蛋白質(zhì)表面重建的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白質(zhì)表面重建。聚集是蛋白質(zhì)不良表現(xiàn)的主要原因。本發(fā)明提供一種修飾蛋白質(zhì)以產(chǎn)生更穩(wěn)定的變異體的系統(tǒng)。所述方法包括鑒別蛋白質(zhì)表面上適合于突變?yōu)楦H水的殘基(例如，帶電氨基酸)的非保守疏水性氨基酸殘基。可改變表面上任何數(shù)目的殘基來產(chǎn)生更可溶、抗聚集、重折疊能力更高和/或在多種條件下更穩(wěn)定的變異體。本發(fā)明還提供本發(fā)明技術(shù)所產(chǎn)生的理論凈電荷增加的GFP、鏈霉親和素以及GST變異體。還提供用于對任何所關(guān)注蛋白質(zhì)進行所述修飾的試劑盒。
【專利說明】蛋白質(zhì)表面重建
[0001] 本申請是申請日為2007年6月1日、申請?zhí)枮?00780027139. 3、發(fā)明名稱為"蛋 白質(zhì)表面重建"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 相關(guān)申請案
[0003] 本申請案根據(jù)35U. S. C. § 119(e)主張2006年6月2日申請的美國臨時專利申請 案USSN 60/810,364的優(yōu)先權(quán)，其全部內(nèi)容以引用的方式并入本文中。
[0004] 政府支持
[0005] 本文中所述的研究部分得到美國國立衛(wèi)生研究院（National Institutes of Health)基金（GM065400)的支持。美國政府可具有本發(fā)明的某些權(quán)利。

【技術(shù)領(lǐng)域】 [0006]無

【背景技術(shù)】
[0007] 蛋白質(zhì)是細(xì)胞的主要組成成分。蛋白質(zhì)催化化學(xué)反應(yīng)，在生物系統(tǒng)中轉(zhuǎn)導(dǎo)信號，在 細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)中提供結(jié)構(gòu)元件，充當(dāng)信使等。蛋白質(zhì)不良表現(xiàn)的主要原因之一是聚集。 這不僅是實驗室中的問題，而且是諸如阿爾茨海默病（Alzheimer's disease)等許多疾病 的問題。在達(dá)到計算設(shè)計的蛋白質(zhì)時，聚集是尤其煩惱的問題。舉例來說，T0P7是具有新 穎折疊的計算設(shè)計的蛋白質(zhì)。T0P7的較長形式（延長的T0P7(T0P7extended))極易聚集。 T0P7ex主要表達(dá)為不可溶的聚集體。
[0008] 隨著更多蛋白質(zhì)被設(shè)計或修飾以用作研究生物系統(tǒng)的工具或隨著更多野生型或 修飾蛋白質(zhì)被用作治療劑，需要常規(guī)上將這些蛋白質(zhì)修飾為更穩(wěn)定和/或防止聚集的系 統(tǒng)。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 本發(fā)明提供一種修飾蛋白質(zhì)以使其更穩(wěn)定的系統(tǒng)。本發(fā)明的產(chǎn)生是基于對修飾蛋 白質(zhì)表面上的疏水性區(qū)域可提高蛋白質(zhì)的超熱力學(xué)性質(zhì)的認(rèn)識。本發(fā)明系統(tǒng)尤其適用于提 高所關(guān)注蛋白質(zhì)的溶解性，提高蛋白質(zhì)的抗聚集性，和/或提高蛋白質(zhì)的復(fù)性能力。所有這 些特性尤其適用于蛋白質(zhì)生產(chǎn)、蛋白質(zhì)純化以及使用蛋白質(zhì)作為治療劑和研究工具。
[0010] 在一方面，本發(fā)明提供一種改變蛋白質(zhì)的一級序列以增加寬范圍條件下蛋白質(zhì)的 抗聚集性、溶解性、重折疊能力和/或總體穩(wěn)定性的方法。修飾蛋白質(zhì)的活性優(yōu)選大致或 大體上與未修飾的蛋白質(zhì)相同。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)保留至少50%、75%、90%或 95%的野生型蛋白質(zhì)的活性。在一實施例中，所述方法包括以下步驟：(a)鑒別所關(guān)注蛋白 質(zhì)的表面殘基；(b)鑒別特定表面殘基在與所關(guān)注蛋白質(zhì)相關(guān)的其它蛋白質(zhì)中是非高度保 守的（即，確定哪些氨基酸對蛋白質(zhì)活性或功能來說不是不可缺少的）；(c)確定所鑒別的 非保守表面殘基的疏水性；以及（e)用在生理pH值下極性更高或帶電的氨基酸置換至少一 個或一個以上所鑒別的疏水性非保守殘基。