一種利用est微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊幼蟲的引物及方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)鑒別韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊幼蟲的方法，步驟如下：(1)提取韭菜遲眼蕈蚊基因組DNA；(2)以韭菜遲眼蕈蚊基因組DNA為模板對(duì)其進(jìn)行PCR擴(kuò)增；(3)對(duì)步驟(2)制得的PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析。本發(fā)明所述的鑒別方法，為篩選韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，為今后的韭菜遲眼蕈蚊的種群動(dòng)態(tài)鑒定、生物學(xué)以及控制的研究奠定了基礎(chǔ)。
【專利說明】-種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊 幼蟲的引物及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊幼蟲的引 物及方法，屬于農(nóng)業(yè)生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 亜菜遲眼蕈蚊（Bradysia odoriphaga Yang et Zhang)屬雙翅目 Diptera，長角 亞目Nematocera，眼蕈蚊科Sciaridae，遲眼蕈蚊屬，幼蟲俗稱韭蛆，是韭菜的主要害蟲。以 幼蟲危害韭菜葉鞘、幼芽和鱗莖，引起鱗莖腐爛、葉片枯死，輕者造成倒伏枯黃，重者缺苗斷 壟，嚴(yán)重影響韭菜產(chǎn)量和質(zhì)量。
[0003] 異遲眼蕈蚊（Bradysia difformis)幼蟲俗稱菌蛆，與遲眼蕈蚊同隸屬于遲眼蕈蚊 屬。韭蛆與菌蛆傳統(tǒng)的區(qū)分方法是依據(jù)兩者的形態(tài)特征（石寶才，路虹，宮亞軍等，2010.韭 菜遲眼蕈蚊的識(shí)別與防治.中國蔬菜，11 :21-22;張宏瑞，張曉云，沈登榮等，2008.食用菌 異遲眼蕈蚊的生物學(xué)特性.中國食用菌，27 (6) :54-56)。
[0004] 韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊在形態(tài)上相似，尤其是其幼蟲，非專業(yè)人士不能區(qū)分， 不利于韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊的快速鑒定。精確區(qū)分韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊幼蟲 是進(jìn)行有效防控的前提和基礎(chǔ)，這對(duì)于韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊的綜合防控具有重要的 理論意義和指導(dǎo)價(jià)值。
[0005] 本發(fā)明利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別不同物種，因?yàn)镋ST來自轉(zhuǎn)錄區(qū)，其保守性較高， 在家族和種屬間的通用性比來源于非表達(dá)序列的標(biāo)記更高，另外還具有開發(fā)簡單、快捷、費(fèi) 用低等特點(diǎn)。EST微衛(wèi)星標(biāo)記已經(jīng)廣泛應(yīng)用于植物、動(dòng)物、微生物以及昆蟲的物種檢測(cè)與鑒 定、遺傳分化鑒定等方面。
[0006] 但利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記構(gòu)建區(qū)分韭菜遲眼蕈蚊幼蟲與異遲眼蕈蚊幼蟲的方法目 前還未見報(bào)道。主要技術(shù)障礙在于，目前尚未有韭菜遲眼蕈蚊幼蟲與異遲眼蕈蚊幼蟲的轉(zhuǎn) 錄組文庫，因此無法進(jìn)行EST微衛(wèi)星標(biāo)記的構(gòu)建工作，且構(gòu)建能夠區(qū)分韭菜遲眼蕈蚊幼蟲 與異遲眼蕈蚊幼蟲的EST微衛(wèi)星標(biāo)記具有一定的偶然性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭蛆與菌蛆的引 物及方法。
[0008] -種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭蛆與菌蛆的引物，所述引物為一對(duì)，分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0009] -種鑒別韭蛆與菌蛆的方法，步驟如下：
[0010] ⑴提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液；
