一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株及其構(gòu)建方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株，其保藏編號(hào)為CGMCCNO.9451，拉丁學(xué)名為Beauveriabassiana，該真菌重組菌株為球孢白僵菌。本發(fā)明還提供一種上述真菌重組菌株的構(gòu)建方法，該方法利用昆蟲病原真菌球孢白僵菌為研究材料，利用基因敲除技術(shù)破壞真菌Gelsolin基因。從而，獲得了草酸高產(chǎn)菌株。本發(fā)明所采用的重組菌株構(gòu)建思路及其重組菌株為提高草酸生產(chǎn)提供更為高效和環(huán)境友好的技術(shù)方法。
CGMCC No.9451
2014.07.04
【專利說明】一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株及其構(gòu)建方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】的DNA重組技術(shù)和應(yīng)用，具體涉及一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株及其構(gòu)建方法。

【背景技術(shù)】
[0002]草酸，又名乙二酸，最簡單的有機(jī)二元酸之一。草酸是合成化學(xué)品的中間體的必要試劑，主要用于制備各種染料、萃取劑以及中間體等精細(xì)化工產(chǎn)品。此外，草酸也是提煉稀有金屬的溶劑、染料還原劑及用于生產(chǎn)抗菌素和冰片等藥物的原料，市場需求廣泛。
[0003]從草酸需求量分析,33%用于制藥行業(yè)；25%用于稀土行業(yè)；35%用于金屬加工及鋁品工業(yè)；其余7%用于草酸酯和染料中間體等行業(yè)。隨著草酸應(yīng)用領(lǐng)域的擴(kuò)展，特別是隨著農(nóng)藥及醫(yī)藥中間體用草酸酯數(shù)量的增加，以及用乙醛酸生產(chǎn)香蘭素新工藝的發(fā)展，草酸的需求量將持續(xù)穩(wěn)定地增長。草酸在國內(nèi)市場的最大用戶是制藥行業(yè)，主要用于四環(huán)素、金霉素和土霉素等藥品的生產(chǎn)。近年來，我國制藥行業(yè)發(fā)展很快，發(fā)展速度高于全球平均水平。2010年我國原料藥產(chǎn)量達(dá)到221.50萬t，同比增長13.98%。預(yù)計(jì)制藥行業(yè)對(duì)草酸的需求量將以每年15-20%的速度遞增，2010年制藥行業(yè)對(duì)草酸的需求量為8.1萬噸，預(yù)計(jì)2015年將達(dá)到16.6萬噸，帶來的草酸市場規(guī)模約為9.6億元。
[0004]因而，研究開發(fā)草酸新型、高效和環(huán)保的草酸生產(chǎn)工藝是非常必要的。目前，草酸的工業(yè)生產(chǎn)方法有:甲酸鈉法、碳水化合物氧化法、乙二醇氧化法、丙烯氧化法和一氧化碳偶聯(lián)法等。這些以化學(xué)反應(yīng)為基礎(chǔ)的生產(chǎn)工藝普遍存在反應(yīng)條件劇烈、消耗大量化學(xué)試劑、污染環(huán)境等缺點(diǎn)。微生物的發(fā)酵工業(yè)反應(yīng)條件溫和、可以利用可再生資源、對(duì)環(huán)境友好，這些特點(diǎn)可以顯著改變化學(xué)的缺點(diǎn)。目前，可通過微生物發(fā)酵工業(yè)技術(shù)生產(chǎn)的有機(jī)酸有檸檬酸、乳酸、醋酸、葡萄糖酸、蘋果酸、曲酸、甲叉丁二酸、一酮戊二酸、丙酸、琥珀酸、抗壞血酸、水楊酸、赤霉酸及多種長鏈二元酸等等，卻未見用微生物發(fā)酵生產(chǎn)草酸的報(bào)道。草酸化學(xué)名為乙二酸，在化學(xué)結(jié)構(gòu)上有別于上述的有機(jī)酸，具有自身特征的化學(xué)性質(zhì)。如:能夠產(chǎn)生檸檬酸的微生物很多，在工業(yè)生產(chǎn)上有價(jià)值的只有幾種曲霉和酵母，在現(xiàn)代檸檬酸工業(yè)上使用最多的菌種是黑曲霉。然而常見的微生物菌體內(nèi)的微量草酸是代謝途徑的中間產(chǎn)物，不能或只能分泌微量的草酸至培養(yǎng)基中，這使得利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)草酸缺乏合適的菌株。