各以上步驟均可以使用所屬領(lǐng)域中已知的任何 技術(shù)、計算機軟件、算法、范式等進行。產(chǎn)生修飾蛋白質(zhì)后，可測試其活性和/或所尋求的預(yù) 期性質(zhì)。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)更加穩(wěn)定。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)不易聚集。 本發(fā)明方法通常增加在生理PH值下蛋白質(zhì)的凈電荷（正或負(fù)）。
[0011] 在另一方面，本發(fā)明提供一種通過使蛋白質(zhì)"超帶電（supercharging) "來改變蛋 白質(zhì)的一級序列以增加寬范圍條件下蛋白質(zhì)的抗聚集性、溶解性、重折疊能力和/或總體 穩(wěn)定性的方法。也就是說，與野生型蛋白質(zhì)相比，修飾蛋白質(zhì)上總的凈電荷增加（正電荷或 負(fù)電荷）。修飾蛋白質(zhì)的活性優(yōu)選大致或大體上與未修飾的蛋白質(zhì)相同。在某些實施例中， 所述方法包括以下步驟：(a)鑒別所關(guān)注蛋白質(zhì)的表面殘基；(b)鑒別特定表面殘基在與所 關(guān)注蛋白質(zhì)相關(guān)的其它蛋白質(zhì)中是非高度保守的（即，確定哪些氨基酸對蛋白質(zhì)活性或功 能來說不是不可缺少的）；（c)確定所鑒別的非保守表面殘基的親水性；以及（e)用在生理 PH值下帶電的帶電氨基酸置換至少一個或一個以上所鑒別的帶電或極性、溶劑暴露非保守 殘基。在某些實施例中，為制備帶負(fù)電的"超帶電"蛋白質(zhì)，使所鑒別用于修飾的殘基突變 為天冬氨酸（Asp)或谷氨酸（Glu)殘基。在某些其它實施例中，為制備帶正電的"超帶電" 蛋白質(zhì)，使所鑒別用于修飾的殘基突變?yōu)橘嚢彼幔↙ys)或精氨酸（Arg)殘基。各以上步驟 都可以使用所屬領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)、計算機軟件、算法、范式等進行。產(chǎn)生修飾蛋白質(zhì) 后，可測試其活性和/或所尋求的預(yù)期性質(zhì)。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)（"超帶電蛋白 質(zhì)"）更加穩(wěn)定。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)不易聚集。本發(fā)明方法通常增加在生理PH 值下蛋白質(zhì)的凈電荷（正或負(fù)）。
[0012] 編入蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫（Protein Data Bank, F1DB)中的超過80%的蛋白質(zhì)的理論凈 電荷在± 10范圍內(nèi)。本發(fā)明所產(chǎn)生的修飾蛋白質(zhì)通常具有小于-10或大于+10的凈電荷。 在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)具有小于-20或大于+20的凈電荷。在某些實施例中，修飾蛋 白質(zhì)具有小于-30或大于+30的凈電荷。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)具有小于-40或大 于+40的凈電荷。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)具有小于-50或大于+50的凈電荷。修飾 蛋白質(zhì)能夠恰當(dāng)折疊并保留其生物活性。
[0013] 可使用本發(fā)明系統(tǒng)修飾任何蛋白質(zhì)，并且本發(fā)明系統(tǒng)所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)變異體以及 編碼變異蛋白質(zhì)的多核苷酸或載體和表達(dá)變異蛋白質(zhì)的細(xì)胞都視為本發(fā)明的一部分。已經(jīng) 使用本發(fā)明系統(tǒng)產(chǎn)生了數(shù)種新穎的綠色突光蛋白（green fluorescent protein，GFP)變異 體。這些變異體保留其熒光性；然而，其在寬范圍環(huán)境下比GFP的現(xiàn)有形式更穩(wěn)定。