(hào)，說(shuō)明該檢測(cè)結(jié)果不可信，整個(gè)檢測(cè)過(guò)程需要重新做。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的香梨優(yōu)斑螟實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法，其特征是： 所述步驟①的香梨優(yōu)斑螟待檢樣品的DNA的提取可采用CTAB法、SDS法、高鹽低pH法 或試劑盒法進(jìn)行提取。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104232786SQ201410536563
【公開日】2014年12月24日 申請(qǐng)日期:2014年10月11日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月11日
【發(fā)明者】王鳳軍, 馮俊麗, 華鵬, 張偉, 張祥林, 王鵬舉, 郭鐵群, 劉永杰 申請(qǐng)人:中華人民共和國(guó)庫(kù)爾勒出入境檢驗(yàn)檢疫局