[0005]絲孢類昆蟲病原真菌球孢白僵菌(Beauveria bassiana),在自然條件下,可以通過體壁接觸感染而致死各類害蟲。在感染此過程中，該類真菌必須分泌草酸以增強(qiáng)感染力，因而該菌種在生物進(jìn)化過程中形成了獨(dú)特的能夠分泌草酸的特性。這種生物學(xué)特性也為微生物發(fā)酵生產(chǎn)草酸提供了潛在的菌株資源，并有望通過遺傳改造提高草酸的產(chǎn)量。本研究通過遺傳改造技術(shù)修飾菌株的某些代謝途徑，從而改善菌株產(chǎn)酸的能力。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于，提供一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株。
[0007]所述真囷重組囷株是利用基因敲除技術(shù)破壞真囷Gelsolin基因犾得的，于2014年7月4日在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CCGMCC)保藏，其保藏編號(hào)為 CGMCC N0.9451,拉丁學(xué)名為 Beauveria bassiana。
[0008]所述真菌重組菌株是球孢白僵菌。
[0009]本發(fā)明的另一個(gè)目的是，提供一種上述真菌重組菌株的構(gòu)建方法，該方法依次通過以下步驟實(shí)現(xiàn):
(1)獲得基因BbGELl:
在球孢白僵菌全基因組中，利用已知的Gelsolin基因進(jìn)行比對(duì)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，編號(hào)為 BBA_00681(GenBank Access1n No:EJP71051)的基因具有三個(gè)重復(fù)的 Gelsolin 結(jié)構(gòu)域，將這三個(gè)重復(fù)的Gelsolin結(jié)構(gòu)域命名為BbGELl基因。
[0010]BbGELl基因的序列如序列表中SEQ N0.1所示。
[0011 ] (2)構(gòu)建基因BbGELl敲除組件:
以球孢白僵菌基因組為模板，通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增獲得基因BbGELl的上游和下游片段。然后通過PCR融合技術(shù)，將上下游片段分別融合在球孢白僵菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因Bar表達(dá)元件(Xie et al.2012，主要參考文獻(xiàn)2)的上游和下游，構(gòu)建基因敲除組件(gene replacement construct)。
[0012]基因BbGELl的上游序列為序列表中的SEQ N0.2，基因BbGELl的下游序列為序列表中的SEQ N0.3。
[0013]在PCR擴(kuò)增反應(yīng)中，擴(kuò)增上游的引物為:
GelUF:5，-AAGCCAATCGAAAGATCCGT-3，，
GelUR:5’ -CTTATGTGGGAAACAATGCT-3’，
擴(kuò)增下游的引物為:
GelUF:5’ - GATAGCTTCCAGGTTGTTCC-3’，
GelUR:5’ - GCCACCGCCAACAGACATAC-3’。
[0014]所述基因BbGELl敲除組件的序列為序列表中的SEQ N0.8。
[0015](3)基因敲除菌株的獲得:
利用芽生孢子轉(zhuǎn)化體系(Ying and Feng 2006，主要參考文獻(xiàn)1)將基因敲除組件轉(zhuǎn)入球孢白僵菌，轉(zhuǎn)化子經(jīng)PCR篩選，獲得基因BbGELl被敲除的球孢白僵菌菌株。在步驟(3)中也可利用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電擊轉(zhuǎn)化等遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)將基因敲除組件轉(zhuǎn)入真菌，獲得真菌重組菌株。
[0016]本發(fā)明還提供上述基因重組菌株在制備草酸中的應(yīng)用。
[0017]利用本發(fā)明構(gòu)建的真菌重組菌株發(fā)酵產(chǎn)生草酸的方法，具體步驟如下:
首先將菌株接種在薩氏培養(yǎng)平板上(4%葡萄糖、1%蛋白胨、1%酵母粉和1.5%瓊脂)，在25°C培養(yǎng)10天直至產(chǎn)生分生孢子。