本發(fā)明 GFP即使經(jīng)過很長時間和在誘導(dǎo)聚集的環(huán)境中也不會聚集，并且即使通過煮沸變性后也能 夠重折疊為突光蛋白。也已經(jīng)使用本發(fā)明系統(tǒng)產(chǎn)生了新穎的鏈霉親和素（streptavidin) 和谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione-S_transferase，GST)變異體。這些變異體保留其生 物活性并且在加熱時仍可溶。本發(fā)明還包括編碼本發(fā)明GFP、鏈霉親和素以及GST蛋白序 列的多核苷酸序列；包括任何這些核苷酸序列的載體；以及包括這樣的多核苷酸序列或載 體或表達(dá)本發(fā)明變異體的細(xì)胞。在某些實施例中，本發(fā)明包括過度表達(dá)本發(fā)明變異體的細(xì) 菌或其它細(xì)胞。本發(fā)明變異體可用于所屬領(lǐng)域已知的多種生物測定中。舉例來說，超帶電 GFP可用于目前使用GFP作為報告蛋白的任何測定中。
[0014] 在另一方面，本發(fā)明提供已經(jīng)由本發(fā)明系統(tǒng)修飾的其它蛋白質(zhì)。這些修飾蛋白質(zhì) 優(yōu)選保留其顯著比例的初始活性。在某些實施例中，修飾蛋白質(zhì)保留至少99%、98%、95% 或90%的未修飾形式的活性。修飾蛋白質(zhì)在多種條件可更可溶，抗聚集，重折疊能力增加和 /或穩(wěn)定性更高。由本發(fā)明系統(tǒng)修飾的蛋白質(zhì)包括疏水性蛋白、重組蛋白、膜蛋白、結(jié)構(gòu)蛋 白、酶、細(xì)胞外蛋白、治療蛋白（例如，胰島素、細(xì)胞激素、免疫球蛋白、免疫球蛋白片段等）、 受體、細(xì)胞信號傳導(dǎo)蛋白、胞漿蛋白、核內(nèi)蛋白、轉(zhuǎn)錄因子等。在某些特定實施例中，蛋白質(zhì) 是用于人類或獸醫(yī)學(xué)的治療蛋白。在某些實施例中，蛋白質(zhì)是非天然蛋白質(zhì)，例如計算設(shè)計 的蛋白質(zhì)。在其它實施例中，蛋白質(zhì)是雜合蛋白、融合蛋白、變構(gòu)蛋白、突變蛋白、基因工程 蛋白或已經(jīng)通過人工改變的任何其它蛋白質(zhì)。
[0015] 還提供用于實施本發(fā)明的試劑盒。試劑盒可包括修飾所關(guān)注蛋白質(zhì)以使其更抗聚 集、增加其復(fù)性能力或增加其總體穩(wěn)定性所需的試劑。這些試劑盒可包括所有或部分以下 各物：多核苷酸、計算機軟件、核苷酸、引物、載體、細(xì)胞系、說明書、培養(yǎng)板、培養(yǎng)基、緩沖液、 酶、艾本德管（Eppendorf tube)、定點誘變試劑盒等。試劑盒優(yōu)選經(jīng)簡便包裝以供實驗室裝 置使用。研究員通常提供待使用本發(fā)明技術(shù)修飾的蛋白質(zhì)的DNA編碼序列。
[0016] 定義
[0017] "氨基酸"：術(shù)語"氨基酸"是指蛋白質(zhì)的基本結(jié)構(gòu)亞單元（subunit)。a-氨基酸 由氨基、羧基、氫原子以及側(cè)鏈（即，R基團）組成，均鍵結(jié)于中心碳原子。這個中心碳原子 因為與羧基相鄰而稱為a碳。存在二十種天然氨基酸，包括甘氨酸、丙氨酸、纈氨酸、亮氨 酸、異亮氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、半胱氨酸、蛋氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨 酸、組氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酸以及脯氨酸。疏水性氨基酸包括丙氨酸、纈 氨酸、亮氨酸、異亮氨酸以及苯丙氨酸。芳香族氨基酸包括苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸以及組 氨酸。極性氨基酸包括酪氨酸、半胱氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、賴氨酸、精氨酸、組氨酸、天冬氨 酸、谷氨酸、天冬酰胺以及谷氨酰胺。含硫氨基酸包括半胱氨酸和蛋氨酸。堿性氨基酸包括 賴氨酸、精氨酸以及組氨酸。酸性胺基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。也有蛋白質(zhì)中被插入非 天然氨基酸。在某些實施例中，當(dāng)使用術(shù)語"氨基酸"時是指二十種天然氨基酸。