[0011] (2)以步驟（1)制得的基因組DNA為模板，利用上述的一對(duì)引物對(duì)基因組DNA進(jìn)行 PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0012] (3)對(duì)步驟（2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)束后，EB 染色后在紫外凝膠成像儀上成像，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有121bp的一條 條帶時(shí)，則該被檢測(cè)樣品為韭蛆；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品無條帶時(shí)，則為菌 蛆。
[0013] 所述步驟⑵中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為：
[0014] 基因組 DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 引物 0· 26μ l，5U/y I Taq 酶 0· 13μ l，10XTaq Buffer (緩沖液）I. 3 μ 1，IOmM dNTP 0· 26 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 13 μ I ;
[0015] 所述步驟（2)中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下：
[0016] 94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循 環(huán)；72 °C延伸7分鐘。
[0017] 上述步驟（1)中提取韭菜遲眼蕈蚊基因組DNA和步驟（3)中瓊脂糖凝膠電泳分析 均按本領(lǐng)域常規(guī)技術(shù)操作。上述實(shí)驗(yàn)步驟如無特別說明均可參見《分子克隆實(shí)驗(yàn)指南》第 三版（北京：科學(xué)出版社，2002)。
[0018] 有益效果
[0019] 1、本發(fā)明所述鑒別韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊的引物能夠擴(kuò)增韭菜遲眼蕈蚊基 因組DNA中的核基因，為鑒定韭菜遲眼蕈蚊與其他蕈蚊提供了簡便穩(wěn)定的分子標(biāo)記，解決 了區(qū)分韭菜遲眼蕈蚊的難題。
[0020] 2、本發(fā)明從分子水平探索了韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊EST序列的不同，探索建 立了韭菜遲眼蕈蚊的鑒別技術(shù)，為今后韭菜遲眼蕈蚊的種群動(dòng)態(tài)鑒定、生物學(xué)以及控制的 研究奠定了基礎(chǔ)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0021] 圖1是實(shí)施例2中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0022] 其中A、為韭菜遲眼蕈蚊；B、為異遲眼蕈蚊，M :DL2000DNA Marker。
[0023] 圖2是實(shí)施例3中PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0024] 其中A、為韭菜遲眼蕈蚊；B、為異遲眼蕈蚊，M :DL2000DNA Marker。

【具體實(shí)施方式】
[0025] 下面結(jié)合實(shí)例及附圖對(duì)本發(fā)明的內(nèi)容做進(jìn)一步的說明，但本發(fā)明所保護(hù)范圍不限 于此。
[0026] 實(shí)施例1中所述韭菜遲眼蕈蚊于2012年采集于山東省11地區(qū)；
[0027] 實(shí)施例2中A、B所述韭菜遲眼蕈蚊和異遲眼蕈蚊于2012年分別采集于山東省淄 博市沂源地區(qū)和山東省濰坊市昌樂地區(qū)；
[0028] 實(shí)施例3中A、B所述韭菜遲眼蕈蚊和異遲眼蕈蚊于2012年分別采集于山東省濟(jì) 寧市地區(qū)和山東省臨沂市費(fèi)縣地區(qū)；
[0029] 上述樣品均按照（石寶才，路虹，宮亞軍等，2010.韭菜遲眼蕈蚊的識(shí)別與防 治.中國蔬菜，11:21-22.;張宏瑞，張曉云，沈登榮等，2008.食用菌異遲眼蕈蚊Bradysia difformis的生物學(xué)特性.中國食用菌，27 (6) :54-56.)中記載的方法對(duì)上述韭菜遲眼蕈蚊 與異遲眼蕈蚊進(jìn)行了形態(tài)鑒定。
[0030] 實(shí)施例所述儀器為尼康SMZ745T體視顯微鏡，為普通市售產(chǎn)品。
[0031] 實(shí)施例1
[0032] 構(gòu)建了韭菜遲眼蕈蚊轉(zhuǎn)錄組文庫并測(cè)序。
