一種豬鏈球菌2型的ss2-lamp檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用，該試劑盒由豬鏈球菌前處理液和LAMP反應(yīng)試劑組成，包括SEQIDNO.1、SEQIDNO.2、SEQIDNO.3、SEQIDNO.3、SEQIDNO.4、SEQIDNO.5、SEQIDNO.6；還包括以下組分：(1)前處理液；(2)LAMP反應(yīng)液；(3)聚合酶；(4)顯色液；(5)陽(yáng)性對(duì)照樣品為基因組，陰性對(duì)照為無(wú)菌去離子水。能快速檢測(cè)食品中或者動(dòng)物污染或攜帶的豬鏈球菌2型。提高了檢測(cè)的靈敏度并減少了檢測(cè)時(shí)間，在檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了創(chuàng)新，極大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。方法簡(jiǎn)單易行，節(jié)省時(shí)間，降低成本。檢測(cè)過(guò)程不需要PCR儀和檢測(cè)的設(shè)備，反應(yīng)時(shí)間短，靈敏度高，能檢測(cè)到fg級(jí)別的核酸，適合快速檢測(cè)醫(yī)療衛(wèi)生、動(dòng)物疫病或食品安全領(lǐng)域中的豬鏈球菌2型。
【專利說(shuō)明】—種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒及應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于食品安全檢測(cè)或者病原微生物檢測(cè)領(lǐng)域，更具體涉及一種檢測(cè)病原微生物的試劑盒，還涉及一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒的用途。適用于醫(yī)療衛(wèi)生、食品和動(dòng)物疫病的快速檢測(cè)。

【背景技術(shù)】
[0002]豬鏈球菌2 型(Streptococcus suis serotype 2, S.suis 2)是一種重要的人畜共患傳染病病原。S.suis 2不僅導(dǎo)致豬出現(xiàn)腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、肺炎、心內(nèi)膜炎和敗血癥等癥狀，造成豬只大量死亡，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失，還可以通過(guò)與感染豬、帶菌豬肉直接接觸而傳染給人，導(dǎo)致人永久性聽(tīng)力喪失、敗血癥型休克甚至死亡，嚴(yán)重威脅著人類的身體健康和生命安全，已引起社會(huì)的高度關(guān)注。1998年在江蘇南通S.suis 2造成病死豬10萬(wàn)余頭，人群感染25例；2005年四川省S.suis 2造成死亡豬幾千頭，人群感染208例。同期廣東、香港也有病例報(bào)導(dǎo)。豬鏈球菌病已成為泰國(guó)的重要傳染病，也是香港引起腦膜腦炎的第三大病原(僅次于肺炎鏈球菌和結(jié)核分枝桿菌)和越南引起腦膜腦炎的第一大病原。
[0003]目前豬鏈球菌的檢測(cè)方法主要有微生物學(xué)方法、免疫學(xué)方法和分子生物學(xué)方法等。在顯微鏡下豬鏈球菌呈圓形或橢圓形，常呈鏈狀排列，長(zhǎng)短不一，革蘭氏染色陽(yáng)性。豬鏈球菌在加有血液或血清的培養(yǎng)基中生長(zhǎng)良好，在瓊脂平板上培養(yǎng)可見(jiàn)表面光滑整齊的白色菌落。多數(shù)致病性豬鏈球菌具有溶血能力，在血平板上呈β溶血。微生物學(xué)方法檢測(cè)方法操作過(guò)程比較繁瑣，對(duì)操作人員要求較高，耗時(shí)且靈敏度較低。免疫學(xué)的檢測(cè)方法包括血清凝集實(shí)驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)和協(xié)同凝集實(shí)驗(yàn)，這類方法對(duì)操作人員要求較高，耗時(shí)。近年來(lái)分子生物學(xué)的檢測(cè)方法的發(fā)展較大程度上提高了病原檢測(cè)的特異性和靈敏度，如特異性的核酸探針和PCR檢測(cè)方法。然而，該類方法需要儀器設(shè)備，檢測(cè)耗時(shí)，無(wú)法滿足快速檢測(cè)的需求。