[0018] "抗體":術(shù)語"抗體"是指天然或者完全或部分合成產(chǎn)生的免疫球蛋白。維持特異 性結(jié)合能力的所有其衍生物也包括在這一術(shù)語內(nèi)。這一術(shù)語也涵蓋具有與免疫球蛋白結(jié)合 域同源或者基本上同源的結(jié)合域的任何蛋白質(zhì)。這些蛋白質(zhì)可源自天然來源或者部分或完 全合成產(chǎn)生。抗體可為單克隆抗體或多克隆抗體?？贵w可為任何免疫球蛋白類別（包括人 類類別IgG、IgM、IgA、IgD以及IgE中的任一類別）的成員。
[0019] "保守":術(shù)語"保守"是指多核苷酸序列或氨基酸序列的相應(yīng)核苷酸或氨基酸殘基 在所比較的兩個或兩個以上相關(guān)序列的相同位置未發(fā)生變化。相對保守的核苷酸或氨基酸 是在相關(guān)序列中比序列中其它地方所出現(xiàn)的核苷酸或氨基酸保守的那些核苷酸或氨基酸。 [0020] "同源":如本文中所使用的術(shù)語"同源"是所屬領(lǐng)域通曉的術(shù)語，是指核酸或蛋白 質(zhì)在核苷酸或氨基酸序列層面高度相關(guān)。彼此同源的核酸或蛋白質(zhì)稱為同源物。同源可指 兩個序列（即，核苷酸序列或氨基酸）之間的序列相似性程度。本文中所提及的同源性％數(shù) 字反映兩個序列之間的最大可能同源性，即，比對兩個序列以具有最大數(shù)目的匹配（同源） 位置時的同源性％。同源性可由已知方法容易地加以計算，諸如以下文獻中所述的方法：計 算分子生物學(xué)（Computational Molecular Biology),萊斯克（Lesk, A.M.)編，牛津大學(xué) 出版社（Oxford University Press),紐約（New York), 1988;生物計算：信息學(xué)和基因組 計劃（Biocomputing: Informatics and Genome Projects),史密斯（Smith，D.W.)編，學(xué) 術(shù)出版社（Academic Press),紐約（New York), 1993 ;分子生物學(xué)中的序列分析（Sequence Analysis in Molecular Biology),凡?海耶（von Heinje，G.)，學(xué)術(shù)出版社（Academic Press)，1987 ;序列數(shù)據(jù)的計算機分析第 I 部分（Computer Analysis of Sequence Data，Part I)，格里菲因（Griffin，A.M.)和格里菲因（Griffin，H.G.)編，胡瑪納出版社 (Humana Press),新澤西州（New Jersey), 1994;和序列分析引物（Sequence Analysis Primer),吉布考夫（Gribskov，M.)和德夫萊克（Devereux，J.)編，米斯托克頓出版社（M Stockton Press),紐約（New York), 1991;各自以引用的方式并入本文中。測定序列之間 同源性的常用方法包括（但不限于）以下文獻中所揭示的方法：卡里羅（Carillo，H.)和里 皮曼（Lipman, D.)，SIAM 應(yīng)用數(shù)學(xué)（SIAM J Applied Math. ),48:1073(1988);其以引用的 方式并入本文中。測定同源性的技術(shù)被編成了公開可用的計算機程序。測定兩個序列之間 同源性的示范性計算機軟件包括（但不限于）GCG程序包（德夫萊克（De VereUX，J.)等人， 核酸研究（Nucleic Acids Research)，12 (1)，387 (1984) )、BLASTP、BLASTN 以及 FASTA (阿 特舒（Atschul，S.F.)等人，分子生物學(xué)雜志（J Molec. Biol. ),215,403 (1990))。
[0021] 術(shù)語"同源"必定指至少兩個序列（核苷酸序列或氨基酸序列）之間的比較。根據(jù) 本發(fā)明，如果兩個核苷酸序列所編碼的多肽有至少一段的至少20個氨基酸至少約50-60% 一致，優(yōu)選約70 %-致，那么將其視為同源。同源核苷酸序列的特征優(yōu)選還在于編碼一段至 少4-5個特別指定的氨基酸的能力。關(guān)于待考慮同源性的核苷酸序列，必須考慮這些氨基 酸彼此之間的一致性和大致間隔。對于長度小于60個核苷酸的核苷酸序列，由編碼一段至 少4-5個特別指定的氨基酸的能力確定同源性。
