一種利用pcr技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒dna的方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明根據(jù)需要獲得的模板質(zhì)粒DNA序列信息設(shè)計(jì)引物，上下游引物分別與質(zhì)粒DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)并且兩條引物的5’端20個(gè)堿基互補(bǔ)。利用這兩條引物對0.5μg模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可在體外快速獲得大量質(zhì)粒DNA。與傳統(tǒng)質(zhì)粒獲取方法相比，本發(fā)明不依賴宿主菌，應(yīng)用范圍廣；跳過了質(zhì)粒轉(zhuǎn)化、菌體培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等步驟，既節(jié)省了時(shí)間又節(jié)約了成本。
【專利說明】—種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，可用于提高體外獲得質(zhì)粒DNA的效率以及增加質(zhì)粒DNA的產(chǎn)量，屬于分子生物學(xué)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]質(zhì)粒是一種能夠獨(dú)立于染色體進(jìn)行自我復(fù)制的遺傳單位，絕大部分質(zhì)粒都是環(huán)形雙鏈DNA。從上世紀(jì)70年代開始，研究者開始在天然質(zhì)粒的基礎(chǔ)上開發(fā)出大量具有不同功能及特性的專用質(zhì)粒載體。目前，這些人工構(gòu)建的質(zhì)粒已經(jīng)成為基因工程中最常用、最核心也是最有效的工具之一。
[0003]有報(bào)道稱，僅2013年，以質(zhì)粒為核心的基因免疫及治療市場產(chǎn)值接近450億美元，并且這一市場還呈現(xiàn)不斷擴(kuò)大的趨勢，相應(yīng)對質(zhì)粒DNA的需求也不斷加大。
[0004]通常情況下，大量獲得某一質(zhì)粒主要依賴于將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌(一般為大腸桿菌)，并使其大量繁殖，對菌體進(jìn)行裂解以釋放質(zhì)粒并對其收集純化。具體步驟包括:質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌，菌體培養(yǎng)，質(zhì)粒提取純化等步驟。整個(gè)過程需要2-3天，周期較長。如果目標(biāo)質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒，提高質(zhì)粒產(chǎn)量往往需要通過擴(kuò)大菌體培養(yǎng)規(guī)模，延長培養(yǎng)時(shí)間等方法來實(shí)現(xiàn)，相應(yīng)的成本也將增加。
[0005]質(zhì)粒DNA導(dǎo)入宿主菌后，其復(fù)制會(huì)對宿主菌造成負(fù)擔(dān)。質(zhì)粒上某些基因的表達(dá)還可能對宿主菌具有毒害作用，這些情況都對于高效獲得大量質(zhì)粒DNA都會(huì)產(chǎn)生負(fù)面影響。
[0006]為了縮短周期，降低成本，勢必要尋求一種不依賴于宿主菌的獲得大量質(zhì)粒的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0007]本發(fā)明的目的是提供一種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，具有高效快速，節(jié)省成本，應(yīng)用范圍廣泛等優(yōu)點(diǎn)，能彌補(bǔ)傳統(tǒng)方法的不足，為快速獲得大量質(zhì)粒DNA提供新的途徑。
[0008]本發(fā)明采用的技術(shù)方案如下:
利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA，包括以下步驟:
1、根據(jù)需要獲得的模板質(zhì)粒DNA序列信息設(shè)計(jì)引物(上游引物，下游引物)，上下游引物分別與質(zhì)粒DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)并且兩條引物的5’端20個(gè)堿基互補(bǔ)；
2、利用步驟(I)中設(shè)計(jì)的引物對0.5 μ g模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；
3、對步驟2中獲得的產(chǎn)物取2μ L進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測產(chǎn)物濃度，并將剩余部分于-20 ° C保存?zhèn)溆茫?br> 上述PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟包括:
(I)PCR 反應(yīng)體系(50 μ L):5 X TransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5mM each) 5 μ L，上游引物(10 mM)2 μ L，下游引物(10 mM)2 μ L，模板質(zhì)粒DNA 0.5 μ g,TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,滅菌水補(bǔ)足至 50 μ L。
[0009](2)PCR 反應(yīng)程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 s，50 ° C 40 s，72 ° C I min，共25 循環(huán)；72。C 5 min。