[0004]環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增(loop-mediatedisothermal amplificat1n,LAMP)是一種新型的核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，該技術(shù)針對(duì)靶基因的6個(gè)區(qū)域設(shè)計(jì)6條特異引物，利用一種鏈置換DNA聚合酶(Bst DNA polymerase),在60?65°C恒溫條件下反應(yīng)幾十分鐘即可完成核酸擴(kuò)增反應(yīng)，擴(kuò)增出LAMP特征性梯狀條帶。在LAMP反應(yīng)結(jié)束后加入熒光染料，可直接通過(guò)顏色變化來(lái)判定反應(yīng)結(jié)果。LAMP技術(shù)在保持PCR技術(shù)優(yōu)點(diǎn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步增強(qiáng)了反應(yīng)的特異性并縮短了檢測(cè)時(shí)間；特別是它不需使用昂貴的熱循環(huán)儀，在等溫條件下就能完成反應(yīng)，且擴(kuò)增產(chǎn)物用肉眼能觀察，可用于病原微生物的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)。已廣泛應(yīng)用于細(xì)菌、寄生蟲(chóng)、轉(zhuǎn)基因作物領(lǐng)域的檢測(cè)，并取得了較理想的效果。適合基層推廣檢測(cè)；符合疾病檢測(cè)的快速、準(zhǔn)確的診斷需要。
[0005]通過(guò)檢索有以下專利申請(qǐng)，CN1896279A公開(kāi)了一種PCR法檢測(cè)豬鏈球菌2型的方法，其中同時(shí)使用了 3對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，該方法需要PCR儀，只能在菌濃度為450個(gè)/mL以上時(shí)具有陽(yáng)性結(jié)果。CN102605046A公開(kāi)了一種試劑盒和檢測(cè)豬鏈球菌2型的方法，該試劑盒包括上游引物、下游引物和探針，所述上游引物的5’端和/或所述下游引物的5’端被生物素修飾；所述探針的5’端和/或3’端被地高辛修飾；所述探針能夠與所述雙鏈DNA擴(kuò)增產(chǎn)物中帶有生物素修飾的單鏈DNA雜交，該方法特異性較強(qiáng)，但該方法操作復(fù)雜、檢測(cè)耗費(fèi)時(shí)間長(zhǎng)，且其靈敏度具有很大的改進(jìn)空間。CN103409546A公布了一種檢測(cè)豬鏈球菌的試劑盒及應(yīng)用，包括了細(xì)菌基因組DNA提取、CPS2J基因的LAMP擴(kuò)增和電泳檢測(cè)。所述的檢測(cè)試劑盒所針對(duì)的檢測(cè)靶CPSCPS2J基因的部分核酸序列存在于其他種屬的細(xì)菌中，針對(duì)該靶點(diǎn)建立的豬鏈球菌2型檢測(cè)方法的準(zhǔn)確性受到影響。同時(shí)，所述的檢測(cè)方法需要提取樣本的基因組才能進(jìn)行檢測(cè)，耗時(shí)較長(zhǎng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒，能快速檢測(cè)食品中或者動(dòng)物攜帶的豬鏈球菌2型。與PCR檢測(cè)方法相比，SS2-LAMP檢測(cè)方法提高了檢測(cè)的靈敏度并減少了檢測(cè)時(shí)間。同時(shí)，在檢測(cè)靶點(diǎn)的選擇上進(jìn)行了創(chuàng)新，SS2-LAMP檢測(cè)方法與生物信息學(xué)結(jié)合，編寫(xiě)基因組比對(duì)程序高通量篩選出豬鏈球菌2型基因組中特有的靶序列，并設(shè)計(jì)相應(yīng)的特異性引物，極大提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。此外，SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒不需要基因組提取步驟，提高檢測(cè)效率降低檢測(cè)成本。
[0007]本發(fā)明的另一個(gè)目的是在于提供了一種豬鏈球菌2型的LAMP試劑盒在食品、動(dòng)物疫病和衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用，該方法簡(jiǎn)單易行，不需要提取基因組，節(jié)省時(shí)間，降低成本。檢測(cè)過(guò)程不需要PCR儀和檢測(cè)的設(shè)備，只需要能夠設(shè)定溫度的水浴鍋，對(duì)設(shè)備依賴程度低，反應(yīng)時(shí)間短，僅需要I小時(shí)可以完成整個(gè)檢測(cè)過(guò)程，靈敏度高，能檢測(cè)到fg級(jí)別的核酸。
[0008]為了實(shí)現(xiàn)上述的目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)措施:
一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒，借助生物信息學(xué)的方法，編寫(xiě)基因組比對(duì)程序，發(fā)掘了一段豬鏈球菌2型的特有序列，豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括豬鏈球菌前處理液和LAMP反應(yīng)試劑，其特征包括引物組SS21-FIP引物的核酸序列如SEQ IDN0.1所示、SS21-BIP引物的核酸序列如SEQ ID N0.2所示、SS21-F3引物的核酸序列如SEQ ID N0.3所示、SS21-B3引物的核酸序列如SEQ ID N0.3所示、SS21-F3引物的核酸序列如SEQ ID N0.4所示、SS21-LF引物的核酸序列如SEQ ID N0.5所示、SS21-LB引物的核酸序列如SEQ ID N0.6所示。