[0022] "肽"或"蛋白質(zhì)":根據(jù)本發(fā)明，"肽"或"蛋白質(zhì)"包含一串通過肽鍵連接在一起的 至少三個氨基酸。術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"肽"可互換使用。本發(fā)明的肽優(yōu)選僅含有天然氨基酸， 但也可使用所屬領(lǐng)域已知的非天然氨基酸（即，自然界中不存在但可并入多肽鏈中的化合 物）和/或氨基酸類似物。同時，可修飾本發(fā)明的肽中的一個或一個以上氨基酸，例如通過 添加碳水化合物基團、磷酸根基、法呢基（farnesyl)、異法呢基、脂肪酸基團、用于連接、官 能化或其它修飾（例如，a酰胺化）的連接基團等化學(xué)實體來修飾。在優(yōu)選實施例中，對 肽修飾產(chǎn)生更穩(wěn)定的肽（例如，活體內(nèi)半衰期更高）。這些修飾可包括使肽環(huán)化、并入D-氨 基酸等。這些修飾均不應(yīng)對肽的預(yù)期生物活性產(chǎn)生實質(zhì)性的干擾。在某些實施例中，對肽 修飾產(chǎn)生生物學(xué)活性更高的肽。
[0023] "多核苷酸"或"寡核苷酸"：多核苷酸或寡核苷酸是指核苷酸的聚合物。多核 苷酸通常包含至少三個核苷酸。聚合物可包括天然核苷（即，腺苷、胸苷、鳥苷、胞苷、尿 苷、脫氧腺苷、脫氧胸苷、脫氧鳥苷以及脫氧胞苷）、核苷類似物（例如，2-氨基腺苷、2-硫 代胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、C5-丙炔基胞苷、C5-丙炔基尿苷、C5-溴尿苷、 C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-甲基胞苷、7-脫氮腺苷（7-deazaadenosine)、7-脫氮鳥苷 (7-deazaguanosine)、8_ 氧代腺苷（8-oxoadenosine)、8_ 氧代鳥苷（8-oxoguanosine)、 0(6)-甲基鳥嘌呤以及2-硫代胞苷）、化學(xué)修飾堿基、生物修飾堿基（例如，甲基化堿基）、 插入堿基、修飾糖（例如，2'-氟核糖、核糖、2'-脫氧核糖、阿拉伯糖（arabinose)以及己 醣）和/或修飾磷酸根基（例如，硫代磷酸根基和5' -N-亞磷酰胺鍵聯(lián)）。
[0024] "小分子":如本文中所使用的術(shù)語"小分子"是指實驗室中制備或自然界中可見的 非肽、非寡聚有機化合物。如本文中所使用的小分子可指"天然產(chǎn)物樣"化合物，然而術(shù)語 "小分子"不限于"天然產(chǎn)物樣"化合物。更確切地說，小分子的特征通常在于其含有數(shù)個碳 碳鍵并且具有小于1500的分子量，但出于本發(fā)明的目的，這一特征不打算限制本發(fā)明。在 某些其它優(yōu)選實施例中，利用天然產(chǎn)物樣小分子。
[0025] "穩(wěn)定":如本文中所使用的術(shù)語"穩(wěn)定"提及蛋白質(zhì)時是指蛋白質(zhì)穩(wěn)定性的任何方 面。與初始野生型蛋白質(zhì)相比，穩(wěn)定的修飾蛋白質(zhì)具有一個或一個以上的以下特征：更可 溶、更抗聚集、更抗變性、更抗解折疊、更抗不適當(dāng)或不希望的折疊、復(fù)性能力更強、熱穩(wěn)定 性增加、在多種環(huán)境（例如，pH值、鹽濃度、存在洗滌劑、存在變性劑等）下穩(wěn)定性增加以及 非水性環(huán)境下穩(wěn)定性增加。在某些實施例中，穩(wěn)定的修飾蛋白質(zhì)顯示至少兩個上述特征。在 某些實施例中，穩(wěn)定的修飾蛋白質(zhì)顯示至少三個上述特征。這些特征可使活性蛋白質(zhì)在更 高水平下生產(chǎn)。舉例來說，可在比蛋白質(zhì)未修飾形式高的水平下過度表達(dá)修飾蛋白質(zhì)而無 聚集。這些特征也可使蛋白質(zhì)用作治療劑或研究工具。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0026] 圖1 :超帶電綠色熒光蛋白（GFP)。（a)GFP變異體的蛋白質(zhì)序列，形成熒光團 的殘基突出為綠色、帶負(fù)電殘基突出為紅色，而帶正電殘基突出為藍(lán)色；(b) SfGFP (左）、 GFP (+36)(中）以及GFP (-30)(右）的表面靜電勢，自-25kT/e (紅色）至+25kT/e (藍(lán)色） 著色。
[0027] 圖2 :GFP變異體的分子內(nèi)性質(zhì)。（a)純GFP變異體的染色和紫外熒光。各泳道和 試管含有0.2 Ug蛋白質(zhì)。（b)GFP變異體的圓二色性譜。（C)GFP變異體的熱力學(xué)穩(wěn)定性， 由胍鹽誘導(dǎo)的解折疊測量。
