一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法。將高山被孢霉菌株經(jīng)過(guò)試管斜面培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基逐級(jí)放大培養(yǎng)，制備種子液，然后接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3個(gè)階段；轉(zhuǎn)速初始設(shè)定為0rpm，溶氧初始設(shè)定在100%，在發(fā)酵前期，使得溶氧下降后穩(wěn)定在40%-70%；在發(fā)酵中期，將溶氧控制在20%-40%；在發(fā)酵后期，將溶氧控制在40%-70%。發(fā)酵結(jié)束可使高山被孢霉細(xì)胞干重、油脂含量、花生四烯酸占總油脂的百分含量、花生四烯酸的單位產(chǎn)量分別可以達(dá)到55g/L、54%、65%，20.628g/L，花生四烯酸生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2.292g/(L*d)。
【專利說(shuō)明】一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方 法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，屬于微 生物發(fā)酵【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] 自從20世紀(jì)90年代以來(lái)，人們對(duì)健康飲食和營(yíng)養(yǎng)搭配越來(lái)越重視，長(zhǎng)鏈多不飽和 脂肪酸逐漸進(jìn)入人們的視線。長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸主要包括花生四烯酸（ARA)、二十二碳六 烯酸（DHA)和二十碳五烯酸（EPA)。這些脂肪酸不僅僅在組成膜磷脂結(jié)構(gòu)成份中起了重要 作用，而且可以作為合成信號(hào)分子類二十烷酸(包括前列腺素、凝血惡烷和白三烯等）的前 體物質(zhì)，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥和化妝品，尤其是嬰幼兒食品和營(yíng)養(yǎng)品領(lǐng)域。
[0003]目前，微生物發(fā)酵法生產(chǎn)花生四烯酸油脂的工藝已經(jīng)進(jìn)入工業(yè)生產(chǎn)階段。但是，發(fā) 酵法生產(chǎn)也面臨了諸多問(wèn)題，例如發(fā)酵法周期長(zhǎng)、葡萄糖轉(zhuǎn)化率低、細(xì)胞生物量低、油脂含 量低、飽和以及單不飽和脂肪酸含量過(guò)高，尤其是發(fā)酵過(guò)程中菌體形態(tài)難以控制等。
[0004] 傳統(tǒng)生產(chǎn)中使用的發(fā)酵罐主要包括機(jī)械攪拌式和氣升式等。機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐使 用功率高，能耗大，同時(shí)槳葉剪切力較大，對(duì)菌體形態(tài)有很大影響，很容易將菌體打碎，呈碎 羽毛狀。另一方面，氣升式發(fā)酵罐以鼓進(jìn)無(wú)菌空氣為推動(dòng)力，將發(fā)酵液進(jìn)行翻滾，沒(méi)有剪切 力，但是發(fā)酵后期菌體生物量長(zhǎng)到一定程度，發(fā)酵液密度大，粘度高，氣體的推動(dòng)對(duì)發(fā)酵液 翻騰混合的影響程度顯著減弱，溶氧不易控制，菌體形態(tài)同樣不易控制。然而，菌體形態(tài)對(duì) 菌體生物量、油脂含量和花生四烯酸百分含量等指標(biāo)有著直接的影響。
[0005]目前高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的普遍水平為：周期10-16天，生物量 22-37g/L，花生四烯酸占總油脂含量的33-60%。其中已報(bào)道的花生四烯酸含量最高的一組 實(shí)驗(yàn)周期12. 1天、生物量38. 3g/L、含油量26. 4g/L、花生四烯酸占總油脂的含量達(dá)到75%。 然而，花生四烯酸的生產(chǎn)強(qiáng)度基本在0. 3-1. 45gAL*d)，花生四烯酸凈含量報(bào)道的最高值也 僅僅為18g/L。鑒于發(fā)酵周期長(zhǎng)、容易引起染菌、生產(chǎn)強(qiáng)度仍然處于較低水平等問(wèn)題，有進(jìn) 一步提升的空間。此外，目前報(bào)道的花生四烯酸凈含量較高的實(shí)驗(yàn)基本都是在250mL搖瓶、 1L、5L、20L小發(fā)酵罐的水平上進(jìn)行的，很少有工業(yè)放大中應(yīng)用較好的實(shí)例報(bào)道。
