一種用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法。在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中對能夠共表達3‐羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3‐酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組工程大腸桿菌進行發(fā)酵，重組工程大腸桿菌轉(zhuǎn)化葡萄糖獲得不飽和脂肪酸。本發(fā)明所述生產(chǎn)工藝條件溫和，不需要昂貴的催化劑，產(chǎn)物專一性好，避免了傳統(tǒng)的化學合成途徑中苛刻的反應(yīng)條件和副產(chǎn)物生成，是一種合成不飽和脂肪酸的綠色新工藝。
【專利說明】一種用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于基因工程領(lǐng)域，涉及一種用基因工程大腸桿菌生產(chǎn)不飽和脂肪酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002]不飽和脂肪酸是一種重要的保健品，不飽和脂肪酸具有調(diào)節(jié)血脂，清理血栓，調(diào)節(jié)免疫，維持視網(wǎng)膜提高視力，促進腦部發(fā)育等重要作用。
[0003]傳統(tǒng)的不飽和脂肪酸主要通過物理方法從魚油或者植物油中提取，植物油和魚油的產(chǎn)量限制了其成本的降低，不利于廣大人民群眾日常使用。上述瓶頸問題阻礙了不飽和脂肪酸合成的發(fā)展，因此尋找綠色合成木糖酸的途徑勢在必行。
[0004]生物轉(zhuǎn)化是以酶為催化劑來完成的化學反應(yīng)，反應(yīng)條件溫和，對環(huán)境友好；以可再生資源為底物的生物催化合成，是解決全球能源危機和糧食危機的有效途徑，近年來研究非常活躍，特別的，采用微生物催化葡萄糖生成不飽和脂肪酸已經(jīng)得到了較為廣泛深入的研究。
[0005]脂肪酸去飽和酶存在于幾乎所有生物中，是催化多不飽和脂肪酸生物合成的關(guān)鍵酶類。根據(jù)脂肪酸去飽和酶作用的底物不同可以分為3類:(1)可溶性的?；?ACP(?；d體蛋白)去飽和酶，能將與?；d體蛋白相結(jié)合的脂肪酸去飽和，在其烴鏈上引入雙鍵，存在于植物質(zhì)體的基質(zhì)中；(2)酰基-lipid去飽和酶是一類膜結(jié)合的酶，能將結(jié)合于甘油酯上的脂肪酸去飽和形成雙鍵，或在糖脂結(jié)合的脂肪酸烴鏈上引入雙鍵，存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、植物的葉綠體膜，一些桿菌的質(zhì)膜上；(3)?；?CoA去飽和酶，也是一種膜結(jié)合蛋白，能在與輔酶A結(jié)合的脂肪酸的烴鏈上引入雙鍵，存在于動物及真菌的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種生物法轉(zhuǎn)化葡萄糖生成不飽和脂肪酸的方法。
[0007]本發(fā)明的目的可通過如下技術(shù)方案實現(xiàn):
[0008]一種生物催化葡萄糖合成不飽和脂肪酸的方法，在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中對能夠共表達3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組工程大腸桿菌進行發(fā)酵，重組工程大腸桿菌轉(zhuǎn)化葡萄糖獲得不飽和脂肪酸。
[0009]其中，所述的重組工程大腸桿菌優(yōu)選將含有3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌所得；所述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21(DE3)。
[0010]所述的重組表達載體優(yōu)選以pET30a載體為出發(fā)載體，Xba I/Nde I酶切位點間插入3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位點間插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
[0011]所述的基因fabA優(yōu)選來源于大腸桿菌，Genbank登錄號為:ID6060334,或和fabA基因同源性超過70%的核酸序列，或來源于其它生物體，和fabA基因沒有明顯的同源性，但和fabA具有相同或相似功能的核酸序列；所述基因fabB優(yōu)選來源于大腸桿菌，Genbank登錄號為:ID6059208，或和fabB基因同源性超過70%的核酸序列，或來源于其它生物體，和fabB基因沒有明顯的同源性，但和fabB具有相同或相似功能的核酸序列。
[0012]所述的含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl,
0.5g/L NaCl,lmM MgSO4, 2%葡萄糖。所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30_37°C、攪拌速度400-800rpm、pH 6.5-7.5和溶氧20%以上的條件下培養(yǎng)至OD6tltl約為12-20，加入誘導劑IPTG至終濃度0.1-1.0mmol.L—1，兩小時后收集產(chǎn)物。
[0013]所述的方法還包含從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化不飽和脂肪酸。
[0014]按照本發(fā)明所述方法合成的不飽和脂肪酸。
[0015]一種用于生物發(fā)酵制備不飽和脂肪酸的重組大腸桿菌，是將含有3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌所得；所述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
[0016]所述的重組表達載體優(yōu)選以pET30a載體為出發(fā)載體，Xba I/Nde I酶切位點間插入3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位點間插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
[0017]本發(fā)明所述的重組大腸桿菌在制備不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
[0018]有益效果:
[0019]本發(fā)明中的重組菌株能夠高效的轉(zhuǎn)化廉價的葡萄糖生成不飽和脂肪酸，該轉(zhuǎn)化過程在溫和的條件下(30-37°C)即可以進行，能有效提高不飽和脂肪酸的產(chǎn)率，同時不需要貴金屬催化劑，有效的降低了生產(chǎn)成本，產(chǎn)物專一性好(附圖1)，避免了傳統(tǒng)的化學合成途徑中苛刻的反應(yīng)條件和副產(chǎn)物生成，是一種合成不飽和脂肪酸的綠色新工藝。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020]圖1脂肪酸酸生物合成代謝途徑
[0021 ] 圖2 3-羥基脂酰ACP脫水酶基因(fabA)和3_酮脂酰ACP合成酶(fabB)共表達載體示意圖