[0028] 圖3 :超帶電蛋白質(zhì)的分子間性質(zhì)。（a)純GFP變異體的紫外照射樣品（"天然")， 在100°C加熱1分鐘的樣品（"煮沸"）和隨后在25°C冷卻2小時的樣品（"冷卻")。（b)在 25°C下用40% TFE誘導(dǎo)GFP變異體聚集并通過直角光散射監(jiān)測。（c)超帶電GFP可逆地粘 附于帶相反電荷的大分子。樣品1 :于30 ill 25mM Tris (pH 7.0)和IOOmM NaCl中的6 iig GFP (+36)。樣品2 :向樣品1中添加6 ii g GFP (-30)。樣品3 :向樣品1中添加30 ii g鮭魚 精DNA。樣品4 :向樣品1中添加20 ii g大腸桿菌（E. coli) tRNA。樣品5 :向樣品4中添加 NaCl達(dá)1M。樣品6-8 :除使用sfGFP代替GFP (+36)外，分別與樣品1、2以及4相同。使所 有樣品在微型離心機中短暫旋轉(zhuǎn)并且在紫外光下觀察。（d)GST變異體的酶法測定。反應(yīng) 含有0. 5mg/mL GST變異體、20mM二硝基氯苯、20mM谷胱甘肽以及IOOmM磷酸鉀（pH 6. 5)。 在340nm下監(jiān)測產(chǎn)物的形成，得到反應(yīng)速率觀察值（Us)，野生型GST為emirT1，GST (-40)為 2. SmirT1而煮沸和冷卻后GST(-40)為0? toirT1。
[0029] 圖4 :GFP變異體的（a)激發(fā)光譜和（b)發(fā)射光譜。各樣品含有通過在490nm下發(fā) 色團吸光度所定量，等量的蛋白質(zhì)。
[0030] 圖5 :鏈霉親和素變異體的生物素結(jié)合活性，如先前所述（卡達(dá)（Kada)等人，利用 突光粹滅或突光偏振快速估算抗生物素蛋白和鏈霉親和素（Rapid estimation of avidin and streptavidin by fluorescence quenching or fluorescence polarization).生物 化學(xué)與生物物理學(xué)報（Biochim. Biophys. Acta) 1427, 44-48(1999)，其以引用的方式并入本 文中）通過監(jiān)測生物素-4-熒光素（英杰公司（Invitrogen))依賴性結(jié)合而測量。向0. 3 ii M 生物素 _4_ 突光素（B4F)、IOOmM NaCl、ImM EDTA、0. lmg/mL 牛血清白蛋白（bovine serum albumin BSA)、50mM憐酸鉀（pH 7.5)中滴定蛋白質(zhì)樣品。在470nm下激發(fā)的Perkin-Elmer LS50B熒光分光光度儀上測量526nm下的熒光猝滅。相對于含有600倍過量的無熒光生物 素的對照滴定，將測量結(jié)果歸一化。包括圖例下部的三個蛋白質(zhì)作為陰性對照。

【具體實施方式】
[0031] 本發(fā)明提供一種修飾蛋白質(zhì)以使其更加穩(wěn)定的系統(tǒng)。所述系統(tǒng)通過將蛋白質(zhì)表面 上的非保守氨基酸變成極性更大或帶電的氨基酸殘基來運行。待修飾的氨基酸殘基可以呈 疏水性、親水性或其組合?？赏ㄟ^使用本發(fā)明系統(tǒng)修飾任何蛋白質(zhì)來產(chǎn)生更穩(wěn)定的變異體。 已發(fā)現(xiàn)對表面殘基進行這些修飾可以提高蛋白質(zhì)的超熱力學(xué)性質(zhì)。隨著蛋白質(zhì)日益用作治 療劑和隨著其繼續(xù)用作研究工具，用于改變蛋白質(zhì)以使其更加穩(wěn)定的系統(tǒng)也變得重要和適 用。由本發(fā)明方法修飾的蛋白質(zhì)通?？咕奂?，重折疊能力增加，抗不適當(dāng)折疊，溶解性提高 并且在包括變性條件（諸如熱或存在洗滌劑）在內(nèi)的寬范圍條件下通常更加穩(wěn)定。
[0032] 可通過使用本發(fā)明系統(tǒng)修飾任何蛋白質(zhì)來產(chǎn)生更穩(wěn)定的變異體?？尚揎椞烊缓?非天然蛋白質(zhì)（例如，工程蛋白質(zhì)）。可被修飾的蛋白質(zhì)實例包括受體、膜結(jié)合蛋白、跨膜 蛋白、酶、轉(zhuǎn)錄因子、細(xì)胞外蛋白、治療蛋白、細(xì)胞因子、信使蛋白、DNA結(jié)合蛋白、RNA結(jié)合蛋 白、參與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的蛋白質(zhì)、結(jié)構(gòu)蛋白、胞漿蛋白、核內(nèi)蛋白、疏水性蛋白、親水性蛋白等。待 修飾的蛋白質(zhì)可源自植物、動物或微生物的任何物種。在某些實施例中，蛋白質(zhì)是哺乳動 物蛋白質(zhì)。在某些實施例中，蛋白質(zhì)是人類蛋白質(zhì)。在某些實施例中，蛋白質(zhì)源自研究中通 常使用的生物體。舉例來說，待修飾的蛋白質(zhì)可來自靈長類動物（例如，猿、猴）、嚙齒動物 (例如，兔子、倉鼠、沙鼠）、豬、狗、貓、魚（例如，斑馬魚（zebrafish))、線蟲（例如，秀麗線蟲 (C.elegans))、酵母（例如，釀酒酵母（Saccharomyces cervisiae))或細(xì)菌（例如，大腸桿 菌（E. coli))。
