懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法
【專利摘要】懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞來(lái)生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法。本方法首先對(duì)金線蓮種子無(wú)菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中未分化的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊生長(zhǎng)，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高金線蓮黃酮產(chǎn)品收率，且工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。
【專利說(shuō)明】 懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及黃酮類化合物生產(chǎn)技術(shù)，尤其涉及金線蓮黃酮的生產(chǎn)技術(shù)，具體為一種采用細(xì)胞培養(yǎng)法生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]金線蓮黃酮類化合物是金線蓮的主要成分之一，金線蓮對(duì)支氣管炎、腎炎、膀胱炎、糖尿病、血尿、風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、急慢性肝病、高血壓、動(dòng)脈硬化、腦血栓等均有輔助功效。金線蓮黃酮的藥理作用主要表現(xiàn)在營(yíng)養(yǎng)、雙向調(diào)節(jié)血糖、血壓，降低血脂、調(diào)節(jié)人體機(jī)體免疫的作用。隨著社會(huì)發(fā)展，人們對(duì)健康的關(guān)注越來(lái)越高，其需求量也會(huì)越來(lái)越大，但傳統(tǒng)金線蓮黃酮的提取方法是用金線蓮屬植物的根、莖、葉等植物體提取所得，這種工藝所得的產(chǎn)品已經(jīng)不能滿足未來(lái)市場(chǎng)對(duì)金線蓮精深加工的需求。
[0003]隨著植物細(xì)胞工程技術(shù)的發(fā)展，用細(xì)胞進(jìn)行人工培養(yǎng)擴(kuò)增提取植物的代謝產(chǎn)物，可以不受土地面積、氣候環(huán)境、地域、病蟲(chóng)害等限制影響，適于工業(yè)化生產(chǎn)。利用細(xì)胞工程技術(shù)生產(chǎn)金線蓮黃酮的技術(shù)，在國(guó)內(nèi)外早有研究，也取得了諸多成果，但在生產(chǎn)過(guò)程中存在很多難題問(wèn)題，如生物量增速低、目標(biāo)產(chǎn)物收率低、生產(chǎn)周期長(zhǎng)等。關(guān)于利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)金線蓮細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的研究還沒(méi)有報(bào)道，因此開(kāi)發(fā)一種高效生產(chǎn)金線蓮黃酮類天然產(chǎn)物的方法是十分有意義的。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題在于提供一種利用氣升攪拌罐懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，以解決上述【背景技術(shù)】中的研究空白。
[0005]本發(fā)明所解決的技術(shù)問(wèn)題采用以下技術(shù)方案來(lái)實(shí)現(xiàn)，懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器培養(yǎng)金線蓮單細(xì)胞系群來(lái)生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，培養(yǎng)基中添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑來(lái)激活細(xì)胞生長(zhǎng)并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。具體步驟見(jiàn)如下闡述:
(O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用50-80微米孔徑的微孔濾器過(guò)濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.l-2mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine, 6_節(jié)氛基嘿呤)0.l_2mg/L,中性果膠酶50-100mg/L,中性纖維素酶10-50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持PH在5.6±4;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個(gè)/ml即可停止培養(yǎng)，時(shí)間為15-18天，采用低速離心或過(guò)濾法收集金線蓮細(xì)胞，再常規(guī)方法提取金線蓮黃酮。
[0006]本發(fā)明工藝技術(shù)優(yōu)點(diǎn):