[0033] 首先提取韭菜遲眼蕈蚊幼蟲總RNA，將提取的RNA經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳、核酸濃度及 質(zhì)量檢測(cè)，判斷總RNA濃度。將其中的包含poly (A)的mRNA通過有Oligo (dT)的磁珠進(jìn)行 富集純化，反轉(zhuǎn)錄出雙鏈cDNA并純化，利用Klenow添加 poly (A)并連接測(cè)序接頭，通過瓊 脂糖凝膠電泳對(duì)目的大小cDNA片段的回收和純化。利用PCR擴(kuò)增產(chǎn)物中的cDNA片段，并 對(duì)PCR目的產(chǎn)物進(jìn)行膠回收，純化并檢測(cè)合格后的cDNA片段，作為cDNA文庫在Illumina HiseqTM 2000上開展測(cè)序工作。通過Base calling軟件對(duì)測(cè)序峰圖進(jìn)行讀取，最終轉(zhuǎn)化為 序列數(shù)據(jù)（raw reads)，經(jīng)過對(duì)原始數(shù)據(jù)的分析篩選，得到韭菜遲眼蕈蚊的轉(zhuǎn)錄組文庫。
[0034] 利用韭菜遲眼蕈蚊轉(zhuǎn)錄組文庫中的13839條EST序列。經(jīng)過序列的前處理和聚 類分析后，共得到1047個(gè)unigenes序列。利用軟件DNAstar對(duì)亜菜遲眼蕈蚊EST序列 進(jìn)行預(yù)處理，去除載體序列和長度小于150bp的序列，然后用軟件Cap3 (http://genome. cs. mtu. edu/cap/cap3. html)對(duì)EST中長度大于150bp的序列按照默認(rèn)的參數(shù)進(jìn)行拼接。 利用MlSA(MicroSatallite)軟件進(jìn)行SSR查找，查找標(biāo)準(zhǔn)：單核苷酸重復(fù)10次以上，二核 苷酸重復(fù)6次以上，三核苷酸重復(fù)5次以上，四核苷酸以上的重復(fù)3次。獲得20對(duì)引物。
[0035] 經(jīng)過對(duì)上述引物進(jìn)行篩選，最終獲得一對(duì)引物，分別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
[0036] 引物序列如下：
[0037] 正義引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. 1
[0038] 反義引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0039] 實(shí)施例2
[0040] 一種鑒別韭蛆與菌蛆的方法，步驟如下：
[0041] (1)韭菜遲眼蕈蚊和異遲眼蕈蚊基因組DNA的提取
[0042] 將單頭山東省淄博市沂源地區(qū)韭蛆和山東省濰坊市昌樂地區(qū)菌蛆個(gè)體置于 含60 μ 1堿裂解液的0. 2ml的離心管中，堿裂解液為：50mmol · !/1Tris-HCl (pH8. 0)、 20mmol · L-1NaCUlmmol · L-1EDTA(乙二胺四乙酸）、1 % SDS(十二烷基硫酸鈉），用封口槍 頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在95°C水浴IOmin后，制得韭菜遲眼 蕈蚊基因組DNA溶液和異遲眼蕈蚊基因組DNA溶液。
[0043] (2)韭菜遲眼蕈蚊基因的PCR擴(kuò)增
[0044] 分別以步驟（1)制得的韭菜遲眼蕈蚊基因組DNA溶液和異遲眼蕈蚊基因組DNA溶 液為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0045] PCR擴(kuò)增體系為：
[0046] 韭菜遲眼蕈蚊基因組DNA溶液：2μ1 ;20μΜ引物：0·26μ1 ;5U/yl Taq酶： 0· 13 μ I ; 10 X Taq Buffer : I. 3 μ I ; IOmM dNTP :0· 26 μ I ;ddH20 補(bǔ)至 13 μ I ;
[0047] 引物序列如下：
[0048] 正義引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. I
[0049] 反義引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0050] PCR擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸 30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸7分鐘。
[0051] (3)用質(zhì)量百分比為2.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟⑵制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行電泳檢測(cè)，EB染色后在紫外凝膠成像儀上成像。結(jié)果顯示，韭菜遲眼蕈蚊在成像膠片上 均有有一條片段長度121bp左右的條帶；異遲眼蕈蚊在成像膠片上均無長度121bp左右的 條帶，結(jié)果如圖1所示。
[0052] 實(shí)施例3
[0053] -種鑒別韭蛆與菌蛆的方法，步驟如下：
[0054] (1)將單頭個(gè)體樣品分別置于含60 μ 1堿裂解液的0. 2ml的離心管中，堿裂解液 為：50mmol · L 1Tris-HCl (ρΗ8· 0)、20mmol · L 1NaCUmmol · L 1EDTA(乙二胺四乙酸）、1 % SDS，（十二烷基硫酸鈉）用封口槍頭充分研磨勻漿后，置于水浴鍋65°C水浴15min，然后在 95°C水浴IOmin后，得基因組DNA溶液；
