一種利用人參端粒長度鑒別人參年限的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種利用人參端粒長度鑒別人參年限的方法。該方法包括如下步驟：1)取待測人參位于蘆頭以下1～2cm處的樣品，提取總DNA；2)取總DNA，用能夠識別并切割5’-TCGA-3’所示雙鏈DNA的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；3)以5’-CCCTAAA-3’所示的單鏈DNA為探針，對酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern印記雜交或點(diǎn)雜交；4)根據(jù)雜交結(jié)果，對雜交產(chǎn)物的限制性片段長度進(jìn)行測定，得到所述待測人參的端粒限制性片段長度，記為TRF待測；5)將TRF待測作為y值代入公式y(tǒng)＝0.827x+8.231，所得x值即為所述待測人參的年限。實(shí)驗(yàn)證明，該方法測定的人參年限與實(shí)際年限吻合度極高，而且該方法所需樣品量極少，對人參損害極小，可謂一種無損鑒定方法。
【專利說明】一種利用人參端粒長度鑒別人參年限的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種利用人參端粒長度鑒別人參年限的方法，特 別涉及一種利用人參端粒限制性片段長度（TRF值）鑒別人參年限的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 藥材人參，為五加科植物人參的根部，在中國傳統(tǒng)醫(yī)藥中作為滋補(bǔ)強(qiáng)壯藥已經(jīng)使 用了近千年。人參于種植后第四年開花，其根部在4-6年間逐漸成熟且能成活數(shù)百年。研 究表明，人參根部年限越長、人參皂苷含量越高，使其具有更高的藥用價值和商業(yè)價值。
[0003] 人參年限的傳統(tǒng)鑒別方法為性狀鑒定，即通過觀察人參蘆碗的數(shù)量判斷人參的年 限，但部分蘆碗融合較難觀察，且機(jī)械破損也會導(dǎo)致人參年限無法斷定，更有甚者用移栽的 方式增加蘆碗數(shù)量以次充好?；瘜W(xué)分析也常常作為人參年限鑒別的方法之一，但該方法往 往需要數(shù)克人參粉末樣品，難以保證人參外形的完整性，大大損壞了人參的價值。因此，為 了保護(hù)消費(fèi)者權(quán)益、保證人參價值，必須探索到一種誤差小、可操作、可量化、基本實(shí)現(xiàn)無損 鑒定的年限鑒定技術(shù)。
[0004] 近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，通過分子手段用來檢測人參的年限已成為了一 個突破口。端粒是由一組串聯(lián)的重復(fù)DNA序列（TTAGGG in all vertebrates)組成的，處于 染色體兩端所必不可少的核糖核蛋白復(fù)合體，在染色體上起著維護(hù)基因組穩(wěn)定性的作用。 2009年諾貝爾生理學(xué)獎科學(xué)家揭示端粒長度隨著體細(xì)胞的分裂而逐漸縮短這一特性，每一 輪的細(xì)胞分裂都會導(dǎo)致端粒的縮短，這決定了它可以作為DNA的"年輪"和分子鐘，在一定 程度上反映生物個體的年齡水平。
[0005] Southern印跡雜交（Southern blot)是進(jìn)行基因組DNA特定序列定位的通用方 法。其基本原理是：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補(bǔ)的原則 特異性地雜交形成雙鏈。利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠 上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫 外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進(jìn)行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢 測特定DNA分子的含量。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明的目的是提供一種利用人參端粒限制性片段長度（TRF值）鑒別人參年限 的方法。
[0007] 本發(fā)明所提供的鑒別人參年限的方法，具體可包括如下步驟：
[0008] (1)取待測人參位于蘆頭以下1?2cm處的樣品，提取基因組DNA ;
[0009] (2)取步驟（1)提取的基因組DNA，用能夠識別并切割5' -TCGA-3'所示雙鏈DNA 的內(nèi)切酶進(jìn)行酶切；