[0006] 因此，鑒于現(xiàn)有的機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐和氣升式發(fā)酵罐對(duì)菌體形態(tài)影響的弊端，對(duì) 于高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂這樣周期長(zhǎng)、極好氧且發(fā)酵后期粘度顯著升高的發(fā)酵 體系，優(yōu)化合適的高密度發(fā)酵工藝條件，提供出一種能夠適合高山被孢霉菌體積累產(chǎn)花生 四烯酸油脂的新型工藝，提升菌體生物量和花生四烯酸油脂含量，提高花生四烯酸生產(chǎn)強(qiáng) 度，并且付諸于工業(yè)化大生產(chǎn)實(shí)為必要。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007] 鑒于現(xiàn)有技術(shù)的上述問(wèn)題，本發(fā)明的目的是提出一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā) 酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其通過(guò)以菌體形態(tài)為目標(biāo)，結(jié)合機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐和氣升式 發(fā)酵罐的優(yōu)點(diǎn)，通過(guò)對(duì)工藝的調(diào)控，提高了發(fā)酵產(chǎn)能。
[0008] 為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為： 一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，將高山被孢霉菌株經(jīng)過(guò) 試管斜面和搖瓶逐級(jí)放大培養(yǎng)，制備種子液，然后接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，在發(fā)酵過(guò) 程中，以控制高山被孢霉發(fā)酵形態(tài)為目標(biāo)，以發(fā)酵溶氧參數(shù)為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分階段 調(diào)控，將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期3個(gè)階段；在發(fā)酵前期，菌體生 物量增長(zhǎng)旺盛階段，轉(zhuǎn)速初始設(shè)定為Orpm，溶氧初始設(shè)定在100%，隨著菌體濃度增加，溶氧 會(huì)呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，通過(guò)每間隔4小時(shí)將轉(zhuǎn)速提高5rpm，直至50rpm止，使得溶氧下降后能夠 穩(wěn)定在40%-70% ;在發(fā)酵中期，油脂積累階段，將溶氧控制在20%-40% ;在發(fā)酵后期，花生四 烯酸生物合成階段，將溶氧控制在40%-70%。
[0009] 所述發(fā)酵前期為發(fā)酵的0-72小時(shí)期間。
[0010]所述發(fā)酵前期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-3WM(WM:單 位體積單位分鐘內(nèi)通入的氣量)，轉(zhuǎn)速控制在0-50轉(zhuǎn)/分鐘。
[0011]所述發(fā)酵中期為發(fā)酵的73-120小時(shí)期間。
[0012]所述發(fā)酵中期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在0. 5-1. 5WM，轉(zhuǎn) 速控制在50-200轉(zhuǎn)/分鐘。
[0013]所述發(fā)酵后期為發(fā)酵的121-216小時(shí)期間。
[0014]所述發(fā)酵后期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-3WM，轉(zhuǎn)速控 制在100-200轉(zhuǎn)/分鐘。
[0015]所述發(fā)酵前期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-2WM，轉(zhuǎn)速控 制在0-50轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在40%-55%之間。
[0016]所述發(fā)酵中期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在0. 8-1. 2VVM，轉(zhuǎn) 速控制在80-150轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在20%-35%之間。
[0017]所述發(fā)酵后期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在I. 5-2WM，轉(zhuǎn)速 控制在150-200轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在40%-50%。