[0018]然后，將孢子粉接種中發(fā)酵培養(yǎng)基中，孢子的終濃度為106孢子/ml，25°C培養(yǎng)3天。
[0019]發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為(g/Ι):蔗糖30，氮源 2.5，K2HP04 1，KC1 0.5，MgS04 0.5，F(xiàn)eS04 0.01，以純凈水配制。
[0020]所用氮源為蛋白胨、硝酸銨以一定比例混合而成；發(fā)酵時(shí)間結(jié)束后草酸產(chǎn)量達(dá)6g/L。
[0021]本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明基于球孢白僵菌產(chǎn)生草酸的天然特性，通過遺傳重組改造真菌的生理代謝途徑，利用基因敲除技術(shù)對(duì)真菌進(jìn)行改造，獲得了一種真菌重組菌株，經(jīng)過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該重組真菌菌株在制備草酸方面具有顯著的進(jìn)步性，能極大提高草酸的制備產(chǎn)量。通過微生物發(fā)酵法制備草酸，解決了草酸的工業(yè)生產(chǎn)方法所存在的問題，擴(kuò)大了微生物發(fā)酵方法在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用。
[0022]主要參考文獻(xiàn):
1.Ying SH, Feng MG.(2006) Novel blastospore-based transformat1n systemfor integrat1n of phosphinothricin resistance and green fluorescence proteingenes into Beauveria bassiana.Applied Microb1logy and B1technology, 72:206-210.2.Xie XQj Li F，Ying SHj Feng MG (2012) Additive contribut1ns of twomanganese-cored superoxide dismutases (MnSODs) to ant1xidat1n, UV toleranceand virulence of Beauveria bassiana.PLoS ONE 7:e30298o

【專利附圖】

【附圖說明】
[0023]圖1為本發(fā)明的實(shí)施例中菌株培養(yǎng)液中草酸含量測(cè)定比較圖，其中A為1ppm各有機(jī)酸的混合標(biāo)樣，B為野生菌株培養(yǎng)液稀釋10倍測(cè)定結(jié)果，C為BbGELl敲除菌株培養(yǎng)液稀釋20倍測(cè)定結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0024]下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)對(duì)利用本發(fā)明作進(jìn)一步的說明。
[0025]實(shí)施例1:BbGELl基因序列分析及克隆。
[0026]參照球孢白僵菌2860 (來自美國農(nóng)業(yè)部ARSEF生防真菌菌種庫)基因組中BbGELl。
[0027]BbGELl基因序列為: ATGCCTCCTCATGAAGGTCTCGTACACCTCAAGGAATACGACATCAAAGACAGCAATATCGAGCTGATTGGA
ACCGATATTGACCATCAGGTCAAATACAAGTCGGCAGCCGAGGAGCCCGCTTGGCACGTTGTCGGAAAGAGGCCAGG
CCTGCTAATTTGGCGTATCGATAGCTTCCAGGTTGTTCCATGGCCTGAAGAGAAACATGGCCAATTCTACGATGGCG
ACAGCTTCATCGTCCTCCACTCCTTTAAAGTTGGCAGCAAGGATGGCTCCGAGAAGCTAGCCCACGCAATCTACTTT
TGGCTCGGCAGCCACACGTCGCAGGACGAGGCTGGTACCGCCGCTTACAAAACTGTCGAGCTAGATGAGTTCCTTCA
CGGCGCCGCATCGCAACACCGAGAGGTGCAATCAGCCCCTTCTGATGAATTTCTCGCCTTGTTCCCCAAGATTTCCA