[0022]圖3工程菌合成不飽和脂肪酸的液相色譜法檢測
[0023]根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Retent1n time為13.4和14.2的峰為不飽和脂肪酸，液相結(jié)果顯示所占比例為33.4%。

【具體實施方式】
[0024]實施例1
[0025]3-羥基脂酰ACP脫水酶基因(fabA)和3_酮脂酰ACP合成酶(fabB)共表達載體的構(gòu)建，具體過程如下:
[0026]由南京金斯瑞公司全序列合成兩端基因，并克隆進pET30a載體。Xba I/Nde I酶切位點間插入3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位點間插入3-酮脂酰ACP合成酶基因fabB。本發(fā)明的載體構(gòu)建方法為本領(lǐng)域的常規(guī)方法。
[0027]實施例2
[0028]合成不飽和脂肪酸的工程大腸桿菌菌株的制備，并用該菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化葡萄糖生成不飽和脂肪酸，其具體過程如下:
[0029]采用堿裂解法提取實施例1中構(gòu)建得到的重組質(zhì)粒pA-fabAB，采用熱擊轉(zhuǎn)化法將10 μ I重組質(zhì)粒pA-fabAB轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21 (DE3)感受態(tài)細胞，然后取50 μ I轉(zhuǎn)化后的菌液涂布于含有34 μ g.mL-1氯霉素的LB平板上篩選陽性克隆，長出的菌落即為共表達3-羥基脂酰ACP脫水酶基因和3-酮脂酰ACP合成酶的重組大腸桿菌菌株。
[0030]挑取構(gòu)建好的重組大腸桿菌單菌落，接種至LB液體培養(yǎng)基，37°C、180rpm振蕩培養(yǎng)過夜，然后將菌液按體積比1%的接種量接種到添加34μ g 氯霉素的發(fā)酵培養(yǎng)基中進行發(fā)酵罐發(fā)酵，配方為 6g/L Na2HPO4, 3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl70.5g/L NaCl,lmM MgSO4,2%葡萄糖。在培養(yǎng)溫度30°C、攪拌速度400rpm、pH 6.5和溶氧20%以上的條件下培養(yǎng)至OD600約為12，加入誘導劑IPTG至終濃度0.1-1.0mmol.L—1，兩小時后收集產(chǎn)物。
[0031]結(jié)果見圖3,根據(jù)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，Retent1n time為13.4和14.2的峰為不飽和脂肪酸，也想結(jié)果顯示，這兩個峰對應(yīng)的不飽和脂肪酸所占產(chǎn)物質(zhì)量比例共計為33.4%。
【權(quán)利要求】
1.一種生物催化葡萄糖合成不飽和脂肪酸的方法，其特征在于在含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基中對能夠共表達3 -羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組工程大腸桿菌進行發(fā)酵，重組工程大腸桿菌轉(zhuǎn)化葡萄糖獲得不飽和脂肪酸。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的重組工程大腸桿菌是將含有3-羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌所得；所述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于所述的重組表達載體以pET30a載體為出發(fā)載體，Xba I/Nde I酶切位點間插入3 -羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位點間插入3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于所述的基因fabA選自來源于大腸桿菌，Genbank登錄號為:ID6060334的核酸序列，或和fabA基因同源性超過70%的核酸序列，或來源于其它生物體，和fabA基因沒有明顯的同源性，但和fabA具有相同或相似功能的核酸序列；所述基因fabB選自來源于大腸桿菌，Genbank登錄號為:ID 6059208的核酸序列，或和fabB基因同源性超過70 %的核酸序列，或來源于其它生物體，和fabB基因沒有明顯的同源性，但和fabB具有相同或相似功能的核酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的含有葡萄糖的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為6g/LNa2HP04，3g/L KH2PO4,1g/L NH4Cl70.5g/L NaCl，lmM MgSO4, 2%葡萄糖；所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為:培養(yǎng)溫度30 - 37°C、攪拌速度400 - 800rpm、pH 6.5 - 7.5和溶氧20%以上的條件下培養(yǎng)至OD600約為12 - 20，加入誘導劑IPTG至終濃度0.1 - 1.0mmol.L _ S兩小時后收集產(chǎn)物。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于所述的方法還包含從發(fā)酵產(chǎn)物中分離純化不飽和脂肪酸。
7.根據(jù)權(quán)利要求1?6中任一項所述方法合成的不飽和脂肪酸。
8.一種用于生物發(fā)酵制備不飽和脂肪酸的重組大腸桿菌，其特征在于所述的重組工程大腸桿菌是將含有3 -羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA和3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB的重組表達載體轉(zhuǎn)染大腸桿菌所得；所述的大腸桿菌優(yōu)選大腸桿菌BL21 (DE3)。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的重組大腸桿菌，其特征在于所述的重組表達載體以pET30a載體為出發(fā)載體，Xba I/Nde I酶切位點間插入3 -羥基脂酰ACP脫水酶基因fabA，Nco I/EcoR I酶切位點間插入3 -酮脂酰ACP合成酶基因fabB。
10.權(quán)利要求8或9所述的重組大腸桿菌在制備不飽和脂肪酸中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12P7/40GK104328145SQ201410558089
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月20日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月20日
【發(fā)明者】陳熹, 周榆, 饒兵, 朱瑞馳, 朱毅, 徐藝林, 榮慧, 秦榛, 章秋浩, 歐陽麗, 徐春暉, 楊展朝, 陳昱達, 朱琪璋, 趙奕玲, 溫玉琪 申請人:南京大學