肥胖基因檢測(cè)試劑盒的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供了肥胖基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，試劑包括：(1)針對(duì)8個(gè)基因SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組；(2)PCR擴(kuò)增試劑；(3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。本發(fā)明通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)使多個(gè)PCR擴(kuò)增反應(yīng)可在同一臺(tái)PCR儀上同步進(jìn)行，對(duì)受測(cè)者的相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高效性、特異性，分析得到導(dǎo)致其肥胖的遺傳因素，根據(jù)基因分型結(jié)果得到基因?qū)w重BMI值的影響，計(jì)算目標(biāo)體重區(qū)間，從而為受測(cè)者獲得一個(gè)合適的減肥方案，采取相應(yīng)的策略避免對(duì)其無(wú)效甚至是有害的方法。
【專利說(shuō)明】肥胖基因檢測(cè)試劑盒

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因檢測(cè)，具體涉及肥胖基因檢測(cè)試劑盒。

【背景技術(shù)】
[0002] 超重和肥胖是全球引起死亡的第五大風(fēng)險(xiǎn)，肥胖與許多疾病相關(guān)聯(lián)，典型的如糖 尿病，冠心病，動(dòng)脈硬化等等。同時(shí)肥胖還帶來(lái)了種種心理問題和社會(huì)歧視。全球有11億超 重人群，中國(guó)的肥胖人群也在不斷激增，統(tǒng)計(jì)表明現(xiàn)今中國(guó)有至少3億肥胖患者。人類肥胖 是基因與環(huán)境共同作用的結(jié)果。缺乏運(yùn)動(dòng)和過(guò)度飲食是導(dǎo)致肥胖的主要外在因素。然而內(nèi) 在的基因因素也在很大程度上決定了一個(gè)人的肥胖程度，以及飲食和運(yùn)動(dòng)對(duì)肥胖的影響。
[0003] 目前大部分減肥方案的制定未考慮并重視基因信息的作用，無(wú)法分析得到導(dǎo)致其 肥胖的遺傳因素，從而難以得到合適的減肥方案，可能對(duì)肥胖者無(wú)效甚至有害健康，目前對(duì) 檢測(cè)肥胖基因試劑盒的研宄，由于引物設(shè)計(jì)的不足，難以達(dá)到檢測(cè)的高效性、特異性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004] 有鑒于此，本發(fā)明提供了一種肥胖基因檢測(cè)試劑盒，該試劑盒對(duì)受測(cè)者的相關(guān)基 因進(jìn)行檢測(cè)，分析得到導(dǎo)致其肥胖的遺傳因素，且PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一臺(tái)PCR儀上同步進(jìn)行 并具備檢測(cè)的高效性、特異性。
[0005] 一種肥胖基因檢測(cè)試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，存放的試劑包 括：
[0006] (1)針對(duì)8個(gè)基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組：
[0007] 針對(duì)FAM2基因 SNP rs7138803的引物組：
[0008] 5, -GAATTCCACAAGA-3'
[0009] 5, -ACAGCAGGGTGAC-3，
[0010] 5, -TGTGCGTGCACGC-3，
[0011] 5 ' -CTGGGCAACAAG-3 '
[0012] 針對(duì)FTO基因 SNP rs9939609的引物組：
[0013] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0014] 5' -CAAGTGCATCACA-3'
[0015] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0016] 5, -ATAGTTTCGATC-3'
[0017] 針對(duì)FTO基因 SNP rs3751812的引物組：
[0018] 5' -GTGAGCTGTCAAG-3'
[0019] 5' -CTCCCTGCCAACTA-3'
[0020] 5' -TCCTTAAAGATTC-3'
[0021] 5' -ACATTGAAACAGC-3'
[0022] 針對(duì)MC4R基因 SNP rsl0871777的引物組：
[0023] 5' -GTGTTTTACACAA-3'
[0024] 5' -CACACATGACAC-3'
[0025] 5' -GTGTTTTACACA-3'
[0026] 5' -TGTATATTGAAA-3'
[0027] 針對(duì) GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物組：5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0028] 5' -GCATTGCCTCTA-3'