[0033] 本發(fā)明系統(tǒng)尤其適用于修飾易聚集或具有穩(wěn)定性問題的蛋白質(zhì)。本系統(tǒng)也可用于 修飾被過度表達(dá)的蛋白質(zhì)。舉例來說，重組產(chǎn)生的治療蛋白可以從本發(fā)明系統(tǒng)的修飾中受 益。這些經(jīng)過修飾的治療蛋白不僅更易生產(chǎn)和純化，而且就蛋白質(zhì)的保存和使用來說可能 更加穩(wěn)定。
[0034] 本發(fā)明系統(tǒng)包括鑒別所關(guān)注蛋白質(zhì)的非保守表面殘基和用在生理pH值下為親水 性、極性或帶電的殘基置換這些殘基中的一些。本發(fā)明系統(tǒng)不僅包括修飾蛋白質(zhì)的方法，而 且包括適用于修飾蛋白質(zhì)以使其更穩(wěn)定的試劑和試劑盒。
[0035] 使用所屬領(lǐng)域中已知的任何方法鑒別待修飾的蛋白質(zhì)的表面殘基。在某些實施例 中，通過計算機模擬蛋白質(zhì)鑒別表面殘基。在某些實施例中，已知和/或測定蛋白質(zhì)的三維 結(jié)構(gòu)，并通過觀察蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒別表面殘基。在其它實施例中，使用計算機軟件預(yù)測表面 殘基。在某些特定實施例中，使用每個側(cè)鏈原子的平均相鄰原子（Average Neighbor Atoms per Sidechain Atom, AvNAPSA)預(yù)測表面暴露。AvNAPSA是一種已作為計算機程序?qū)嵤┑?自動化表面暴露法。參見附錄A。低AvNAPSA值表示表面暴露的殘基，而高值表示位于蛋白 質(zhì)內(nèi)部的殘基。在某些實施例中，使用所述軟件預(yù)測蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)和/或三級結(jié)構(gòu)并 基于這一預(yù)測鑒別表面殘基。在其它實施例中，表面殘基的預(yù)測是基于殘基的疏水性和親 水性以及其于蛋白質(zhì)一級序列中的聚類分析。除計算機模擬（in Silico)方法外，也可使 用多種生物化學(xué)技術(shù)（例如蛋白酶裂解、表面修飾等）鑒別蛋白質(zhì)的表面殘基。
[0036] 然后確定表面殘基中哪些是保守的或?qū)Φ鞍踪|(zhì)的功能來說是重要的?？墒褂盟鶎?領(lǐng)域中已知的任何方法確定保守殘基的鑒別。在某些實施例中，通過比對所關(guān)注蛋白質(zhì)的 一級序列與相關(guān)蛋白質(zhì)來鑒別保守殘基。這些相關(guān)蛋白質(zhì)可來自同一蛋白質(zhì)家族。舉例來 說，如果蛋白質(zhì)是免疫球蛋白，那么可使用其它免疫球蛋白序列。相關(guān)蛋白質(zhì)也可以是來自 不同物種的相同蛋白質(zhì)。舉例來說，可通過比對來自不同物種的相同蛋白質(zhì)的序列來鑒別 保守殘基。作為另一實例，可比對具有類似功能或生物活性的蛋白質(zhì)。優(yōu)選使用2、3、4、5、 6、7、8、9或10個不同序列來確定蛋白質(zhì)的保守氨基酸。在某些實施例中，如果超過50%、 60 %、70 %、75 %、80 %或90 %的序列在特定位置具有相同氨基酸，那么殘基就被視為是保 守的。在其它實施例中，如果超過50 %、60 %、70 %、75 %、80 %或90 %的序列在特定位置具 有相同或類似（例如，纈氨酸、亮氨酸以及異亮氨酸；甘氨酸和丙氨酸；谷氨酰胺和天冬酰 胺；或天冬氨酸和谷氨酸）氨基酸，那么殘基就被視為是保守的。許多軟件包可用于比對和 比較如本文中所述的蛋白質(zhì)序列。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解可首先確定保守殘基或者可 首先確定表面殘基。順序并不重要。在某些實施例中，計算機軟件包可同時確定表面殘基 和保守殘基。也可通過誘變蛋白質(zhì)來鑒別蛋白質(zhì)中的重要殘基。舉例來說，可使用蛋白質(zhì) 的丙氨酸掃描來確定蛋白質(zhì)中的重要氨基酸殘基。在其它實施例中，可使用定點誘變。