[0055] (2)以步驟（1)制得的基因組DNA為模板，對(duì)基因組DNA中的EST序列進(jìn)行PCR擴(kuò) 增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；
[0056] PCR擴(kuò)增體系為：
[0057] 基因組 DNA 溶液 2μ 1，20μΜ 引物 0· 26μ l，5U/y ITaq 酶 0· 13μ l，10XTaq Buffer I. 3 μ 1，IOmM dNTP 0· 26 μ 1，ddH20 補(bǔ)至 13 μ I ;
[0058] 引物序列如下：
[0059] 正義引物 EST-F :5, -TTAATTCGTTATCGCTGTG-3, ；SEQ ID NO. I
[0060] 反義引物 EST-R :5, -ATGACTCGTCGCTAGACC-3, ；SEQ ID NO. 2
[0061] PCR擴(kuò)增條件如下：94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸 30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)；72 °C延伸7分鐘；
[0062] (3)用質(zhì)量百分比為2.0%的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)步驟（2)制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn) 行電泳檢測(cè)，EB染色后在紫外凝膠成像儀上成像；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品 有121bp的一條條帶時(shí)，則該被檢測(cè)樣品為韭蛆；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品無 條帶時(shí)，則為菌蛆，結(jié)果如圖2所示，該檢測(cè)結(jié)果與按照（石寶才，路虹，宮亞軍等，2010.韭 菜遲眼蕈蚊的識(shí)別與防治.中國蔬菜，11:21-22.;張宏瑞，張曉云，沈登榮等，2008.食用菌 異遲眼蕈蚊Bradysia difformis的生物學(xué)特性.中國食用菌,27(6):54-56.)中記載的方 法對(duì)上述韭菜遲眼蕈蚊與異遲眼蕈蚊進(jìn)行形態(tài)鑒定的結(jié)果一致。
【權(quán)利要求】
1. 一種利用EST微衛(wèi)星標(biāo)記鑒別韭蛆與菌蛆的引物，其特征在于，所述引物為一對(duì)，分 別為SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
2. -種鑒別韭蛆與菌蛆的方法，其特征在于，步驟如下： (1) 提取待鑒定樣品的基因組DNA，得基因組DNA溶液； (2) 以步驟⑴制得的基因組DNA為模板，利用權(quán)利要求1所述的一對(duì)引物對(duì)基因組 DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，制得PCR擴(kuò)增產(chǎn)物； (3) 對(duì)步驟⑵制得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析，電泳結(jié)束后，EB染色后 在紫外凝膠成像儀上成像，當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品有121bp的一條條帶時(shí)， 則該被檢測(cè)樣品為韭蛆；當(dāng)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜顯示被測(cè)樣品無條帶時(shí)，則為菌蛆。
3. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增體系為： 基因組0嫩溶液2以1，2(^]\1弓|物0.264 1，5"4 1丁&9酶0.134 1，10\丁&9 Buffer(緩沖液）1. 3μ 1，10mM dNTP 0· 26μ 1，ddH20 補(bǔ)至 13μ 1。
4. 如權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述步驟⑵中PCR擴(kuò)增的擴(kuò)增條件如下： 94°C預(yù)變性5分鐘；94°C變性30秒，50°C退火30秒，72°C延伸30秒，進(jìn)行35個(gè)循環(huán)； 72 °C延伸7分鐘。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104263840SQ201410538459
【公開日】2015年1月7日 申請(qǐng)日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】褚棟, 楊峰山, 郭雅男, 王磊, 臺(tái)術(shù)蕾, 張存環(huán) 申請(qǐng)人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)