TTCGCTCCGGCGGTGTCCGATCCGGATTTAGACACGTCGAGGAGGCGCGCAAGGAGGATGTCACCACTCTCCTGCGC
GTCTTCACCAACCCCGGGTCCAAAGCCTCCAACGGCGTGGTTGTCCACGAGGTTGAACCCACCTACCACAGCCTCGA
CGACGGTGACGTTTTCATCCTTGATAAAGGCGACAAGATCTGGGTCTGGCAGGGCAAGAGCTGCAGTCCCATGGAAA
AGGCCAAGGCTGCCCAAATCGTGCACGACATGACTCTCGCAAAGCACATTGATGTCGAGGTTGTTGCCCAGACCGAG
TCGCGCTCGCGTCGTGTGATTGATCTTCTCGGCGGCGATGCTTCGACGCAATTCGATGGCTTTAAGCAGGGCCGCCC
AATTACTTCCGGCAACAAAGCTTCCATTGCTTCCGGCCGCTCGAAGAAGCTATTCAGACTTAGTGATGCCTCTGGAC
AACTTTCATTCAGCCTTGTCAAAAATGGAAATGTCACTGCCAATGATCTAGATGGCAATGACGTCTTCCTCTTGGAC
AGCGGAGAGGCCGTCTGGGTGTGGGAGGGTCAAGGTGCAAGCCGTGCTGAGAGGGCCCAGTGGTTGCGAGTTGCCCAGGCATACATTTGCCAACTGGCTCAGCATTCTACAGATAGCCATCTTATTCCTCTAGCCAAGGTCAACCAAGGCAACGAAACAATAGCTTTTCAGCAAGCCATTGCTGCGTAA實(shí)施例2:構(gòu)建基因BbGELl敲除菌株。
[0028]以基因融合技術(shù)構(gòu)建基因敲除組件。
[0029]以實(shí)施例1中的球孢白僵菌基因組為模板，設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物，通過PCR反應(yīng)分別擴(kuò)增獲得基因敲除組件的上游和下游片段。PCR反應(yīng)體系:2 yL真菌cDNA、l μ?引物、2 μ?dNTP、5 μ? MgC12、5 μ? LA Taq聚合酶緩沖液和0.5 μ? LA Taq聚合酶。PCR循環(huán)條件:94°C預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)(94°C變性30 s，60°C退火30 s和72°C延伸2 min)，循環(huán)結(jié)束后再在72°C延伸7 min。
[0030]然后通過PCR融合技術(shù)，將上下游片段分別融合在球孢白僵菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因Bar表達(dá)元件的上游和下游，構(gòu)建基因敲除組件(gene replacement construct),基因敲除組件是將基因BbGELl上下游片段與抗性篩選基因融合而成的片段，基因敲除組件結(jié)構(gòu)為:BbGELl上游一Bar元件一BbGELl下游。
[0031]利用芽生孢子轉(zhuǎn)化體系將基因敲除組件轉(zhuǎn)入球孢白僵菌，基因敲除組件進(jìn)入菌體后經(jīng)同源重組可以將BbGELl的部分序列替換，破壞該基因的功能。利用篩選平板對(duì)轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR篩選，篩選平板選用含有200 ug/ml的察氏培養(yǎng)基。獲得基因BbGELl被敲除的真菌重組菌株。
[0032]BbGELl基因上游序列為: AAGCCAATCGAAAGATCCGTCCGCGAAACATCTGAGCGATACGTCCGCGAGTTTCAAGTACCTGAAATAATG
AGCTTTGCCCAAGTTGAGCAAGCCAGAGCAAGGCTCACGTCCGCCCTCACATCACTTTATTTACTATCGCCCACACT
AGGTTCAAAGGCCGAGAAATGGACTCCGCGACTGCTGGTTCAAGCCCTCGATACGTACATAAGATCGTCTTTGCAGA
CAAGTATTACTACGTTAGCGCGCTCTCTGGGCCAGCTTTCCAGCCTCGACAAAGCTCTTGGAGAAGTCACAACCAAG