[0010] ⑶以5' -CCCTAAA-3'所示的單鏈DNA為探針，對步驟⑵所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行 Southern印記雜交或點(diǎn)雜交；
[0011] (4)根據(jù)步驟（3)的雜交結(jié)果，對雜交產(chǎn)物的限制性片段長度（TRF)進(jìn)行測定，得 到所述待測人參的端粒限制性片段長度，記為TRF;
[0012] (5)將步驟（4)獲得的TRFot作為y值代入公式I，所得X值即為所述待測人參的 年限；
[0013] y = 0. 827x+8. 231 公式 I
[0014] 式中，X代表人參年限，y代表端粒限制性片段長度。
[0015] 在所述方法的步驟（1)中，所取的所述樣品的量可為干重0. 1?Ig(如0. Ig)。
[0016] 在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述基因組DNA的提取方法具體為CTAB法。
[0017] 在所述方法的步驟（2)中，所取的所述基因組DNA的量可為1?20 μ g(如IOyg)。
[0018] 在所述方法的步驟⑵中，所述能夠識別并切割5'-TCGA-3'所示雙鏈DNA的內(nèi)切 酶可為限制性內(nèi)切酶Taq aI或所述限制性內(nèi)切酶TaqaI的同裂酶。在本發(fā)明的一個實(shí)施例 中所述能夠識別并切割5' -TCGA-3'所示雙鏈DNA的內(nèi)切酶具體為NEB公司生產(chǎn)的限制性 內(nèi)切酶TaqaI。
[0019] 在所述方法的步驟（3)中，所述探針需帶有熒光標(biāo)記或非放射性標(biāo)記；
[0020] 所述熒光標(biāo)記可為熒光素、德克薩斯紅、Cy5或Cy3 ;所述非放射性標(biāo)記可為地高 辛或生物素。在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，所述探針攜帶的標(biāo)記具體為地高辛。
[0021] 在本發(fā)明的一個實(shí)施例中，在所述步驟（3)中，對步驟（2)所得酶切產(chǎn)物具體進(jìn)行 的Southern印記雜交。
[0022] 在所述方法的步驟（4)中，所述"根據(jù)步驟（3)的雜交結(jié)果，對雜交產(chǎn)物的限制性 片段長度（TRF)進(jìn)行測定，得到所述待測人參的端粒限制性片段長度"具體為：將步驟（3) 雜交所得的顯影結(jié)果用端粒長度分析軟件（如Telomeric. 2軟件）根據(jù)公式II計(jì)算出對 應(yīng)的限制性片段長度TRF ;
[0023] TRF = Σ Ai/ Σ (Ai/Li) 公式 II
[0024] 式中，Ai為i點(diǎn)的吸光度值，Li為i點(diǎn)的Marker長度。
[0025] 對于本發(fā)明所提供的方法，所述待測人參需為年限在3年以上的人參。
[0026] 實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明利用人參端粒5' -TTTAGGG-3'重復(fù)序列，使用TaqaI內(nèi)切酶對 人參DNA酶切，而后以5'-CCCTAAA-3'為探針，進(jìn)行Southern印跡雜交，得到端粒特異性雜 交條帶，結(jié)合TRF值建立數(shù)學(xué)模型得出人參年限計(jì)算公式，對人參年限進(jìn)行評估。結(jié)果表明 該方法測定的人參年限與實(shí)際年限吻合度極高，而且該方法所需樣品量極少，對人參損害 極小，可謂一種無損鑒定方法。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0027] 圖1為人參Southern雜交圖及人參年限和TRF值的數(shù)學(xué)模型。其中，A為人參 Southern雜交圖（2、3、4、5、6、8表示對應(yīng)人參樣品的年限，M為DNA Molecular Weight Marker III) ;B為人參年限和TRF值的數(shù)學(xué)模型。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。
[0029] 下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。
