懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法
【專利摘要】懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞來生產(chǎn)金線蓮多糖的方法。本方法首先對金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中未分化的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊生長，同時選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高金線蓮多糖產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說明】懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及糖類生產(chǎn)技術(shù)，尤其涉及植物多糖的生產(chǎn)技術(shù)，具體為一種采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)金線蓮多糖的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金線蓮多糖類化合物是金線蓮的主要成分之一，金線蓮對支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝病、高血壓、動脈硬化、腦血栓等均有輔助功效。金線蓮多糖的藥理作用主要表現(xiàn)在營養(yǎng)、抗衰老、調(diào)節(jié)人體機(jī)體免疫的作用。隨著社會發(fā)展，人們對健康的關(guān)注越來越高，其需求量也會越來越大，但傳統(tǒng)金線蓮多糖的提取方法是用金線蓮屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來市場對金線蓮精深加工的需求。
[0003]隨著植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培養(yǎng)擴(kuò)增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)金線蓮多糖的技術(shù)，在國內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過程中存在很多難題問題，如生物量增速低、目標(biāo)產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長等。關(guān)于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的研究還沒有報道，因此開發(fā)一種高效生產(chǎn)金線蓮多糖類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問題在于提供一種利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中的研究空白。
[0005]懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮單細(xì)胞系群來生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，培養(yǎng)基中添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑來激活細(xì)胞生長并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，同時選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。具體工藝步驟見如下闡述:
(O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用50-80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_節(jié)氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果膠酶50-100mg/L,中性纖維素酶10-50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個/ml即可停止培養(yǎng)，時間為15-18天，采用低速離心或過濾法收集金線蓮細(xì)胞，再常規(guī)方法提取金線蓮多糖。
[0006]本發(fā)明工藝技術(shù)優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明中，首先對金線蓮種子無菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊，保證營養(yǎng)和溶氧供應(yīng)均勻、充分，同時選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實施方式】
[0007]根據(jù)下述實施例，可以更好地理解本發(fā)明。實施例所描述的具體的工藝條件及其結(jié)果僅用于說明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會限制本發(fā)明的權(quán)利要求，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0008]具體實施例1
1、培養(yǎng)階段
(1)單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25土2g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6-節(jié)氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果膠酶50mg/L,中性纖維素酶10mg/L,鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6 + 4 ；
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000個/ml即停止培養(yǎng),時間15天,采用100rpm低速離心收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆?
2、提取階段
1)醇沉
稱取過20目篩的干燥的金線蓮粉末50g加入4倍質(zhì)量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸攪拌提取48小時，再利用45微米微孔濾膜對所得金線蓮浸提液進(jìn)行抽濾，對濾液進(jìn)行8000rpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；
2)去雜
將所述沉淀中加入3倍量蒸餾水溶解，于100°C煮沸10分鐘，冷卻后SOOOrpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；進(jìn)一步對上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮多糖粉。稱量得到的金線蓮多糖的重量為4.22g，收率為8.45%。
[0009] 具體實施例2
1、培養(yǎng)階段
(O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用60微米孔徑的微孔濾器過濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25土2g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到20000個/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)L0mg/L,6-BA(6-Benzylaminopurine,6_節(jié)氨基嘌呤)1.0mg/L,中性果膠酶80mg/L,中性纖維素酶20mg/L,鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6 + 4 ；
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80000個/ml即停止培養(yǎng)，時間18天，采用過濾收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 2、提取階段
1)醇沉
稱取過20目篩的干燥的金線蓮粉末50g加入4倍質(zhì)量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸攪拌提取48小時，再利用45微米微孔濾膜對所得金線蓮浸提液進(jìn)行抽濾，對濾液進(jìn)行8000rpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；
2)去雜
將所述沉淀中加入3倍量蒸餾水溶解，于100°C煮沸10分鐘，冷卻后SOOOrpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；進(jìn)一步對上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮多糖粉。稱量得到的金線蓮多糖的重量為5.06g，收率為10.12%。
[0010]對比例I
選取播種生長8個月的金線蓮組培苗，將組培苗洗凈浙干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 1、醇沉
稱取過20目篩的干燥的金線蓮粉末50g加入4倍質(zhì)量的75% (V/V)乙醇水溶液冷浸攪拌提取48小時，再利用45微米微孔濾膜對所得金線蓮浸提液進(jìn)行抽濾，對濾液進(jìn)行8000rpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；
2、去雜
將所述沉淀中加入3倍量蒸餾水溶解，于100°C煮沸10分鐘，冷卻后SOOOrpm高速離心30分鐘，獲得上清液和沉淀；進(jìn)一步對上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮多糖粉。稱量得到的金線蓮多糖的重量為4.83g，收率為9.66%。
[0011]實驗例I總多糖含量的檢測
1、制作標(biāo)準(zhǔn)曲線:準(zhǔn)確稱取105°C烘干至恒重的葡萄糖50mg于500ml容量瓶中配成0.1 mg/ml 的標(biāo)準(zhǔn)溶液,用蒸懼水分別配成 0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1 mg/ml。I ml 標(biāo)準(zhǔn)液分別加入5%苯酚溶液I ml，并迅速加入濃硫酸5 ml，靜置10 min。搖勻，30°C放置30 min后于490nm測定OD值，以葡萄糖含量為橫坐標(biāo)，OD值為縱坐標(biāo)，制作得到標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為 A=0.0383C + 0.0464，r=0.9993，線性范圍 4.07 ?22.5 μ g / mL ；
2、樣品的測定:精密稱取本實驗制得的金線蓮多糖樣品50mg，適當(dāng)稀釋后，按上述方法操作后進(jìn)行測定。并代入標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品的總多糖含量。
[0012]結(jié)論:
通過上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)法在細(xì)胞培養(yǎng)15-18天后生產(chǎn)的金線蓮多糖在收率上可以接近甚至超過同期播種生長8個月的組培苗生產(chǎn)的金線蓮多糖。
【權(quán)利要求】
1.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，其特征在于，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器對金線蓮細(xì)胞培養(yǎng)，添加植物生長調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑激活細(xì)胞生長并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來生產(chǎn)金線蓮多糖的方法，具體步驟為: (1)單細(xì)胞制備 取金線蓮蒴果消毒后進(jìn)行無菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞,并離心過濾除雜,收集單細(xì)胞； (2)單細(xì)胞系培養(yǎng) 將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個/mL，即可放大培養(yǎng)； (3)細(xì)胞群放大培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基中加入:NAA 0.l-2mg/L,6-BA 0.l_2mg/L，果膠酶 50_100mg/L，纖維素酶 10_50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在.5.6 + 4 ； (4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個/ml即可停止培養(yǎng)，時間為15-18天，采用低速離心或過濾法收集金線蓮細(xì)胞，再用常規(guī)方法提取金線蓮多糖。
【文檔編號】C12P19/04GK104404100SQ201410536999
【公開日】2015年3月11日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】鄧輝, 陳乃富, 劉文中, 陳存武, 韓邦興 申請人:皖西學(xué)院