一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑，屬于醫(yī)學生物【技術領域】。通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試者的Chr6:g.31446930位置多態(tài)性位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱炎的易感性。本發(fā)明的優(yōu)點是：首次闡述了Chr6:g.31446930位置多態(tài)性位點與強直性脊柱炎的相關性，提供了一種預測強直性脊柱炎易感性的方法，該方法可用于強直性脊柱炎的預防、輔助診斷和治療，還可以用于新藥研發(fā)。
【專利說明】一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑，更具體的說是通過測定與AS 相關Chr6:g. 31446930的多態(tài)性預測受試者對于強直性脊柱炎的易感性，該方法可用于疾 病的輔助診斷、治療和新藥開發(fā)，屬于生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002] 強直性脊柱炎（Ankylosing spondylitis, AS)是一種自身免疫性疾病，多發(fā)于 16-40歲的青壯年，男女患病比例約為4?10:1。病變常首先發(fā)生于骶髂關節(jié)，少數重癥患 者表現為整個脊柱強直。此外，部分患者伴有不同程度的髖關節(jié)、眼、肺、心血管、腎等脊柱 外病變。AS在白種人群中的發(fā)病率約為1 %?3 %，我國AS患病率約為0. 2-0. 6 %，其中 60%以上的患者伴有髖關節(jié)受累，致使20%以上AS患者殘疾，炎癥主要累及關節(jié)囊、肌腱 和韌帶的骨附著點，導致局部關節(jié)粘連強直，活動受限。臨床上至今尚缺乏可明顯緩解和控 制疾病發(fā)展的藥物。AS屬多基因疾病，具有明顯的遺傳傾向，雖然通常認為遺傳與免疫因素 在AS發(fā)病中起主導作用，但確切的病因與發(fā)病機制仍不清楚。
[0003] 目前進行AS遺傳病因研究，多采用SNP作為基因組標志的關聯分析方法，是有效 的，已得到證明。SNP是指染色體基因組水平上單個核苷酸變異引起的DNA序列多態(tài)性，在 人群中的頻率需>1 %，SNPs是雙等位基因標記，這種單堿基變化中有70. 1 %為同型堿基之 間的轉換：如G/A或T/C，29. 1%為發(fā)生在嘌呤和嘧啶之間的顛換。C(胞嘧啶）是人類基因 組中最易發(fā)生變化的位點，因為大多數是甲基化胞嘧啶，能夠自發(fā)脫氨基轉換為T(胸腺嘧 啶），SNP包含了已知多態(tài)性的80-90%，是最常見的遺傳變異。
[0004] 由于生存的選擇壓力導致SNP在單一基因和整個基因組中的分布呈不均勻性。 SNPs在基因非編碼區(qū)的數量是編碼區(qū)的4倍，總數可達3百萬個。SNP以其密度高（平均 每Ikb就有1個）、代表性強（位于基因內部的SNP可能直接影響蛋白質結構或表達水平）、 遺傳穩(wěn)定性好（同微衛(wèi)星多態(tài)性比較而言）、易于自動化分析（因 SNP在人群中多為雙等位 基因標記，可簡單以"+/ -或1/0"直接分型）等特點成為很好的遺傳標志。
[0005] 1973年，Brewerton等首先發(fā)現了與AS強相關的人類白細胞抗原-B27(HLA-B27)。 隨著研究的進展，與AS相關的其他易感基因如腫瘤壞死因子-α (TNF-α)、白介 素-I(IL-I)陸續(xù)被識別。
[0006] Chr6:g. 31446930位于6q21. 3。該位點定位于人類白細胞抗原III區(qū)域，與免疫 反應及自身性免疫疾病發(fā)生發(fā)展等密切相關。
[0007] Chr6:g. 31446930與AS相關聯的研究近些年尚無報道。


【發(fā)明內容】

[0008] 本發(fā)明的主要目的是提供一種預測強直性脊柱炎易感性的試劑。
[0009] 本發(fā)明的第二個目的是提供一種檢測強直性脊柱炎易感性基因的方法。
[0010] 為實現上述目的，本發(fā)明采用以下技術方案：
[0011] 一種檢測強直性脊柱炎易感性的核酸序列，具有序列表SEQ ID No. 1所示的堿基 序列，其Chr6:g. 31446930位置即是變異位點，以字母"M"（確認M = C或A)標示出。該核 酸序列為Chr6:g. 31446930附近部分序列。圖1為Chr6:g. 31446930多態(tài)性變異位點的示 意圖，附圖中包含有2個基因，Chr6:g. 31446930標在2個基因中間的相應位置。