[0030] 臺式高速離心機(jī)（Eppendorf公司）、Olympms突光顯微鏡、WFJ Unic 7200 spectrophotometer、BS2202S 型電子天平（Startorius 公司）、SIM-F124 型制冰機(jī)（SANYO 公司）、4KBTXL-75型真空冷凍干燥機(jī)（Virtis公司）；680X凝膠成像分析系統(tǒng)（基因有限 公司）、PAGE凝膠電泳儀、CS101-2A電熱干燥箱、SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義市予化儀器 有限公司）；Retsch MM400磨樣機(jī)、5810R型低溫冷凍離心機(jī)。
[0031] UNIQ-IO柱式DNA純化試劑盒（上海生工）、NEB限制性內(nèi)切酶TaqaI、DNA Molecular Weight Marker III、Digoxigenin labeled、Blocking Reagent、地高辛抗體 Anti-Digoxigenin-AP(羅氏）、Q)P-Star (羅氏）；地高辛雜交探針標(biāo)記 5' -CCCTAAA-3' 由 上海生工合成。
[0032] 實(shí)施例1、利用人參端粒長度鑒別人參年限的方法的建立
[0033] 供試人參：來自兩個地區(qū)不同年限的人參樣品，詳見表1。
[0034] 表1兩個地區(qū)不同年限的人參樣品
[0035]

【權(quán)利要求】
1. 一種鑒別人參年限的方法，包括如下步驟： (1)取待測人參位于蘆頭以下1?2cm處的樣品，提取總DNA ; ⑵取步驟（1)提取的總DNA，用能夠識別并切割5' -TCGA-3'所示雙鏈DNA的內(nèi)切酶 進(jìn)行酶切； (3) 以5'-CCCTAAA-3'所示的單鏈DNA為探針，對步驟（2)所得酶切產(chǎn)物進(jìn)行Southern 印記雜交或點(diǎn)雜交； (4) 根據(jù)步驟（3)的雜交結(jié)果，對雜交產(chǎn)物的限制性片段長度進(jìn)行測定，得到所述待測 人參的端粒限制性片段長度，記為TRFi^ ; (5) 將步驟⑷獲得的TRF_(作為y值代入公式I，所得X值即為所述待測人參的年 限； y = 0· 827χ+8· 231 公式 I 式中，X代表人參年限，y代表端粒限制性片段長度。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1)中，所取的所述樣品的量為干重 0· 1 ?lg〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所取的所述總DNA的量 為1?20 μ g。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1-3中任一所述的方法，其特征在于：步驟（2)中，所述能夠識別并切 割5 '-TCGA-3 '所示雙鏈DNA的內(nèi)切酶為限制性內(nèi)切酶TaqaI或所述限制性內(nèi)切酶TaqaI的 同裂酶。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1-4中任一所述的方法，其特征在于：步驟（3)中，所述探針帶有熒光 標(biāo)記或非放射性標(biāo)記； 所述熒光標(biāo)記為熒光素、德克薩斯紅、Cy5或Cy3 ;所述非放射性標(biāo)記為地高辛或生物 素。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1-5中任一所述的方法，其特征在于：步驟（4)中，所述根據(jù)步驟（3) 的雜交結(jié)果，對雜交產(chǎn)物的限制性片段長度進(jìn)行測定，得到所述待測人參的端粒限制性片 段長度，為：將步驟（3)雜交所得的顯影結(jié)果用端粒長度分析軟件根據(jù)公式II計(jì)算出對應(yīng) 的限制性片段長度TRF ; TRF =Σ Ai/ Σ (Ai/Li)公式 II 式中，Ai為i點(diǎn)的吸光度值，Li為i點(diǎn)的Marker長度。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1-6中任一所述的方法，其特征在于：所述待測人參為年限在3年以 上的人參。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293955SQ201410538757
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月13日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月13日
【發(fā)明者】黃璐琦, 蔣超, 袁媛, 王堯龍 申請人:中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所