[0029] 5' -CCTCCGATTGCAG-3'
[0030] 5, -AGATGGTTTCC-3，
[0031] 針對(duì)SH2B1基因 SNP rs4788102的引物組：
[0032] 5' -GAGGACTTTTCAA-3'
[0033] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0034] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0035] 5, -ATCTCAAAAAT-3，
[0036] 針對(duì) MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物組：
[0037] 5, -CATTCCTAGGCACA-3'
[0038] 5, -ACCTCATGCAGC-3，
[0039] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0040] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0041] 針對(duì)NEGRI基因 SNP rs3101336的引物組：
[0042] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0043] 5, -ACTGAACTTAGC-3'
[0044] 5, -CGAATTTAAGTCTC-3，
[0045] 5, -TCTAGTACAAGC-3' ；
[0046] (2) PCR 擴(kuò)增試劑；
[0047] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0048] 本發(fā)明提供的肥胖基因檢測(cè)試劑盒的有益效果是：通過(guò)PCR引物的設(shè)計(jì)使多個(gè) PCR擴(kuò)增反應(yīng)在同一臺(tái)PCR儀上同步進(jìn)行，對(duì)受測(cè)者的相關(guān)基因進(jìn)行檢測(cè)，并實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高 效性、特異性，分析得到導(dǎo)致其肥胖的遺傳因素，計(jì)算得到目標(biāo)體重區(qū)間，從而為受測(cè)者獲 得一個(gè)合適的減肥方案，采取相應(yīng)的策略避免對(duì)其無(wú)效甚至是有害的方法。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0049] 圖1是反應(yīng)產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖。

【具體實(shí)施方式】
[0050] 肥胖基因檢測(cè)試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，存放的試劑包括：
[0051] (1)針對(duì)8個(gè)基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組：
[0052] 針對(duì)FAIM2基因 SNP rs7138803的引物組：
[0053] 5, -GAATTCCACAAGA-3'
[0054] 5' -ACAGCAGGGTGAC-3'
[0055] 5, -TGTGCGTGCACGC-3'
[0056] 5' -CTGGGCAACAAG-3'
[0057] 針對(duì)FTO基因 SNP rs9939609的引物組：
[0058] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0059] 5, -CAAGTGCATCACA-3'
[0060] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0061] 5' -ATAGTTTCGATC-3'
[0062] 針對(duì)FTO基因 SNP rs3751812的引物組：
[0063] 5' -GTGAGCTGTCAAG-3'
[0064] 5' -CTCCCTGCCAACTA-3'
[0065] 5' -TCCTTAAAGATTC-3'
[0066] 5, -ACATTGAAACAGC-3，
[0067] 針對(duì)MC4R基因 SNP rsl0871777的引物組：
[0068] 5' -GTGTTTTACACAA-3'
[0069] 5, -CACACATGACAC-3，
[0070] 5, -GTGTTTTACACA-3'
[0071] 5' -TGTATATTGAAA-3'
[0072] 針對(duì) GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物組：
[0073] 5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0074] 5, -GCATTGCCTCTA-3，
[0075] 5, -CCTCCGATTGCAG-3'
[0076] 5' -AGATGGTTTCC-3'
[0077] 針對(duì)SH2B1基因 SNP rs4788102的引物組：
[0078] 5, -GAGGACTTTTCAA-3'
[0079] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0080] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0081] 5' -ATCTCAAAAAT-3'