TGCCAAACTATTGTGGCCTTGGAGCTTATACTAGATGGAATTAGGCCACCAGCTCATCCCTTGCTCGCCGTATCACC
CGGTTCTCATATGCCAAATCTCCTCCAACCTCTGTTGGGCCAGCTGGAAACAGGCTCGCTGGCATCATACTTTTGGC
GGACTATGGCGGGTAGCCTGTCTACACGTGTGCAAGACATTGTCGCCCGTGGGGGTGTTGTTGCTAGGACACTCAAG
GCCAACAAGAACAACGTCGGCGATGCAATAAGACAATCTGTGGGTAGAGGTTCTCGACTTCCTTCATCGTTCGTCGG
ACCTAAAACAAAGGCCAAATCGGACATTAGTTGGGATAGAGAAATCGCTGTGATGGTTGGTAGTGTAGTCAACAACC
TTGGCAGGTGATTTACGAGCAATCAATCAAAGCTTAAATGCACTGCTCAAATTCTTTCTAACGACACAGTCTATGCA
ATGCACAATCACTAGGTAGTTGCTTCTTGCTTAGACACCCCGACATGCATGGTGGGGCATTCAGCAGGTGCCGCCTG
ACATATAAACAACGTCCTCGTTGTTAAGGTCCTATAATTATATTTAAATTCCCGGGTGCCTTTCTTAAGGACTTAAA
TTACTCTTTAGCTTATTACTCTCTGGCTTAAATTGATCTATGGCTCTTCTAGCCTATAATGTGTGCTCTGGCTGGTG
CTCTTTAGCTGGTGCTCGTGGGCTGGTGCTCTTTAGCTGGTGCCTGTAGGCTGGTGATCTTGATGATGGTGCTCTTT
GGCTGATGATCTTGATGGTCCTGGTGGAAGAGGCCCTGGTGCGTTAAGCTAGTAGACTTGGTGCTCTGTGGCTAGTT
GCTGACGGGCTAGTGCCTTCTGGCTGGTGTCTTGGTGACTAGTGTCTGTCAGACTTGATAAAATGATGATGATTAAT
GATAAAAATGGCCTAGATAGACTGGTGTTACTACCACTTTGTCAGGGAAGAGGGAGGAGGTAATGATGTTGTATTCT
CTGGGTTCTGTGGGGGCCTCCACAGGGCCCAACATGCTTGCTCCTTTAACACTGCCATAGGGATAGGCTGCCATAGC
CAACCACGTCAACACCCCGCACTACATAGGTAGGTAGGTAGCGACAGACAACCCCTCCAACAGCTACCTACCTACCT
ACTTATCCAAAAAAGCATTGTTTCCCACATAAGTAACCTTATAAGCATTGTCATTTATACATTTCTTCCGGAATTCA
TTCTTCGTACACAAGCC BbGELl基因下游序列為:
ATCGATTTGTTTAGGTTTCATTCGTGTTCACAGCATACATAGATGCAGTCAGGATCTGGTTCCACAGAAATC
GCATTGAATGAACTAATACAATCCTCAAACTATCCCGTTTCGATTTTAACGGGACTAGCATGTGTTATTGTATTCAG
GGTTCGGGAGAAGCCTTATCGCTGCCCTTGGGTACATCAACTATAGCTGTTCTTGTCCATATGTGCTTTGCACCCGT
AACATTGAGTCCCTCCACTGCACCACCTTTGATTGAGACTGTGGGTTTCAGGGAGCCATCCGGCAGGGCGATAACGT
GCGCGATTCGTGCGCCGCAAGTATCACAAAAATAGCATCGCATGGTTCCTCCAGTTTGAGACGGTCGCGGCCACATT
TTGAGCCTAGCTAGTATGTCTGTTGGCGGTGGC
擴(kuò)增上游的引物:GelUF:5’ -AAGCCAATCGAAAGATCCGT-3’
GelUR:5’ -CTTATGTGGGAAACAATGCT-3’
擴(kuò)增下游的引物:GelUF:5’ - GATAGCTTCCAGGTTGTTCC-3’
GelUR:5’ - GCCACCGCCAACAGACATAC-3’
Bar表達(dá)元件基因序列為(序列表中SEQ N0.9):