[0010](3)瓊脂糖凝膠電泳檢測:稱取0.4 g瓊脂糖粉末，加入40 mL 0.5XTBE緩沖液中，微波加熱至瓊脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均勻，趁熱倒入制膠槽中，并插上梳板，室溫靜置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，將制備好的瓊脂糖凝膠放入盛有0.5 X TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應(yīng)沒過膠面，吸取2 μ?與上樣緩沖液混勻的PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔，在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAmarker),接通電源在5 V/cm條件下電泳30 min,電泳結(jié)束后,取出瓊脂糖凝膠,輕輕地置于紫外透射儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker)判斷擴(kuò)增條帶的濃度及大小，將剩余PCR產(chǎn)物于-20 ° C保存?zhèn)溆谩?br> [0011]本發(fā)明的顯著優(yōu)點(diǎn):本發(fā)明涉及的技術(shù)通過對少量模板質(zhì)粒DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可快速獲得大量質(zhì)粒DNA，與傳統(tǒng)方法相比具有以下顯著優(yōu)點(diǎn):
(I)周期短:利用PCR技術(shù)擴(kuò)增質(zhì)粒，只需要幾個(gè)小時(shí)即可獲得大量可直接用于后續(xù)操作的質(zhì)粒DNA，與傳統(tǒng)方法2-3天的周期相比，大大縮短了質(zhì)粒獲取的周期。
[0012](2)操作簡便:進(jìn)行一次PCR反應(yīng)即可獲得大量質(zhì)粒，省去了傳統(tǒng)方法質(zhì)粒轉(zhuǎn)化宿主菌、細(xì)菌培養(yǎng)、質(zhì)粒提取等大量工作，簡化了操作流程。
[0013](3)成本低廉:由于跳過了培養(yǎng)細(xì)菌的相關(guān)過程，節(jié)約了該過程中的藥品、儀器、人工等方面的消耗，節(jié)約了成本。
[0014](4)應(yīng)用范圍廣泛:利用本發(fā)明涉及的技術(shù)獲取質(zhì)粒DNA，無需宿主菌參與，對于依賴特殊宿主菌才可以進(jìn)行復(fù)制的質(zhì)粒同樣適用。
[0015](5)高產(chǎn)穩(wěn)定:通過提高PCR的循環(huán)數(shù)，可以使生成的質(zhì)粒DNA以指數(shù)形式增加，質(zhì)粒拷貝數(shù)的高低不會(huì)對產(chǎn)量造成影響。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0016]圖1是應(yīng)用本發(fā)明中方法擴(kuò)增得到的pSG76-CS質(zhì)粒與傳統(tǒng)方法獲得的pSG76_CS質(zhì)粒電泳對照圖。圖中M為TaKaRa DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為應(yīng)用本發(fā)明中方法獲得的PSG76-CS質(zhì)粒，2為傳統(tǒng)方法獲得的pSG76-CS質(zhì)粒。

【具體實(shí)施方式】
[0017]我們在科研過程中需要獲得大量pSG76_CS質(zhì)粒(Kolisnychenko V, PlunkettIII G, Herring CD, Feher T, Posfai J, Blattner FR, Posfai G.Engineering aReduced Escherichia coli Genome.Genome Research, 2002, 12: 640-647.)用于基因敲除，但該質(zhì)粒在細(xì)菌中的復(fù)制要求宿主菌提供PIR蛋白(一種PSG76-CS質(zhì)粒復(fù)制依賴的調(diào)節(jié)蛋白)，本實(shí)驗(yàn)室沒有保藏相關(guān)菌種，無法通過傳統(tǒng)方法獲得該質(zhì)粒。因此，我們通過本發(fā)明中涉及的方法對少量本實(shí)驗(yàn)室保藏的PSG76-CS質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，以獲得大量的PSG76-CS 質(zhì)粒。
[0018]具體過程為:
(I)引物設(shè)計(jì)
根據(jù)美國國立生物技術(shù)信息中心(NCBI)提供的質(zhì)粒PSG76-CS序列信息，設(shè)計(jì)特異性上下游引物(上游引物:5 ’ -ATGTAACGCACTGAGAAGCCCTTAGAGCCTCT-3 ’，下游引物:5 ’ -GGCTTCTCAGTGCGTTACATCCCTGGCTTGTT-3’)，上下游引物分別與質(zhì)粒DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)并且兩條引物的5’端20個(gè)堿基互補(bǔ)。
[0019](2)利用特異性引物對0.5 μ g pSG76-CS質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
[0020]PCR 反應(yīng)體系(50 μ L):5 X TransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5mM each) 5 μ L，上游引物(10 mM)2 μ L，下游引物(10 mM)2 μ L，pSG76_CS 質(zhì)粒 DNA 0.5μ g, TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,滅菌水補(bǔ)足至 50 μ L。
[0021]PCR 反應(yīng)程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 s，50 ° C 40 s，72 ° C I min，共 25循環(huán)；72。C 5 min。