[0012] 一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，通過提取宿主細胞的基因組DNA，測定受試 者的Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱炎的易感性： Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點的基因型為CC時，受試者的易感性最低；攜帶A等位基 因時，受試者的易感性升高。
[0013] 一組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，引物的核苷酸序列分別為序列表SEQ IDNo. 2和序列表SEQ ID No. 3所示，長度分別為25bp和25bp，而且可以特異性地擴增出包 含有SEQ ID No. 1所示序列中Chr6:g. 31446930位置的產物。
[0014] 本發(fā)明提供了一種檢測強直性脊柱炎易感性的診斷試劑盒，其中含有本發(fā)明特異 性擴增Chr6: g. 314469302位點的引物對和用于PCR擴增檢測的試劑盒的常規(guī)組件、試劑、 緩沖液等，本領域技術人員熟知這些常規(guī)組件和檢測方法。本發(fā)明試劑盒中的全部組分、含 量、來源和使用方法如下：
[0015] 一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，由以下試劑組成：
[0016] (1) 10 μ L 10XPCR 緩沖液；
[0017] (2) 2 μ L IOmMdNTP 混合液；
[0018] (3)2μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/y L ;
[0019] (4) 1 μ L Fl引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ;
[0020] (5) 1 μ L Rl引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ;
[0021] (6) 8 μ L 10 X LC-Green Plus 飽和熒光染料；
[0022] (7)2μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0. 5μ L組成，濃度為lOpmol/μ L，其中 低溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下游 引物R為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID NO. 6 所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參下游引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列；
[0023] (8) 64 μ L 純水。
[0024] 使用方法：
[0025] (I)PCR擴增：通過PCR擴增Chr6:g. 31446930附近的部分片段，制備混合液： 10 X PCR 反應緩沖液 1 μ L，10mM/LdNTP0· 2 μ L，TaqDNA 聚合酶 0· 2 μ L，10pM/L 上游引物 0· lyL，10pM/L下游引物0· lyL，10XLC-Green Plus飽和熒光染料0.8yL，寡核苷酸內參 0. 2 μ L(高、低溫寡核苷酸內參上、下游引物各0. 05 μ L)(序列見表1)，基因組DNAl μ L，加 純水至1(^1^。？〇?反應條件為951：預變性31^11，951：變性308,691：退火308,721：延伸 4s，總共45個循環(huán)，72°C總延伸2min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處 理：95°C 30s，25°C 2min，94°C 30s，24°C 2min。PCR 前于每一體系中加入 20μ L 的石蠟油， 以防止液體揮發(fā)。
[0026] (2)基因型判定：將PCR產物移入HRM專用96孔板內，在Light Scanner TMHR-I96 上進行HRM分析，用Light Scanner Call IT軟件對采集后的曲線進行分析，根據烙解曲線 的差異判定基因型。
[0027] Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點在制備診斷強直性脊柱炎的試劑中的用途。
[0028] Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點在制備治療強直性脊柱炎的藥物中的用途。