[0018]本發(fā)明中所采用的高山被孢霉菌株為高山被孢霉菌株R807(CCTCCM2012118)本發(fā)明調(diào)控原理如下：將發(fā)酵步驟分為三個(gè)階段(生物量積累階段、油脂積累階段、花 生四烯酸生物合成階段)，并且針對(duì)不同的階段采用不同的調(diào)控工藝，在生物量積累階段， 種子液剛剛接進(jìn)發(fā)酵罐，菌體活力較低較脆弱，不耐剪切，采用氣升罐式的培養(yǎng)方式，高溶 氧低剪切，利于高山被孢霉細(xì)胞數(shù)量的積累。當(dāng)進(jìn)入油脂積累階段，生物量達(dá)到一定程度， 單一的通氣方式不足以給發(fā)酵液形成翻騰的效果，配合適宜的攪拌轉(zhuǎn)速，對(duì)發(fā)酵液的氣液 混合效果有很好的貢獻(xiàn)。在發(fā)酵后期花生四烯酸生物合成階段，適當(dāng)?shù)慕档娃D(zhuǎn)速并且提高 風(fēng)量，有利于Λ9去飽和酶、Λ12去飽和酶、Λ6去飽和酶和Λ5去飽和酶發(fā)揮作用，使得花 生四烯酸的百分含量上升。
[0019]本發(fā)明的有益效果： (1)針對(duì)菌體前期較脆弱，后期密度過(guò)大等問(wèn)題，結(jié)合氣升罐溶氧較好和機(jī)械攪拌罐槳 葉可以提供剪切等優(yōu)點(diǎn)。通過(guò)對(duì)工藝的調(diào)控，提高了發(fā)酵產(chǎn)能，在7. 5L罐中花生四烯酸的 單位產(chǎn)量達(dá)到20. 628g/L發(fā)酵液，花生四烯酸的生產(chǎn)強(qiáng)度達(dá)到2. 291gAL*d)。
[0020] (2)本發(fā)明涉及的工藝操作簡(jiǎn)便，有利于工業(yè)化生產(chǎn)。目前已經(jīng)在7m3和25m3發(fā) 酵罐水平完成試運(yùn)行，并且得到很好的收益。

【具體實(shí)施方式】
[0021] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】，詳細(xì)描述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施方式僅用于說(shuō)明本發(fā) 明而不用于限制本發(fā)明的范圍。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明講授的內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù) 人員可以對(duì)本發(fā)明作各種改動(dòng)或修改，這些等價(jià)形式同樣落于本申請(qǐng)所附權(quán)利要求書(shū)所限 定的范圍。
[0022] 以下實(shí)施例中所采用的培養(yǎng)基如下： 試管斜面培養(yǎng)基（PDA斜面培養(yǎng)基):新鮮去皮馬鈴薯200g，煮沸后計(jì)時(shí)30min，4層紗布 過(guò)濾除去固形物，加葡萄糖20g，瓊脂20g，用蒸餾水定容至1L，pH自然，121°C滅菌30min。
[0023] 種子培養(yǎng)基：葡萄糖30g/L，酵母膏6g/L，KH2P04 3g/L，pH自然，121°C滅菌30min。
[0024]發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 80g/L，酵母膏l(xiāng)lg/L，KH2PO4 3. 8g/L，NaNO3 3. 4g/L， MgSO4 · 7H20 0· 5g/L，pH自然，121°C滅菌 30min。
[0025] 實(shí)施例中所用的菌株為：高山被孢霉菌株R807(CCTCCM2012118)，也可以使用 其他類似菌株。
[0026] 實(shí)施例1基于溶氧調(diào)控策略7. 5L罐高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂 1、菌種的活化以及種子液的制備：選取高山被孢霉菌株R807(CCTCCM2012118)為出 發(fā)菌株，將保藏的菌種接入PDA斜面培養(yǎng)基中，于25°C條件下在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)10天，轉(zhuǎn)接于 裝有IOOmL種子培養(yǎng)基的500mL凹槽瓶中于恒溫振蕩器中培養(yǎng)，接種量10%(v/v，10mL)，培 養(yǎng)條件是120rpm，溫度25°C，培養(yǎng)時(shí)間1-2天。
[0027] 2、將步驟1得到的種子液接種到7. 5L罐（NewBrunswickScientific,USA)中，裝 液量5L，接種量為10%(v/v，500mL)，培養(yǎng)溫度0-120h控制在28°C，121-216h控制在18°C， 發(fā)酵初始，種子液剛接進(jìn)發(fā)酵罐，有一段適應(yīng)期，初始風(fēng)量為2VVM，攪拌轉(zhuǎn)速初始為50轉(zhuǎn)/ 分鐘，溶氧初始設(shè)定100%，發(fā)酵的0-72小時(shí)期間，為發(fā)酵前期，菌體生物量增長(zhǎng)旺盛階段， 隨著菌體濃度的增加后，溶氧不斷下降，通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)控制溶氧下降后能夠穩(wěn)定 在40%-70%，風(fēng)量控制在1-2VVM，轉(zhuǎn)速初始設(shè)定為Orpm，每間隔4小時(shí)將轉(zhuǎn)速提高5rpm，直 至50rpm止；在發(fā)酵的73-120小時(shí)期間，為發(fā)酵中期，該階段為油脂積累階段，通過(guò)風(fēng)量和 轉(zhuǎn)速控制將溶氧控制在20%-40%，風(fēng)量控制在1-1. 5WM，轉(zhuǎn)速控制在150-200轉(zhuǎn)/分鐘；在 發(fā)酵的121-216小時(shí)期間，為發(fā)酵后期，該階段為花生四烯酸生物合成階段，將溶氧控制在 40%-70%，風(fēng)量控制在1-2VVM，轉(zhuǎn)速控制在150-200轉(zhuǎn)/分鐘。下表以不同階段分界點(diǎn)的控 制條件為例，見(jiàn)表1。