[0009]所述的試劑盒還包括以下組分:
(1)前處理液(A液):20 mM Tris-HCl ；
(2)LAMP 反應(yīng)液(B 液):20 mM Tris-HClUOmM (NH4)2S04、1mM KCl、2mM MgS04、10 μ M dNTPs、20ymol/L SS21_FIP、20 μ mol/L SS21-BIP、10 μ mol/L SS21-F3、10 μ mol/LSS21-B3、10ymol/L SS21-LF and 10 μ mol/L SS21-LB ；
(3)聚合酶(C液):3個(gè)酶活單位的BstDNA聚合酶；
(4)顯色液(D液):含有10%(體積比)SYBR Green I的熒光染料。
[0010](5)陽(yáng)性對(duì)照樣品為豬鏈球菌2型的基因組(P液)，陰性對(duì)照為無(wú)菌去離子水(N液)。
[0011]一種豬鏈球菌2型的LAMP試劑盒在食品、動(dòng)物疫病(病原)和醫(yī)療衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用，采用上述試劑盒中的試劑進(jìn)行檢測(cè)，具體包括如下步驟: (I)前處理:將從疑似被豬鏈球菌2型污染的生豬肉、豬內(nèi)臟、肉制品、或其他食品以及疑似感染動(dòng)物的組織、血液或腦脊液中劃線分離到的疑似菌落，或者增菌液進(jìn)行離心集菌。將菌落或離心得到的菌體加入50 μ L前處理液(Α液)中振蕩混勻，再于100°C中水浴10分鐘，完成待檢樣品前處理。
[0012](2)豬鏈球菌2型的LAMP擴(kuò)增:
步驟1.根據(jù)待測(cè)樣品個(gè)數(shù)，設(shè)置LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品個(gè)數(shù)+2(含有I管陽(yáng)性對(duì)照和I管陰性對(duì)照);
步驟2.將含有LAMP反應(yīng)液(B液)的反應(yīng)管取出，加入I yL Bst DNA聚合酶，混勻；步驟3.依次向反應(yīng)管中分別加入I UL陰性對(duì)照(N液)、待檢樣品和陽(yáng)性對(duì)照基因組(P液)，蓋緊管蓋并做好相應(yīng)標(biāo)記；
步驟4.在55 °C -65 °C攝氏度下恒溫反應(yīng)30-50分鐘均可。
[0013](3)結(jié)果判讀:兩種判定方法選其一則可。
[0014](3.1)顯色反應(yīng):取出LAMP反應(yīng)管,依次加入I μ L顯色液(D液)，蓋緊管蓋,混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽(yáng)性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽(yáng)性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)。
[0015](3.2)電泳檢測(cè):從LAMP反應(yīng)管中取出2 μ L樣品直接點(diǎn)樣于0.8%(質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，80V-120V電泳30-40分鐘后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察LAMP的梯狀條形帶。得到梯狀條形帶則判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有條形帶則為陰性。
[0016]所述的食品主要是疑似受到豬鏈球菌2型污染的豬肉類食物，包括生豬肉、豬內(nèi)臟、以及臘肉、熏肉、灌腸等各種豬肉制品。
[0017]所述的動(dòng)物為疑似受到豬鏈球菌2型感染的豬和人及其他動(dòng)物。
[0018]與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點(diǎn):
(I)準(zhǔn)確性高:本發(fā)明基于生物信息學(xué)篩選出來(lái)的特異性核酸靶點(diǎn)建立檢測(cè)方法，基于特異性靶點(diǎn)設(shè)計(jì)的特異性引物準(zhǔn)確度更高。
[0019](2)快速高效:本發(fā)明建立的試劑盒不需要提取基因組，經(jīng)過(guò)前處理液處理10分鐘后直接用于LAMP反應(yīng)過(guò)程，前期處理樣品、擴(kuò)增反應(yīng)和顯色反應(yīng)全過(guò)程最短只需要50min即可完成。對(duì)恒溫儀器的精密度要求低，可在55-65度間均能良好擴(kuò)增。