本發(fā)明中，首先對(duì)金線蓮種子無(wú)菌播種萌發(fā)形成的原球莖，利用酶解法分離出高活力原球莖中的單細(xì)胞，進(jìn)一步培養(yǎng)成單細(xì)胞系，最后進(jìn)行細(xì)胞群放大培養(yǎng)，在放大培養(yǎng)中，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑到培養(yǎng)基中，能激活細(xì)胞分裂生長(zhǎng)，并防止細(xì)胞聚集結(jié)塊，保證營(yíng)養(yǎng)和溶氧供應(yīng)均勻、充分，同時(shí)選擇適合的光照強(qiáng)度和色溫調(diào)控目的產(chǎn)物表達(dá)。本發(fā)明能夠大幅度縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，提高產(chǎn)品收率，且工藝簡(jiǎn)單、穩(wěn)定，適合工業(yè)化生產(chǎn)。

【具體實(shí)施方式】
[0007]根據(jù)下述實(shí)施例，可以更好地理解本發(fā)明。實(shí)施例所描述的具體的工藝條件及其結(jié)果僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)當(dāng)也不會(huì)限制本發(fā)明的權(quán)利要求，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下，本發(fā)明還會(huì)有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明范圍內(nèi)。
[0008]具體實(shí)施例1
1、培養(yǎng)階段
(1)單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用80微米孔徑的微孔濾器過(guò)濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)0.5mg/L,6_BA(6-Benzylaminopurine,6-節(jié)氨基嘌呤)0.5mg/L,中性果膠酶50mg/L,中性纖維素酶10mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30g/L，光強(qiáng)度為30001ux，色溫為5000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000個(gè)/ml即停止培養(yǎng),時(shí)間15天,采用100rpm低速離心收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆? 2、提取階段
稱取過(guò)20目篩的干燥的金線蓮粉末50.0g，置于連續(xù)回流提取器中，加入80%乙醇3L回流提取I h。取燒瓶中的提取溶液，加入適量活性碳脫色I(xiàn) h，利用45微米微孔濾膜過(guò)濾除去葉綠素，進(jìn)一步對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮黃酮粗粉。按照總黃酮的測(cè)定方法得到的金線蓮黃酮粉中總黃酮的含量為0.27g，收率為0.54%。
[0009]具體實(shí)施例2
1、培養(yǎng)階段 (O單細(xì)胞制備
取金線蓮蒴果，按照組培技術(shù)要求消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞，用60微米孔徑的微孔濾器過(guò)濾，濾液經(jīng)低速離心機(jī)分離，收集沉淀下的細(xì)胞；
(2)單細(xì)胞系培養(yǎng)
將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為40g/L，光強(qiáng)度為20001ux，色溫為6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)；
(3)細(xì)胞群放大培養(yǎng)
將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵耀中，培養(yǎng)基中加入:NAA (1-Naphthaleneacetic acid,蔡乙酸)L0mg/L,6-BA(6-Benzylaminopurine,6_節(jié)氨基嘌呤)1.0mg/L,中性果膠酶80mg/L,中性纖維素酶20mg/L，鮮細(xì)胞接種量為40g/L，光強(qiáng)度為40001ux，色溫為6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在5.6±4 ;
(4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到70000個(gè)/ml即停止培養(yǎng)，時(shí)間18天，采用過(guò)濾法收集金線蓮細(xì)胞，將收集到的金線蓮細(xì)胞殺青后70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 2、提取階段
稱取過(guò)20目篩的干燥的金線蓮粉末50.0g，置于連續(xù)回流提取器中，加入80%乙醇3L回流提取I h。取燒瓶中的提取溶液，加入適量活性碳脫色I(xiàn) h，利用45微米微孔濾膜過(guò)濾除去葉綠素，進(jìn)一步對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮黃酮粗粉。按照總黃酮的測(cè)定方法得到的金線蓮黃酮粉中總黃酮的含量為0.305g，收率為0.61%。