[0082] 針對(duì) MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物組：
[0083] 5, -CATTCCTAGGCACA-3'
[0084] 5, -ACCTCATGCAGC-3，
[0085] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0086] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0087] 針對(duì)NEGRI基因 SNP rs3101336的引物組：
[0088] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0089] 5, -ACTGAACTTAGC-3'
[0090] 5' -CGAATTTAAGTCTC-3'
[0091] 5, -TCTAGTACAAGC-3' ；
[0092] (2) PCR 擴(kuò)增試劑；
[0093] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
[0094] 下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明提供的方法予以進(jìn)一步的說(shuō)明。
[0095] 本實(shí)施例對(duì)肥胖者采用肥胖基因檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)8個(gè)基因的SNP多態(tài)位點(diǎn)， 并根據(jù)基因分型結(jié)果得到基因?qū)w重BMI值的影響，計(jì)算目標(biāo)體重區(qū)間，從而更加科學(xué)合 理的制定減肥目標(biāo)，采取更加合適的減肥方案。
[0096] 該肥胖者信息如下：性別男，身高180,體重97公斤，計(jì)算得BMI =體重/身高2 = 30,屬于肥胖人群。
[0097] 使用到的肥胖基因檢測(cè)試劑盒內(nèi)試劑由以下組成：
[0098] (1)針對(duì)8個(gè)基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組：
[0099] 針對(duì)FAIM2基因 SNP rs7138803的引物組：
[0100] 5' -GAATTCCACAAGA-3'
[0101] 5' -ACAGCAGGGTGAC-3'
[0102] 5' -TGTGCGTGCACGC-3'
[0103] 5, -CTGGGCAACAAG-3'
[0104] 針對(duì)FTO基因 SNP rs9939609的引物組：
[0105] 5' -GCTGTGAATTTA-3'
[0106] 5, -CAAGTGCATCACA-3'
[0107] 5' -TGTTGGAATATGAG-3'
[0108] 5' -ATAGTTTCGATC-3'
[0109] 針對(duì)FTO基因 SNP rs3751812的引物組：
[0110] 5，-GTGAGCTGTCAAG-3 '
[0111] 5 ' -CTCCCTGCCAACTA-3 '
[0112] 5 ' -TCCTTAAAGATTC-3 '
[0113] 5 ' -ACATTGAAACAGC-3 '
[0114] 針對(duì)MC4R基因 SNP rsl0871777的引物組：
[0115] 5 ' -GTGTTTTACACAA-3 '
[0116] 5 ' -CACACATGACAC-3 '
[0117] 5 ' -GTGTTTTACACA-3 '
[0118] 5 ' -TGTATATTGAAA-3 '
[0119] 針對(duì) GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 的引物組：
[0120] 5' -CCCAGTCATGGCA-3'
[0121] 5' -GCATTGCCTCTA-3'
[0122] 5' -CCTCCGATTGCAG-3'
[0123] 5' -AGATGGTTTCC-3'
[0124] 針對(duì)SH2B1基因 SNP rs4788102的引物組：
[0125] 5' -GAGGACTTTTCAA-3'
[0126] 5' -CCCAAGTAATC-3'
[0127] 5' -GATTTATCCGTC-3'
[0128] 5' -ATCTCAAAAAT-3'
[0129] 針對(duì) MTCH2 基因 SNP rs 10838738 的引物組：
[0130] 5' -CATTCCTAGGCACA-3'
[0131] 5' -ACCTCATGCAGC-3'
[0132] 5, -ATCTAGCCCCAAA-3'
[0133] 5' -TCAGATTTCGG-3'
[0134] 針對(duì)NEGRI基因 SNP rs3101336的引物組：
[0135] 5' -CAGACATCTATACA-3'
[0136] 5' -ACTGAACTTAGC-3'
[0137] 5' -CGAATTTAAGTCTC-3'
[0138] 5，-TCTAGTACAAGC-3，。
[0139] (2)?0?擴(kuò)增試劑：10\?0?緩沖液，該？0?緩沖液為10〇11111'1^8-!1(：4!18.3,50〇1111 KC1，15mM MgCl2;dNTPs混合物，該dNTPs混合物為三磷酸鳥嘌呤脫氧核苷酸dGTP，三磷酸 腺嘌呤脫氧核苷酸dATP，三磷酸胸腺嘧啶脫氧核苷酸dTTP，三磷酸胞嘧啶脫氧核苷酸dCTP 四種核苷酸，各組分濃度為2. 5mM ;5U/ μ 1熱啟動(dòng)Taq酶。