GAATTCGTCGACGTTAACTGATATTGAAGGAGCATTTTTTGGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCTCGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCCCCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGACTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGGGCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATCTGA基因敲除組件的序列:
AAGCCAATCGAAAGATCCGTCCGCGAAACATCTGAGCGATACGTCCGCGAGTTTCAAGTACCTGAAATAATG
AGCTTTGCCCAAGTTGAGCAAGCCAGAGCAAGGCTCACGTCCGCCCTCACATCACTTTATTTACTATCGCCCACACT
AGGTTCAAAGGCCGAGAAATGGACTCCGCGACTGCTGGTTCAAGCCCTCGATACGTACATAAGATCGTCTTTGCAGA
CAAGTATTACTACGTTAGCGCGCTCTCTGGGCCAGCTTTCCAGCCTCGACAAAGCTCTTGGAGAAGTCACAACCAAG
TGCCAAACTATTGTGGCCTTGGAGCTTATACTAGATGGAATTAGGCCACCAGCTCATCCCTTGCTCGCCGTATCACC
CGGTTCTCATATGCCAAATCTCCTCCAACCTCTGTTGGGCCAGCTGGAAACAGGCTCGCTGGCATCATACTTTTGGC
GGACTATGGCGGGTAGCCTGTCTACACGTGTGCAAGACATTGTCGCCCGTGGGGGTGTTGTTGCTAGGACACTCAAG
GCCAACAAGAACAACGTCGGCGATGCAATAAGACAATCTGTGGGTAGAGGTTCTCGACTTCCTTCATCGTTCGTCGG
ACCTAAAACAAAGGCCAAATCGGACATTAGTTGGGATAGAGAAATCGCTGTGATGGTTGGTAGTGTAGTCAACAACC
TTGGCAGGTGATTTACGAGCAATCAATCAAAGCTTAAATGCACTGCTCAAATTCTTTCTAACGACACAGTCTATGCA
ATGCACAATCACTAGGTAGTTGCTTCTTGCTTAGACACCCCGACATGCATGGTGGGGCATTCAGCAGGTGCCGCCTG
ACATATAAACAACGTCCTCGTTGTTAAGGTCCTATAATTATATTTAAATTCCCGGGTGCCTTTCTTAAGGACTTAAA
TTACTCTTTAGCTTATTACTCTCTGGCTTAAATTGATCTATGGCTCTTCTAGCCTATAATGTGTGCTCTGGCTGGTGCTCTTTAGCTGGTGCTCGTGGGCTGGTGCTCTTTAGCTGGTGCCTGTAGGCTGGTGATCTTGATGATGGTGCTCTTTGGCTGATGATCTTGATGGTCCTGGTGGAAGAGGCCCTGGTGCGTTAAGCTAGTAGACTTGGTGCTCTGTGGCTAGTTGCTGACGGGCTAGTGCCTTCTGGCTGGTGTCTTGGTGACTAGTGTCTGTCAGACTTGATAAAATGATGATGATTAATGATAAAAATGGCCTAGATAGACTGGTGTTACTACCACTTTGTCAGGGAAGAGGGAGGAGGTAATGATGTTGTATTCTCTGGGTTCTGTGGGGGCCTCCACAGGGCCCAACATGCTTGCTCCTTTAACACTGCCATAGGGATAGGCTGCCATAGCCAACCACGTCAACACCCCGCACTACATAGGTAGGTAGGTAGCGACAGACAACCCCTCCAACAGCTACCTACCTACCTACTTATCCAAAAAAGCATTGTTTCCCACATAAGGAATTCGTCGACGTTAACTGATATTGAAGGAGCATTTTTTGGGCTTGGCTGGAGCTAGTGGAGGTCAACAATGAATGCCTATTTTGGTTTAGTCGTCCAGGCGGTGAGCACAAAATTTGTGTCGTTTGACAAGATGGTTCATTTAGGCAACTGGTCAGATCAGCCCCACTTGTAGCAGTAGCGGCGGCGCTCGAAGTGTGACTCTTATTAGCAGACAGGAACGAGGACATTATTATCATCTGCTGCTTGGTGCACGATAACTTGGTGCGTTTGTCAAGCAAGGTAAGTGGACGACCCGGTCATACCTTCTTAAGTTCGCCCTTCCTCCCTTTATTTCAGATTCAATCTGACTTACCTATTCTACCCAAGCATCCAAATGAGCCCAGAACGACGCCCGGCCGACATCCGCCGTGCCACCGAGGCGGACATGCCGGCGGTCTGCACCATCGTCAACCACTACATCGAGACAAGCACGGTCAACTTCCGTACCGAGCCGCAGGAACCGCAGGAGTGGACGGACGACCTCGTCCGTCTGCGGGAGCGCTATCCCTGGCTCGTCGCCGAGGTGGACGGCGAGGTCGCCGGCATCGCCTACGCGGGCCCCTGGAAGGCACGCAACGCCTACGACTGGACGGCCGAGTCGACCGTGTACGTCTCCCCCCGCCACCAGCGGACGGGACTGGGCTCCACGCTCTACACCCACCTGCTGAAGTCCCTGGAGGCACAGGGCTTCAAGAGCGTGGTCGCTGTCATCGGGCTGCCCAACGACCCGAGCGTGCGCATGCACGAGGCGCTCGGATATGCCCCCCGCGGCATGCTGCGGGCGGCCGGCTTCAAGCACGGGAACTGGCATGACGTGGGTTTCTGGCAGCTGGACTTCAGCCTGCCGGTACCGCCCCGTCCGGTCCTGCCCGTCACCGAGATCTGATACCGCCGCTTACAAAACTGTCGAGCTAGATGAGTTCCTTCACGGCGCCGCATCGCAACACCGAGAGGTGCAATCAGCCCCTTCTGATGAATTTCTCGCCTTGTTCCCCAAGATTTCCATTCGCTCCGGCGGTGTCCGATCCGGATTTAGACACGTCGAGGAGGCGCGCAAGGAGGATGTCACCACTCTCCTGCGCGTCTTCACCAACCCCGGGTCCAAAGCCTCCAACGGCGTGGTTGTCCACGAGGTTGAACCCACCTACCACAGCCTCGACGACGGTGACGTTTTCATCCTTGATAAAGGCGACAAGATCTGGGTCTGGCAGGGCAAGAGCTGCAGTCCCATGGAAAAGGCCAAGGCTGCCCAAATCGTGCACGACATGACTCTCGCAAAGCACATTGATGTCGAGGTTGTTGCCCAGACCGAGTCGCGCTCGCGTCGTGTGATTGATCTTCTCGGCGGCGATGCTTCGACGCAATTCGATGGCTTTAAGCAGGGCCGCCCAATTACTTCCGGCAACAAAGCTTCCATTGCTTCCGGCCGCTCGAAGAAGCTATTCAGACTTAGTGATGCCTCTGGACAACTTTCATTCAGCCTTGTCAAAAATGGAAATGTCACTGCCAATGATCTAGATGGCAATGACGTCTTCCTCTTGGACAGCGGAGAGGCCGTCTGGGTGTGGGAGGGTCAAGGTGCAAGCCGTGCTGAGAGGGCCCAGTGGTTGCGAGTTGCCCAGGCATACATTTGCCAACTGGCTCAGCATTCTACAGATAGCCATCTTATTCCTCTAGCCAAGGTCAACCAAGGCAACGAAACAATAGCTTTTCAGCAAGCCATTGCTGCGTAAATCGATTTGTTTAGGTTTCATTCGTGTTCACAGCATACATAGATGCAGTCAGGATCTGGTTCCACAGAAATCGCATTGAATGAACTAATACAATCCTCAAACTATCCCGTTTCGATTTTAACGGGACTAGCATGTGTTATTGTATTCAGGGTTCGGGAGAAGCCTTATCGCTGCCCTTGGGTACATCAACTATAGCTGTTCTTGTCCATATGTGCTTTGCACCCGTAACATTGAGTCCCTCCACTGCACCACCTTTGATTGAGACTGTGGGTTTCAGGGAGCCATCCGGCAGGGCGATAACGTGCGCGATTCGTGCGCCGCAAGTATCACAAAAATAGCATCGCATGGTTCCTCCAGTTTGAGACGGTCGCGGCCACATTTTGAGCCTAGCTAGTATGTCTGTTGGCGGTGGC實(shí)施例3:高產(chǎn)菌株發(fā)酵產(chǎn)酸。