[0028]表1

【權(quán)利要求】
1. 一種基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，將高山被孢霉菌株經(jīng) 過(guò)試管斜面培養(yǎng)基和搖瓶培養(yǎng)基逐級(jí)放大培養(yǎng)，制備種子液，然后接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā) 酵培養(yǎng)，其特征在于：在發(fā)酵過(guò)程中，以控制高山被孢霉發(fā)酵形態(tài)為目標(biāo)，以發(fā)酵溶氧參數(shù) 為指標(biāo)，對(duì)發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行分階段調(diào)控，將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為發(fā)酵前期、發(fā)酵中期和發(fā)酵后期 3個(gè)階段；轉(zhuǎn)速初始設(shè)定為Orpm，溶氧初始設(shè)定在100%，隨著菌體濃度增加，溶氧會(huì)呈現(xiàn)下 降趨勢(shì)，通過(guò)先逐步提高轉(zhuǎn)速，并結(jié)合提高風(fēng)量的操作方法，在發(fā)酵前期，使得溶氧下降后 穩(wěn)定在40%-70% ;在發(fā)酵中期，將溶氧控制在20%-40% ;在發(fā)酵后期，將溶氧控制在40%-70%。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵前期為發(fā)酵的0-72小時(shí)期間。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵前期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-3WM，轉(zhuǎn)速 控制在0-50轉(zhuǎn)/分鐘。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵中期為發(fā)酵的73-120小時(shí)期間。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵中期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在0. 5-1. 5VVM， 轉(zhuǎn)速控制在50-200轉(zhuǎn)/分鐘。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵后期為發(fā)酵的121-216小時(shí)期間。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵后期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-3WM，轉(zhuǎn)速 控制在100-200轉(zhuǎn)/分鐘。
8. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵前期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1-2WM，轉(zhuǎn)速 控制在0-50轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在40%-55%之間。
9. 根據(jù)權(quán)利要求5所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法，其 特征在于：所述發(fā)酵中期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在0. 8-1. 2VVM， 轉(zhuǎn)速控制在80-150轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在20%-35%之間。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的基于溶氧調(diào)控高山被孢霉發(fā)酵產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法， 其特征在于：所述發(fā)酵后期溶氧控制通過(guò)風(fēng)量和轉(zhuǎn)速控制來(lái)實(shí)現(xiàn)，風(fēng)量控制在1. 5-2VVM， 轉(zhuǎn)速控制在150-200轉(zhuǎn)/分鐘，將溶氧控制在40%-50%。
【文檔編號(hào)】C12P7/64GK104278107SQ201410556081
【公開(kāi)日】2015年1月14日 申請(qǐng)日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】紀(jì)曉俊, 鄔文嘉, 張璦琿, 黃和 申請(qǐng)人:南京工業(yè)大學(xué)