單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描檢測方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌（ Listeriamonocytogenes ）的方法。單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描檢測方法，該方法包括以下步驟：1）PNA分子信標(biāo)的設(shè)計(jì)；2）液相PNA分子信標(biāo)的原位雜交；3）熒光掃描；4）熒光掃描結(jié)果的判斷。本發(fā)明PNA具有良好的細(xì)胞穿透性，與DNA和RNA特異性結(jié)合的高穩(wěn)定性，使本發(fā)明的檢測方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。同時(shí)將PNA探針結(jié)合分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描技術(shù)，在大幅降低假陽性、克服假陰性的情況下大幅提高檢測效率，最后用顯微鏡對陽性樣品進(jìn)行確證，使檢測具有分子生物學(xué)和形態(tài)學(xué)的雙重保證，更加提高了鑒定的準(zhǔn)確率。
【專利說明】單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種鑒定單核細(xì)胞增多性李斯特菌 {Listeriamonocytogenes')該]卞法^

【背景技術(shù)】
[0002] 單核細(xì)胞增多性李斯特菌是李斯特菌屬中人畜共患型的食源性致病菌。感染后常 表現(xiàn)為腦膜腦炎、腦炎、骨髓炎、心肌炎、膿血癥、流產(chǎn)等，對嬰兒及免疫力低下的人群致死 率高達(dá)54%?90%。該菌在自然界中廣泛分布，環(huán)境適應(yīng)性很強(qiáng)，可通過多種途徑進(jìn)入食品 加工和生產(chǎn)過程污染食品，對消費(fèi)者健康構(gòu)成潛在威脅。
[0003] 肽核酸是1991年由丹麥科學(xué)家Nielsen等人設(shè)計(jì)的一種以中性酰胺鍵為骨架的 全新的DNA模擬物，可以序列特異地與DNA、RNA結(jié)合。其骨架為電中性，因此具有很高的 DNA或RNA親和性和良好的細(xì)胞穿透性，是核酸探針的良好選擇。PNA探針結(jié)合原位熒光雜 交技術(shù)（FISH)與PCR等方法比較，PNA-FISH法的結(jié)果判斷基于熒光檢測和形態(tài)檢測兩部 分，較PCR法等假陽性低，且PNA-FISH法可省去核酸提取的步驟。
[0004] 分子信標(biāo)（molecularbeacon)是一種在5'和3'末端自身形成一個(gè)8個(gè)堿基左 右的發(fā)夾結(jié)構(gòu)的莖環(huán)雙標(biāo)記寡核苷酸探針，兩端的核酸序列互補(bǔ)配對，因此標(biāo)記在一端的 熒光基團(tuán)與標(biāo)記在另一端的淬滅基團(tuán)緊緊靠近。當(dāng)熒光基團(tuán)被激發(fā)時(shí)，發(fā)生熒光共振能量 轉(zhuǎn)移，使熒光分子發(fā)出的熒光被猝滅分子吸收并以熱的形式散發(fā)，熒光幾乎完全被猝滅，熒 光本底極低。當(dāng)分子信標(biāo)與序列完全互補(bǔ)的靶標(biāo)分子結(jié)合形成雙鏈雜交體時(shí)，信標(biāo)莖桿互 補(bǔ)區(qū)被拉開，熒光分子和猝滅分子距離增大，信標(biāo)分子的熒光幾乎100%恢復(fù)，且所檢測到 的熒光強(qiáng)度與溶液中靶標(biāo)的量成正比。
[0005] 傳統(tǒng)的PNA-FISH法檢測中，結(jié)果的判斷單純依靠顯微鏡觀察，這無疑是一大限速 步驟，因此在本發(fā)明中引入熒光掃描技術(shù)，通過儀器對對應(yīng)波長熒光的掃描可以快速的對 檢測結(jié)果進(jìn)行初篩，大大提高了檢測速率和通量。同時(shí)，為了防止由于加入過量探針而引起 的假陽性，我們在探針的兩頭分別標(biāo)記了熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)，形成分子信標(biāo)結(jié)構(gòu)。當(dāng)探針 未與目標(biāo)核酸序列結(jié)合時(shí)，由于PNA的電中性骨架，無需普通核酸分子信標(biāo)所需的"莖桿" 設(shè)計(jì)，自然狀態(tài)下PNA分子信標(biāo)兩頭的熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)以自聚集的方式靠近，所激發(fā) 的熒光都被淬滅基團(tuán)吸收，因此即便液相PNA熒光雜交液中有過量的游離狀態(tài)的PNA探針 也檢測不到熒光，不會產(chǎn)生假陽性。而那些與目標(biāo)核酸結(jié)合的探針，由于探針伸展為線狀， 造成熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出熒光從而被檢測到。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述的技術(shù)問題，本發(fā)明的目的是提供換一種單核細(xì)胞增多性李斯特菌 的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描檢測方法，該檢測方法具有準(zhǔn)確、靈敏的特點(diǎn)。