[0022](3)瓊脂糖凝膠電泳檢測:稱取0.4 g瓊脂糖粉末，加入40 mL 0.5 X TBE緩沖液中，微波加熱至瓊脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均勻，趁熱倒入制膠槽中，并插上梳板，室溫靜置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，將制備好的瓊脂糖凝膠放入盛有0.5 X TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應(yīng)沒過膠面，吸取2 μ?與上樣緩沖液混勻的PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔，在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNAmarker),接通電源在5 V/cm條件下電泳30 min,電泳結(jié)束后,取出瓊脂糖凝膠,輕輕地置于紫外透射儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker)判斷擴(kuò)增條帶的濃度及大小，將剩余PCR產(chǎn)物于-20 ° C保存?zhèn)溆谩?br> [0023]如圖1所示，應(yīng)用本發(fā)明中方法擴(kuò)增得到的pSG76-CS質(zhì)粒與傳統(tǒng)方法獲得的PSG76-CS質(zhì)粒進(jìn)行電泳對照。圖中M為TaKaRa DL2000 DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)，I為應(yīng)用本發(fā)明中方法獲得的PSG76-CS質(zhì)粒，2為傳統(tǒng)方法獲得的pSG76-CS質(zhì)粒。通過比較I和2的在瓊脂糖凝膠中的相對位置可知，利用本發(fā)明中方法成功獲得了 PSG76-CS質(zhì)粒。在之后的實(shí)驗(yàn)中，利用本實(shí)施例中獲得的PSG76-CS質(zhì)粒進(jìn)行基因敲除，能順利完成敲除實(shí)驗(yàn)，這也說明了本實(shí)驗(yàn)中獲得的PSG76-CS質(zhì)?？梢哉Ｐ惺蛊渖细髟墓δ?。
[0024]以上列舉的只是本發(fā)明的具體實(shí)施例，本發(fā)明不僅限于以上實(shí)施例，更換作為PCR模板的質(zhì)?？梢垣@得不同種類的質(zhì)粒產(chǎn)物，并且這些質(zhì)粒的所有功能都被完整的保留。依據(jù)本發(fā)明的構(gòu)想對實(shí)施例進(jìn)行的各種有效變形，均應(yīng)認(rèn)為在本發(fā)明的保護(hù)范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，其特征在于: (I)、根據(jù)需要獲得的模板質(zhì)粒DNA序列信息設(shè)計(jì)引物(上游引物，下游引物)，上下游引物分別與質(zhì)粒DNA的兩條模板鏈互補(bǔ)并且兩條引物的5’端20個(gè)堿基互補(bǔ)； (2 )、利用步驟(I)中設(shè)計(jì)的引物對0.5 Ug模板質(zhì)粒進(jìn)行PCR擴(kuò)增； (3)、對步驟(2)中獲得的產(chǎn)物取2 μ L進(jìn)行瓊脂糖電泳，檢測產(chǎn)物濃度及條帶大小，并將剩余部分于-20 ° C保存?zhèn)溆谩?br> 2.根據(jù)權(quán)利要求1所述利用PCR技術(shù)快速獲得大量質(zhì)粒DNA的方法，其特征在于PCR擴(kuò)增反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳檢測步驟，包括:
(1)PCR 反應(yīng)體系(50 μ L):5XTransStart FastPfu buffer 10 μ L, dNTPs (2.5 mMeach) 5 μ L，上游引物(10 mM) 2 μ L，下游引物(10 mM) 2 μ L，模板質(zhì)粒 DNA 0.5 μ g,TransEco FastPfu DNA Polymerase I μ L,滅菌水補(bǔ)足至 50 μ L ； (2)PCR 反應(yīng)程序:95 ° C 2 min ；95 ° C 20 S，50 ° C 40 S，72 ° Cl min，共 25循環(huán)；72。C 5 min ； (3)瓊脂糖凝膠電泳檢測:稱取0.4g瓊脂糖粉末，加入40 mL 0.5XTBE緩沖液中，微波加熱至瓊脂糖完全溶解后加入2 μ? DNA染色液ΕΒ，混合均勻，趁熱倒入制膠槽中，并插上梳板，室溫靜置20 min以上，待完全凝固后垂直拔去梳板，將制備好的瓊脂糖凝膠放入盛有.0.5 X TBE緩沖液的電泳槽中，緩沖液應(yīng)沒過膠面，吸取2 μ?與上樣緩沖液混勻的PCR產(chǎn)物加入瓊脂糖凝膠的點(diǎn)樣孔，在其中一個(gè)點(diǎn)樣孔中加入DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker),接通電源在5 V/cm條件下電泳30 min，電泳結(jié)束后，取出瓊脂糖凝膠，輕輕地置于紫外透射儀上成像，根據(jù)DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)(DNA marker)判斷擴(kuò)增條帶的濃度及大小，將剩余PCR產(chǎn)物于-20 ° C保存?zhèn)溆谩?br> 【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104388420SQ201410560288
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月21日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月21日
【發(fā)明者】丁銳, 張立軍, 陳旭輝, 崔振海, 敖永華, 于金龍, 馬蓉, 曹松屹, 秦萍 申請人:沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)