[0029] 本發(fā)明的測定方法測定了來源于人的基因組DNA，樣品來源無限制，如：體液 (血液、腹水及尿液等）、組織細胞（如肝組織）等。通過提取和純化這些樣品可制備基 因組DNA。調整基因組DNA的濃度，使其盡可能的一致。以基因組DNA為模板，可擴增 出含Chr6:g. 31446930突變位點的核酸片段，以獲取測定的大量樣本。這種通過擴增含 Chr6:g. 31446930變異點的DNA片段獲得的樣品，特別適于用作測定材料。
[0030] 在進行基因輔助診斷時，本發(fā)明優(yōu)先適用于測定根據Chr6:g. 31446930的突變類 型存在的輔助診斷試劑，輔助診斷試劑包括作為必要成分的特定試劑，其對應于用于測定 Chr6: g. 31446930突變類型的方法。按采用的測定方法來選擇適當的特定試劑，如DNA片段 和/或用于PCR擴增步驟的引物。
[0031] 本發(fā)明的優(yōu)點是：本發(fā)明首次闡明了 Chr6:g. 31446930多態(tài)性位點與AS的相關 性，提供了一種預測AS易感性的方法，該方法可用于AS的預防、輔助診斷和治療，還可以用 于新藥研發(fā)。
[0032] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發(fā)明作進一步敘述，以便公眾對
【發(fā)明內容】
有更 深入的了解，并非對本發(fā)明的限制，凡依照本發(fā)明公開內容所做的任何本領域的等同替換， 均屬于本發(fā)明的保護范圍。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0033] 圖1為Chr6:g. 31446930多態(tài)性變異位點的示意圖
[0034] 圖2為Chr6:g. 31446930位置經HRM方法的基因分型圖
[0035] 圖3為Chr6:g. 31446930位置的測序結果

【具體實施方式】
[0036] 用于下列實施例中表示試劑的英文縮寫如下：
[0037] 10XPCR 緩沖液：IOmM Tris-HCI(pH = 8. 3)，500mM 氯化鉀（KCl)，IOmM 氯化鎂 (MgCl2)，0· 01% (W/V)白明膠
[0038] dNTP :脫氧核苷三磷酸
[0039] EDTA :乙二胺四乙酸二鈉
[0040] TE : IOmM Tris-HCl (pH = 7. 5)，ImM EDTA (pH = 8. 0)
[0041] 實施例I :血液樣本收集和基因組DNA的提?。?br> [0042] - ·病例入選：
[0043] 按紐約1984年的修訂診斷標準入選病例，共選取來自寧夏地區(qū)無血緣關系的AS 患者278例（年齡：8-71歲，平均27歲），同地區(qū)的健康對照志愿者262例（年齡：18-21 歲，平均19歲）。所有受檢者均為漢族且簽署書面知情同意書，這項研究得到衛(wèi)生部北京醫(yī) 院，衛(wèi)生部老年醫(yī)學研究所倫理審核委員會的認可，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》：人 體醫(yī)學研究的倫理原則。
[0044] 二·根據下列方法，制備人基因組DNA。
[0045] 1.在已標號的I. 5mLEP管中加 ΙΟΟΟμ L紅細胞裂解液，后加入400μ LEDTA抗凝血 (抗凝血加入前顛倒混勻3-5次），顛倒混勻，室溫靜置10分鐘；
[0046] 2. 13000rpm離心30秒后，除去上清液；
[0047] 3.在所得沉淀中加480 μ L核酸裂解液，彈擊管壁，充分混勻后加入20 μ L蛋白酶 Κ(用裂核液稀釋20倍稀釋蛋白酶Κ)，顛倒混勻，65°C孵箱10分鐘，（期間不時上下混勻， 確保無凝塊）；
[0048] 4.拿出后降至室溫，加300μ L蛋白沉淀液，充分顛倒混勻，靜置10分鐘，13000rpm 離心2分鐘；
[0049] 5.將上清液移至新EP管中，加入670 μ L預冷的異丙醇，充分顛倒混勻（10次以 上），可見線狀DNA逐漸形成小團塊，13000rpm離心2分鐘；
[0050] 6.棄上清液并確保沉淀留在EP管中，加入670yL70%乙醇，上下顛倒混勻， 13000rpm離心2分鐘；
[0051] 7.棄上清，使管內乙醇揮發(fā)干凈；
[0052] 8.加入TE溶液（400 μ L)，充分溶解，對提取的基因組DNA進行濃度和純度的分 析，吸取部分DNA溶液作為工作液，濃度校正至20ng/ μ L，置于4°C備用，剩余基因組DNA 置-20°C冰箱保存。
[0053] 實施例2 : SNP的識別鑒定
[0054] 本發(fā)明采用PCR-高分辨率熔解曲線（HRM)分析法和PCR測序技術同時對 Chr6: g. 31446930位置（其等位位點為C/A)的基因型進行檢測。圖2為Chr6: g. 31446930 變異位點經HRM方法的基因分型圖、圖3為Chr6: g. 31446930變異位點的測序圖。