[0007] 為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用了以下的技術(shù)方案： 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描檢測方法，該方法包括以 下步驟： 1) PNA分子信標(biāo)的設(shè)計(jì) 在具有單增李斯特菌（Listeriamonocytogenes)特異性的PNA探針的5'端和3'端 分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)BHQ1 ; 2) 液相PNA分子信標(biāo)的原位雜交 離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，室溫固定，固定好的菌體，離心，棄上清，加入PNA分子 信標(biāo)的雜交緩沖液室溫下重懸；同時(shí)設(shè)置兩組陰性對照： 對照一：不含PNA分子信標(biāo)的雜交緩沖液重懸； 對照二：含RNase和PNA分子信標(biāo)的雜交緩沖液重懸； 將上述重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中加洗滌緩沖液重懸； 3) 突光掃描 取上述三種的重懸液加入黑色孔板中，將熒光檢測系統(tǒng)的吸收光譜和激發(fā)光譜調(diào)整到 相應(yīng)的波長，進(jìn)行熒光掃描檢測； 4) 熒光掃描結(jié)果的判斷 將對照二設(shè)置為空白，值為〇,將掃描后數(shù)值大于〇的結(jié)果判斷為陽性；將對照一設(shè)置 為空白，將掃描后數(shù)值大于〇,且同時(shí)該孔在設(shè)置對照二為空白時(shí)掃描值又小于〇,同時(shí)滿 足上述2個(gè)條件的雜交液也判斷為陽性； 上述的方法不應(yīng)用于疾病的診斷。
[0008] 作為優(yōu)選，所述的步驟1)中PNA探針的序列為

【權(quán)利要求】
1. 單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃描檢測方法，其特征在于 該方法包括以下步驟： 1. PNA分子信標(biāo)的設(shè)計(jì) 在具有單增李斯特菌(Wisteria 特異性的PNA探針的5'端和3'端 分別標(biāo)記報(bào)告熒光基團(tuán)FAM和淬滅基團(tuán)BHQ1 ; 2) 液相PNA分子信標(biāo)的原位雜交 離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，室溫固定，固定好的菌體，離心，棄上清，加入PNA分子 信標(biāo)的雜交緩沖液室溫下重懸；同時(shí)設(shè)置兩組陰性對照： 對照一：不含PNA分子信標(biāo)的雜交緩沖液重懸； 對照二：含RNase和PNA分子信標(biāo)的雜交緩沖液重懸； 將上述重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中加洗滌緩沖液重懸； 3) 突光掃描 取上述三種的重懸液加入黑色孔板中，將熒光檢測系統(tǒng)的吸收光譜和激發(fā)光譜調(diào)整到 相應(yīng)的波長，進(jìn)行熒光掃描檢測； 4) 熒光掃描結(jié)果的判斷 將對照二設(shè)置為空白，值為〇,將掃描后數(shù)值大于〇的結(jié)果判斷為陽性；將對照一設(shè)置 為空白，將掃描后數(shù)值大于〇,且同時(shí)該孔在設(shè)置對照二為空白時(shí)掃描值又小于〇,同時(shí)滿 足上述2個(gè)條件的雜交液也判斷為陽性； 上述的方法不應(yīng)用于疾病的診斷。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟1)中PNA探針的序列為TAGTACAAAGGGTCG。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中離心收集對數(shù)生長期的細(xì)菌，用含50%酒精/磷酸緩沖液 PBS固定緩沖液重懸，細(xì)菌濃度控制在0D6(I(I=1. 0-1. 5,室溫固定1小時(shí)后置于-20°C保存。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中對照二的制備方法如下：用40呢/ml RNase，pH7. 5,重 懸，37°C溫育1小時(shí)，離心2000g，5min，棄上清后加入50W含300 pmole/ml PNA分子信標(biāo) 的雜交緩沖液重懸。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于步驟2)中將重懸菌液、兩組陰性對照于薄壁PCR管中，55°C水浴 1. 〇小時(shí)，加入200W洗滌緩沖液，預(yù)熱至55°C，55°C水浴20min，2000g離心5min，棄洗 滌緩沖液，再重復(fù)洗滌1次，加110?150耵洗滌緩沖液重懸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的單核細(xì)胞增多性李斯特菌的肽核酸分子信標(biāo)標(biāo)記和熒光掃 描檢測方法，其特征在于該方法還包括將步驟4)熒光掃描結(jié)果判斷為陽性的對應(yīng)步驟2) 中的重懸菌液取2?5W涂片，風(fēng)干后熒光顯微鏡觀察熒光亮度及細(xì)菌的形態(tài)，對結(jié)果加以 確證。
【文檔編號】C12Q1/04GK104342493SQ201410537112
【公開日】2015年2月11日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】吳姍, 張曉峰, 吳昺, 虞惠貞, 李可 申請人:浙江省檢驗(yàn)檢疫科學(xué)技術(shù)研究院