[0140] (3)瓊脂糖凝膠電泳分析試劑：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、Goldview染 色液和DNA上樣緩沖液，該緩沖液以溴酚藍(lán)為指示劑稀釋至IX后使用。
[0141] 使用上述肥胖基因檢測(cè)試劑盒按如下步驟進(jìn)行檢測(cè)：
[0142] (1)提取樣本基因組DNA。
[0143] 采集該肥胖者唾液，向l_2ml唾液樣品中加入500ul提取緩沖溶液，該DNA提取緩 沖溶液溶劑為50mM的Tris-HCl pH7. 4、0. 5mM的EDTA和50mM的NaCl，反復(fù)吹打混勻后， 8000 Xg離心5分鐘，棄去上清，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀中加入500ul裂解液，該裂解 液溶劑為 50mM Tris-HClpH7.4,50mM Tris-HCl ρΗ7· 4,150mM NaCl，ImM EDTA，1% Triton x_100，l% Sodium deoxycholate，0. 1% SDS，蛋白酶 K20mg/mL，徹底懸浮沉淀并充分混勾 后，室溫放置30分鐘，期間來(lái)回顛倒離心管數(shù)次；得到的混合液中，加入濃度為lOmg/mLRNA 酶的水溶液10uL，37°C下靜置IOmin ;得到的上清液中，加入等體積苯酚-氯仿混合溶 液，苯酚和氯仿體積比為I : 1，充分混勻，混合液4°C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入 干凈離心管內(nèi)；加入等體積苯氛-氯仿-異戊醇混合溶液，苯酚、氯仿和異戊醇體積比為 25 : 24 : 1，充分混勻后，4°C，12000Xg離心5分鐘，上清液移入干凈離心管內(nèi)；加入等體 積氯仿-異戊醇混合溶液，充分混勻后，4°C，12000 X g離心5分鐘，上清液移入干凈離心管 內(nèi)；加入0. 6倍體積的冰浴異丙醇溶液及0. 1倍的3mol/L醋酸鈉溶液，-20°C靜置60分鐘 后，4°C，12000 Xg離心10分鐘，棄上清液；得到的沉淀物中加入0. 5mL 70 %乙醇清洗沉淀 物，4°C，12000Xg離心5分鐘，棄上清液，此步驟重復(fù)一次；得到的沉淀物自然風(fēng)干，加入 20 μ L無(wú)菌超純水回溶，電泳檢測(cè)，-20°c保存。
[0144] (2) PCR 擴(kuò)增。
[0145] 本實(shí)施例同時(shí)檢測(cè)？4頂2基因5咿^7138803、？1'0基因5咿^9939609、？1'0基因 SNP rs3751812、MC4R 基因 SNP rsl0871777、GNPDA2 基因 SNPrsl3130484、SH2B1 基因 SNP rs4788102、MTCH2 基因 SNP rsl0838738、NEGRl 基因 SNP rs3101336,每個(gè) SNP 的檢測(cè)需要 一對(duì)上下游引物、兩條多態(tài)引物共4條PCR引物，共需要32條引物。每個(gè)SNP的檢測(cè)需要 做兩管PCR擴(kuò)增，為防止出現(xiàn)假陽(yáng)性之類的反應(yīng)，衡量PCR是否成功，加設(shè)一管陰性對(duì)照組， 共做17管PCR，所述陰性對(duì)照組基因組模板及反應(yīng)體系是一樣的，但沒有引物存在。
[0146] 根據(jù)不同的檢測(cè)位點(diǎn)，用相應(yīng)的引物按如下比例分別配制PCR反應(yīng)體系： 2. 5yllOXPCR緩沖液，2μ1 dNTPs，0. 5μ1引物組，熱啟動(dòng)Taq酶0. 15μ1，基因組模板 80mg，添加超純水至總體積為25 μ 1。
[0147] 將裝有反應(yīng)溶液的Eppendorf試管放入ABI 9700 PCR儀中，設(shè)置反應(yīng)條件如下： 預(yù)變性95°0 31^11;熱循環(huán)94°0 3〇8,60°0 3〇8,72°0 3〇8,35個(gè)循環(huán)；延伸72°0 31^11。反應(yīng) 結(jié)束后，取出試管。
[0148] 由于17管PCR擴(kuò)增反應(yīng)是在同一臺(tái)PCR儀上同步進(jìn)行的，為了實(shí)現(xiàn)檢測(cè)的高效 性、特異性，要求32條PCR引物的Tm值相近，為此需要先進(jìn)行大量的DNA序列軟件分析來(lái) 設(shè)計(jì)PCR引物，并通過(guò)大量的實(shí)驗(yàn)來(lái)進(jìn)行Tm值的優(yōu)化并確定設(shè)計(jì)的合理性，本試劑盒各基 因 SNP多態(tài)性的檢測(cè)是既相對(duì)獨(dú)立又相互聯(lián)系的，不可分割。
[0149] (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)
[0150] 將擴(kuò)增后的產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖電泳檢測(cè)，過(guò)程如下3g瓊脂糖，加入IOOmL去離子水， 微波爐加熱lmin，冷卻到60°C時(shí)加入5 μ L Goldview染色液，制成3%的瓊脂糖凝膠。PCR 產(chǎn)物10 μ L與6ΧΤΒΕ緩沖液0. 8 μ L混合上樣，電壓100V電泳15min。紫外燈下讀取結(jié)果 并拍照，所得瓊脂糖電泳檢測(cè)圖如圖1所示。