[0010]對(duì)比例I
選取播種生長(zhǎng)8個(gè)月的金線蓮組培苗，將組培苗洗凈浙干后殺青，再70°C干燥至恒重，并磨成粉末，常溫封閉保存?zhèn)溆茫?br> 稱取過(guò)20目篩的干燥的金線蓮粉末50.0g，置于連續(xù)回流提取器中，加入80%乙醇3L回流提取I h。取燒瓶中的提取溶液，加入適量活性碳脫色I(xiàn) h，利用45微米微孔濾膜過(guò)濾除去葉綠素，進(jìn)一步對(duì)上清液進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，再干燥至恒重，獲得可溶性金線蓮黃酮粗粉。按照總黃酮的測(cè)定方法得到的金線蓮黃酮粉中總黃酮的含量為0.291 g，收率為0.58%。
[0011]實(shí)驗(yàn)例I總黃酮含量的測(cè)定
1、對(duì)實(shí)施例提取的總黃酮含量進(jìn)行分析，具體分析方法如下。標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制。準(zhǔn)確吸取0.2 mg /ml蘆丁溶液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0、2.4 ml，分別置于比色皿中，用蒸餾水代替蘆丁溶液為零管，各加水至2.4 ml，分別加人5%似從)2溶液0.4 ml，搖勻，靜置6 min;加入10% Al( N03) 3溶液0.4ml，搖勻，靜置6 min;加入4% NaOH溶液4 ml，搖勻，靜置15min;在510 nm處測(cè)定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)和蘆丁含量為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。由吸光度X對(duì)濃度Y (mg/ml)進(jìn)行回歸計(jì)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:Y=0.9324Χ+0.004 R2=0.9993 ；樣品的測(cè)定:精密稱取本實(shí)驗(yàn)制得的金線蓮黃酮粉樣品50mg適當(dāng)稀釋后，按上述方法進(jìn)行測(cè)定。
[0012]結(jié)論:
通過(guò)上述的培養(yǎng)和提取，可以很清楚的判定本發(fā)明所述的細(xì)胞培養(yǎng)法在細(xì)胞培養(yǎng)15-18天后生產(chǎn)的金線蓮黃酮在收率上可以接近甚至超過(guò)同期播種生長(zhǎng)8個(gè)月的組培苗生產(chǎn)的金線蓮黃酮。
【權(quán)利要求】
1.懸浮培養(yǎng)細(xì)胞生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，其特征在于，是一種利用細(xì)胞培養(yǎng)反應(yīng)器對(duì)金線蓮細(xì)胞培養(yǎng)，添加植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑和生物酶制劑激活細(xì)胞生長(zhǎng)并縮短細(xì)胞培養(yǎng)周期，來(lái)生產(chǎn)金線蓮黃酮的方法，具體步驟為: (1)單細(xì)胞制備 取金線蓮蒴果消毒后進(jìn)行無(wú)菌播種，播種培養(yǎng)基為改良的1/2MS固體培養(yǎng)基，待萌發(fā)成原球莖后取出，選擇色澤鮮艷、個(gè)體碩大、活力旺盛的原球莖，采用酶解法分離制備單細(xì)胞,并離心過(guò)濾除雜,收集單細(xì)胞； (2)單細(xì)胞系培養(yǎng) 將收集到的單細(xì)胞接種到含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的擋板搖瓶中，鮮細(xì)胞接種量為25±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，震蕩培養(yǎng)，調(diào)pH值為5.6±2，溫度22±2°C，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到10000-20000個(gè)/mL，即可放大培養(yǎng)； (3)細(xì)胞群放大培養(yǎng) 將培養(yǎng)好的單細(xì)胞系接種于含有改良的1/2MS液體培養(yǎng)基的氣升式攪拌發(fā)酵罐中，培養(yǎng)基中加入:NAA 0.l-2mg/L,6-BA 0.l_2mg/L，果膠酶 50_100mg/L，纖維素酶 10_50mg/L，鮮細(xì)胞接種量為30±2g/L，光強(qiáng)度為1000-30001ux，色溫為4000-6000K，氣升攪拌懸浮培養(yǎng)，調(diào)節(jié)通氣速率和攪拌速率維持溶氧在30%，調(diào)節(jié)補(bǔ)料液和NaOH溶液流加量保持pH在.5.6 + 4 ； (4)當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60000-80000個(gè)/ml即可停止培養(yǎng)，時(shí)間為15-18天，采用低速離心或過(guò)濾法收集金線蓮細(xì)胞，再常規(guī)方法提取金線蓮黃酮。
【文檔編號(hào)】C12P17/06GK104450817SQ201410537016
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】鄧輝, 陳乃富, 劉文中, 陳存武, 韓邦興, 余茂耘 申請(qǐng)人:皖西學(xué)院