[0020](3)操作簡(jiǎn)便:本發(fā)明建立的試劑盒不需要提取基因組，并將各種試劑配制成為預(yù)反應(yīng)液，整個(gè)過(guò)程不需要復(fù)雜的儀器，不需要特殊試劑，檢測(cè)結(jié)果肉眼可見(jiàn)，操作流程非常簡(jiǎn)便，對(duì)檢測(cè)人員的技術(shù)素質(zhì)要求較低。
[0021]本發(fā)明適合快速檢測(cè)醫(yī)療衛(wèi)生、動(dòng)物疫病或食品安全領(lǐng)域中的豬鏈球菌2型。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0022]圖1A、1B、1C為一種豬鏈球菌2型不同濃度基因組的LAMP檢測(cè)示意圖。
[0023]M.Marker ；N.陰性對(duì)照；1.1OOpg豬鏈球菌2型基因組；2.1Opg豬鏈球菌2型基因組；3.1pg豬鏈球菌2型基因組；4.1OOfg豬鏈球菌2型基因組.5:1Ofg豬鏈球菌2
型基因組。
[0024]圖1A為一種瓊脂糖凝膠電泳分析LAMP反應(yīng)產(chǎn)物示意圖； 圖1B為一種LAMP反應(yīng)產(chǎn)物中加入顯色液后在正常光線下的結(jié)果示意圖；
圖1C為一種LAMP反應(yīng)產(chǎn)物在紫外燈下顯示結(jié)果示意圖。
[0025]圖2A、2B、2C為一種豬鏈球菌2型不同菌液濃度LAMP反應(yīng)產(chǎn)物檢測(cè)示意圖。
[0026]M.Marker ；N.陰性對(duì)照；1.8*106 cfu / μ L 豬鏈球菌 2 型；2.8*105 cfu /μ L豬鏈球菌 2 型；3.8*104 cfu /μ L.4.8*103 cfu / μ L豬鏈球菌 2 型.5:8*102 cfu / μ L豬鏈球菌2型。圖1A為瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物；圖1B為擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色液后在正常光線下的結(jié)果；圖1C為反應(yīng)產(chǎn)物在紫外燈下顯示結(jié)果。
[0027]圖3A、3B、3C為一種擴(kuò)增反應(yīng)可在55?65°C下進(jìn)行示意圖。
[0028]M.Marker ;N.陰性對(duì)照；1.55°C ；2.59°C ；3.61°C ；4.63°C;5:65°C。圖1A為瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物；圖1B為擴(kuò)增產(chǎn)物中加入顯色液后在正常光線下的結(jié)果；圖1C為反應(yīng)產(chǎn)物在紫外燈下顯示結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0029]以下結(jié)合具體實(shí)例，進(jìn)一步闡明本發(fā)明，這些實(shí)例僅用于說(shuō)明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明要求保護(hù)的范圍。
[0030]實(shí)施例1:
一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒，它由以下組分組成:
豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒，包括LAMP引物組、反應(yīng)液、Bst DNA聚合酶、陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。
[0031](I) LAMP引物設(shè)計(jì):針對(duì)豬鏈球菌2型的特異性基因，設(shè)計(jì)豬鏈球菌2型的特異性檢測(cè)引物。
[0032](2) LAMP擴(kuò)增反應(yīng)液的配制:
20 mM Tris-HClUOmM (NH4) 2S04、1mM KCl、2mM MgS04、10yM dNTPs、20 μ mol/L SS21-FIP、20ymol/L SS21-BIP、10 μ mol/L SS21-F3、10 μ mol/L SS21-B3、10 μmol/LSS21-LF and 10 μ mol/L SS21_LB、1 μ L Bst DNA 聚合酶和顯色液(SYBR Green I)。
[0033](3)擴(kuò)增反應(yīng):依次向反應(yīng)體系中加入陰性對(duì)照(ddH20)和不同濃度待檢測(cè)的基因組(10pg?1fg)在55或57或59或61或63或65°C攝氏度下恒溫反應(yīng)30或40或50分鐘均可。
[0034]實(shí)施例2:
一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP試劑盒在食品、動(dòng)物疫病(病原)、醫(yī)療衛(wèi)生檢測(cè)中的應(yīng)用，其步驟是:
(I)前處理:將從疑似被豬鏈球菌2型污染的生肉、肉制品、或其他食品以及疑似感染動(dòng)物的組織、血液或腦脊液中劃線分離到的疑似菌落，或者增菌液進(jìn)行離心集菌。將菌落或離心得到的菌體加入含有50 μ L前處理液(Α液)的管I (前處理管)中振蕩混勻，再于100°C中水浴10分鐘，完成待檢樣品的前處理。