[0151] 檢測(cè)得到8個(gè)基因分型分析結(jié)果如下：FAM2基因 SNP rs7138803分型結(jié)果為AA， FTO基因 SNP rs9939609分型結(jié)果為AA，F(xiàn)T0基因 SNPrs3751812分型結(jié)果為TT，MC4R基因 SNP rsl0871777 分型結(jié)果為 GG，GNPDA2 基因 SNP rsl3130484 分型結(jié)果為 TT，SH2B1 基因 SNP rs4788102 分型結(jié)果為 AA，MTCH2 基因 SNP rs 10838738 分型結(jié)果為 AG，NEGRl 基因 SNP rs3101336分型結(jié)果為CC。
[0152] 根據(jù)基因分型測(cè)試結(jié)果，計(jì)算該男子目標(biāo)體重區(qū)間，基因?qū)w重BMI的影響因子 如下表：
[0153]

【權(quán)利要求】
1.肥胖基因檢測(cè)試劑盒，包括盒體及盒體內(nèi)單獨(dú)存放的試劑，其特征在于：存放的試 劑包括： (1)針對(duì)8個(gè)基因 SNP多態(tài)位點(diǎn)的PCR反應(yīng)引物組： 針對(duì)FAM2基因 SNP rs7138803的引物組： 5' -GAATTCCACAAGA-3， 5' -ACAGCAGGGTGAC-3' 5' -TGTGCGTGCACGC-3' 5' -CTGGGCAACAAG-3， 針對(duì)FTO基因 SNP rs9939609的引物組： 5' -GCTGTGAATTTA-3' 5' -CAAGTGCATCACA-3' 5' -TGTTGGAATATGAG-3' 5' -ATAGTTTCGATC-3' 針對(duì)FTO基因 SNP rs3751812的引物組： 5' -GTGAGCTGTCAAG-3' 5' -CTCCCTGCCAACTA-3' 5' -TCCTTAAAGATTC-3' 5' -ACATTGAAACAGC-3' 針對(duì)MC4R基因 SNP rsl0871777的引物組： 5' -GTGTTTTACACAA-3' 5' -CACACATGACAC-3' 5' -GTGTTTTACACA-3' 5' -TGTATATTGAAA-3' 針對(duì)GNPDA2基因 SNP rsl3130484的引物組： 5' -CCCAGTCATGGCA-3' 5' -GCATTGCCTCTA-3' 5' -CCTCCGATTGCAG-3' 5' -AGATGGTTTCC-3' 針對(duì)SH2B1基因 SNP rs4788102的引物組： 5' -GAGGACTTTTCAA-3， 5' -CCCAAGTAATC-3' 5' -GATTTATCCGTC-3' 5' -ATCTCAAAAAT-3' 針對(duì)MTCH2基因 SNP rs 10838738的引物組： 5' -CATTCCTAGGCACA-3' 5' -ACCTCATGCAGC-3' 5' -ATCTAGCCCCAAA-3' 5' -TCAGATTTCGG-3' 針對(duì)NEGR1基因 SNP rs3101336的引物組： 5' -CAGACATCTATACA-3' 5' -ACTGAACTTAGC-3' 5' -CGAATTTAAGTCTC-3' 5' -TCTAGTACAAGC-3' ； (2) PCR擴(kuò)增試劑； (3) 瓊脂糖凝膠電泳分析試劑。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述引物用量均為 0. 5~1, 0 u 1 〇
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增試劑包括： 10XPCR緩沖液，dNTPs，熱啟動(dòng)Taq酶，基因組模板。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述PCR緩沖液包含： 100mM Tris-HCl pH8.3,500mM KCl，15mM MgCl2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述PCR擴(kuò)增試劑用量 為：10XPCR 緩沖液 2. 5y 1，dNTPs2y 1，熱啟動(dòng) Taq 酶 0? 1-0. 2y 1，基因組模板 50-100ng。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述瓊脂糖凝膠電泳分 析試劑包括：瓊脂糖、TAE緩沖液、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)、DNA無(wú)毒染料和DNA上樣緩沖液。
7. 根據(jù)權(quán)利要求6所述的肥胖基因檢測(cè)試劑盒，其特征在于：所述DNA無(wú)毒染料優(yōu)選 Biotium Gelred 無(wú)毒染料。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104480195SQ201410549229
【公開日】2015年4月1日 申請(qǐng)日期:2014年10月16日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月16日
【發(fā)明者】李則軒, 朱軼凡, 張舒, 邱嘉銘, 別茜, 張靜靜 申請(qǐng)人:武漢白原科技有限公司