[0055] 一 · PCR-HRM引物的確定
[0056] 從 Genebank 中查取 Chr6: g. 31446930 位置附近的 DNA 喊基序列（SEQ ID No. 1)， 引物設計在01ig〇7. 0軟件下完成。目的片段定位在Chr6:g. 31446930附近，全長54bp，特 異性引物序列如下：
[0057] Fl :5' -TTTTTTGAAAAGGACCCTCTCCTGC-3'（SEQ ID No. 2)
[0058] Rl :5, -TTTTTGTTGTTCCCTCTGAGCCCCA-3'（SEQ ID No. 3)
[0059] 二· PCR反應體系及反應條件
[0060] 通過PCR擴增Chr6:g. 31446930附近片段，PCR反應體系為：10 X PCR反應緩沖液 1 μ L，10mM/LdNTP0· 2μ L，TaqDNA聚合酶0· 2μ L，ΙΟρΜ/L上游引物 0· 1 μ L，ΙΟρΜ/L下游引物 0. 1 μ L，10 X LC-Green Plus飽和熒光染料0. 8 μ L，寡核苷酸內參0. 2 μ L (高、低溫寡核苷 酸內參上、下游引物各0.05 μ L)(序列見表ISEQ ID No. 4-SEQID No. 7)，基因組DNAl μ L， 加去離子水至10 μ L。PCR時于每一體系中加入20 μ L石蠟油，防止液體揮發(fā)。PCR反應條 件為95°C預變性3min，95°C變性30s，64. 5°C退火30s，72°C延伸4s，總共45個循環(huán)，72°C總 延伸2min。在進行高分辨熔解曲線分析之前，進行變性和復性處理：95°C 30s，25°C 2min， 94°C 30s，24°C 2min。
[0061] 表I :高、低溫寡核苷酸內參引物序列、退火溫度及產物片段長度
[0062]

【權利要求】
1. 一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，其特征在于：通過提取宿主細胞的基因組 DNA，測定受試者的Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點的基因型，預測受試者對強直性脊柱 炎的易感性。
2. 根據權利要求1所述的一種檢測強直性脊柱炎易感性的方法，其特征在于：所述 Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點的基因型為CC時，受試者的易感性最低；攜帶A等位基 因時，受試者的易感性升高。
3. -組檢測強直性脊柱炎易感性的引物，其特征在于：引物的核苷酸序列分別為序列 表SEQ ID No. 2和序列表SEQ ID No. 3所示。
4. 一種檢測強直性脊柱炎易感基因的試劑盒，其特征在于由以下試劑組成： (1) 10yL 10XPCR 緩沖液； (2) 2 μ L lOmMdNTP 混合液； (3) 2 μ L TaqDNA 聚合酶，2unit/ μ L ; (4) 1 μ L F1引物，為SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ; (5) 1 μ L R1引物，為SEQ ID NO. 3所示的核苷酸序列，濃度為lOpmol/μ L ; (6) 8μ L lOXLC-Green Plus 飽和熒光染料； (7) 2 μ L寡核苷酸內參，由4種內參引物各0. 5 μ L組成，濃度為lOpmol/ μ L，其中低溫 寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID NO. 4所示的核苷酸序列，低溫寡核苷酸內參下游引物R 為SEQ ID NO. 5所示的核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參上游引物F為SEQ ID NO. 6所示的 核苷酸序列，高溫寡核苷酸內參下游引物R為SEQ ID NO. 7所示的核苷酸序列； (8) 64 μ L 純水。 5. Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點在制備診斷強直性脊柱炎的試劑中的用途。 6. Chr6:g. 31446930位置多態(tài)性位點在制備治療強直性脊柱炎的藥物中的用途。
【文檔編號】C12Q1/68GK104293969SQ201410575174
【公開日】2015年1月21日 申請日期:2014年10月24日 優(yōu)先權日:2014年10月24日
【發(fā)明者】楊澤, 張玉榮, 趙承孝, 劉銘, 王建業(yè), 史曉紅, 魏東, 楊帆, 朱小泉, 周林, 張耀光, 王娜娜, 惠娟, 趙帆, 張政, 唐雷, 孫亮 申請人:衛(wèi)生部北京醫(yī)院