[0033] 分別將原始菌株和實(shí)施例2獲得的真菌重組菌株的分生孢子接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，25°C培養(yǎng)3天。培養(yǎng)液經(jīng)過濾、離心多次之后，獲得澄清的溶液。野生菌株培養(yǎng)液稀釋10倍，突變菌株培養(yǎng)液稀釋20倍后，經(jīng)利用離子色譜法測(cè)定草酸含量。
[0034]離子色譜法測(cè)定條件:將離子色譜儀器(ICS 2000)開啟，打開氣路氣源開關(guān)，調(diào)節(jié)減壓表到0.1-0.2 psi ;調(diào)節(jié)淋洗液組織器后面的減壓閥到6-9 psi之間。打開平衡泵頭上的PRME閥排氣，流速為3 mL/min,5 min。淋洗液為30 mM氫氧化鉀。測(cè)量保留時(shí)間為30分鐘。
[0035]離子色譜測(cè)定結(jié)果顯示，出發(fā)的野生菌株和突變菌株的草酸產(chǎn)量分別為0.5g/L和6.0g/L，分析的圖譜如圖1所示。
【權(quán)利要求】
1.一種高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株，其特征在于:所述真菌重組菌株是利用基因敲除技術(shù)破壞真菌Ge I so I in基因獲得的，其保藏編號(hào)為CGMCC N0.9451，拉丁學(xué)名為Beauveriabassiana0
2.如權(quán)利要求1所述的高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株是球孢白僵菌。
3.權(quán)利要求1所述高產(chǎn)草酸的真菌重組菌株的構(gòu)建方法，包括下列步驟: (1)獲得基因BbGELl: 在球孢白僵菌全基因組中，選取編號(hào)為BBA_00681的基因中三個(gè)重復(fù)的Ge I so I in結(jié)構(gòu)域，并命名為BbGELl基因。 (2)構(gòu)建基因BbGELl敲除組件: 通過PCR擴(kuò)增反應(yīng)分別獲得基因BbGELl的上游和下游序列，將基因BbGELl的上游和下游序列分別連接于生防真菌篩選標(biāo)記草丁膦抗性基因Bar表達(dá)元件的上游和下游，構(gòu)建基因BbGELl敲除載體。 (3)基因敲除菌株的獲得: 利用遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，將基因BbGELl敲除載體轉(zhuǎn)入真菌球孢白僵菌，篩選獲得基因敲除菌株，即獲得所述真菌重組菌株。
4.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于:基因BbGELl的序列為序列表中的SEON0.1。
5.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于:基因BbGELl的上游序列為序列表中的SEQ N0.2，基因BbGELl的下游序列為序列表中的SEQ N0.3。
6.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述步驟(2)中的擴(kuò)增引物為: 擴(kuò)增上游的引物:GelUF:5’ -AAGCCAATCGAAAGATCCGT-3’，
GelUR:5’ -CTTATGTGGGAAACAATGCT-3’， 擴(kuò)增下游的引物:GelUF:5’ -GATAGCTTCCAGGTTGTTCC-3’，
GelUR:5，-GCCACCGCCAACAGACATAC-3，。
7.如權(quán)利要求3所述的構(gòu)建方法，其特征在于:所述基因BbGELl敲除組件的序列為序列表中的SEQ N0.8。
8.權(quán)利要求1所述的真菌重組菌株在制備草酸中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12P7/46GK104293685SQ201410537001
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】應(yīng)盛華, 何普紅, 馮明光 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)