[0035](2) LAMP 擴(kuò)增:
步驟1.根據(jù)待測(cè)樣品個(gè)數(shù)，設(shè)置LAMP反應(yīng)管數(shù)N，N=樣品個(gè)數(shù)+2(含有I管陽(yáng)性對(duì)照和I管陰性對(duì)照);
步驟2.將含有LAMP反應(yīng)液(B液)的管2 (反應(yīng)管)的取出，加入I μ L Bst DNA聚合酶，混勻；
步驟3.依次向反應(yīng)管中分別加入I UL N液(陰性對(duì)照)、待檢樣品和P液(陽(yáng)性對(duì)照)，蓋緊管蓋并做好相應(yīng)標(biāo)記；
步驟4.在55或57或60或63或65 °C攝氏度下恒溫反應(yīng)30或40或50分鐘均可。
[0036](3)結(jié)果判讀:兩種判定方法選其一則可。
[0037](3.1)顯色反應(yīng):取出管2 (LAMP反應(yīng)管),依次加入I μ L D液(顯色液)，蓋緊管蓋，混勻后肉眼直接觀察顏色變化或者用紫外燈觀察顏色變化。在正常日光條件下呈綠色的為陽(yáng)性反應(yīng)，橙紅色的為陰性反應(yīng)。在紫外燈下發(fā)出強(qiáng)烈綠色熒光的為陽(yáng)性反應(yīng)，不能發(fā)出熒光的為陰性反應(yīng)。
[0038](3.2)電泳檢測(cè):從管2 (LAMP反應(yīng)管)中取出2 μ L樣品直接點(diǎn)樣于0.8% (質(zhì)量體積比)的瓊脂糖凝膠中，80或90或100或110或120V電泳30或33或35或38或40分鐘后可在凝膠成像系統(tǒng)中觀察LAMP的梯狀條形帶。得到梯狀條形帶則判斷為陽(yáng)性，沒(méi)有條形帶則為陰性。
[0039]上述的一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP試劑盒在各種疑似受到豬鏈球菌2型污染的生豬肉、豬內(nèi)臟、以及臘肉、熏肉、灌腸等各種豬肉制品中檢測(cè)，其他疑似被污染的食品都可以通過(guò)該方法進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)的是病原。
[0040]上述的一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP試劑盒在疑似被豬鏈球菌2型感染的豬和人可以檢測(cè)，檢測(cè)的是病原。
【權(quán)利要求】
1.一種豬鏈球菌2型的LAMP檢測(cè)試劑盒，該試劑盒由豬鏈球菌前處理液和LAMP反應(yīng)試劑組成，其特征在于:包括引物組SS21-FIP的核酸序列SEQ ID N0.1所示、SS21-BIP引物的核酸序列SEQ ID N0.2所示、SS21-F3引物的核酸序列SEQ ID N0.3所示、SS21-B3引物的核酸序列SEQ ID N0.3所示、SS21-F3引物的核酸序列SEQ ID N0.4所示、SS21-LF引物的核酸序列SEQ ID N0.5所示、SS21-LB引物的核酸序列SEQ ID N0.6所示； 所述的試劑盒還包括以下組分: (1)前處理液:20mM Tris-HCl ； (2)LAMP 反應(yīng)液:20 mM Tris-HClUOmM (NH4)2S04、1mM KCl、2mM MgS04、10yMdNTPs、20 μ mol/L SS21-FIP、20 μ mol/L SS21-BIP、10 μ mol/L SS21-F3U0 μ mol/LSS21-B3、10ymol/L SS21-LF and 10 μ mol/L SS21-LB ； (3)聚合酶:3個(gè)酶活單位的BstDNA聚合酶； (4)顯色液:含有10%體積比SYBRGreen I的熒光染料； (5)陽(yáng)性對(duì)照樣品為豬鏈球菌2型的基因組，陰性對(duì)照為無(wú)菌去離子水。
2.權(quán)利要求1所述的一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒在食品病原檢測(cè)中的應(yīng)用； 所述的食品為疑似受到豬鏈球菌2型污染的生豬肉、豬內(nèi)臟、以及臘肉、熏肉、灌腸豬肉各種豬肉制品。
3.權(quán)利要求1所述的一種豬鏈球菌2型的SS2-LAMP檢測(cè)試劑盒在動(dòng)物疫病檢測(cè)中的應(yīng)用； 所述的動(dòng)物為疑似受到豬鏈球菌2型感染的豬和人。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404132SQ201410543156
【公開(kāi)日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月14日
【發(fā)明者】李錦銓, 周洋, 王小紅, 陳福生, 鄧柳燕 申請(qǐng)人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)