[0037] -旦鑒別出蛋白質(zhì)的非保守表面殘基，就將各殘基鑒別為呈疏水性或親水性。在 某些實施例中，給殘基指定疏水性評分。舉例來說，可給各非保守表面殘基指定辛醇/水 分配系數(shù)的對數(shù)值（IogP)。也可使用其它疏水性參數(shù)。這些氨基酸標(biāo)度已論述于以下文 獻中：簡因（Janin),球狀蛋白中的表面和內(nèi)部體積（"Surface and Inside Volumes in Globular Proteins"),自然（Nature)277:491-92, 1979;沃爾芬頓（Wolfenden)等人， 氨基酸側(cè)鏈對溶劑水的親和力（"Affinities of Amino Acid Side Chains for Solvent Water"),生物化學(xué)（Biochemistry) 20:849-855, 1981 ;卡特（Kyte)等人，呈現(xiàn)蛋白質(zhì)水療 特性的簡單方法（〃A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein"),分子生物學(xué)雜志（J. Mol. Biol. ) 157:105-132, 1982;羅絲（Rose)等人，球狀 蛋白中的氨基酸殘基的疏水性（〃Hydrophobicity of Amino Acid Residues in Globular Proteins")，科學(xué)（Science)229:834_838, 1985;考納特（Cornette)等人，檢測蛋白質(zhì) 中的兩親結(jié)構(gòu)的疏水性標(biāo)度和計算技術(shù)（"Hydrophobicity Scales and Computational Techniques for Detecting Amphipathic Structures in Proteins"），分子生物學(xué)雜 志（J. Mol. Biol.) 195:659-685, 1987 ;查頓（Charton)和查頓（Charton)，氨基酸疏水 性參數(shù)的結(jié)構(gòu)依賴性（〃The Structure Dependence of Amino Acid Hydrophobicity Parameters"),理論生物學(xué)雜志（J.Theor. Biol. )99:629-644, 1982 ;各自以引用的方式并 入本文中。本發(fā)明方法中可使用任何這些疏水性參數(shù)來確定修飾哪些非保守殘基。在某些 實施例中，鑒別親水性或帶電殘基來修飾。
[0038] 然后選擇至少一個所鑒別的非保守或非重要表面殘基加以修飾。在某些實施例 中，選擇疏水性殘基加以修飾。在其它實施例中，選擇親水性和/或帶電殘基加以修飾。在 某些實施例中，選擇不止一個殘基加以修飾。在某些實施例中，選擇1、2、3、4、5、6、7、8、9或 10個所鑒別的殘基加以修飾。在某些實施例中，選擇超過10個、超過15個或超過20個殘 基加以修飾。所屬領(lǐng)域的技術(shù)人員應(yīng)了解，蛋白質(zhì)越大，則需要修飾的殘基將越多。同時， 蛋白質(zhì)疏水性越高或者越易聚集或沉淀，則需要修飾的殘基將越多。在某些實施例中，產(chǎn)生 多個各具有不同修飾的蛋白質(zhì)變異體并加以測試以確定就生物活性和穩(wěn)定性來說最佳的 變異體。
[0039] 在某些實施例中，使選擇加以修飾的殘基突變?yōu)楦H水的殘基（包括帶電殘基）。 通常使殘基突變?yōu)楦H水的天然氨基酸。在某些實施例中，使殘基突變?yōu)樵谏韕H值下帶 電的氨基酸。舉例來說，殘基可變?yōu)榫彼?、天冬氨酸、谷氨酸、組氨酸或賴氨酸。在某些實 施例中，使待修飾的所有殘基變?yōu)橥环N不同殘基。舉例來說，使所選擇的殘基全部變?yōu)楣?氨酸殘基。在其它實施例中，使所選擇的殘基變?yōu)椴煌瑲埢?；然而，可使所有最終殘基在生 理pH值下帶正電或帶負(fù)電。在某些實施例中，為產(chǎn)生帶負(fù)電的蛋白質(zhì)，使待突變的所有殘 基轉(zhuǎn)化為谷氨酸和/或天冬氨酸殘基。在某些實施例中，為產(chǎn)生帶正電的蛋白質(zhì)，使待突變 的所有殘基轉(zhuǎn)化為賴氨酸殘基。舉例來說，所有所選擇的待修飾殘基是天冬酰胺、谷氨酰 胺、賴氨酸和/或精氨酸，并且使這些殘基突變?yōu)樘於彼峄蚬劝彼釟埢?。作為另一實例?所有所選擇的待修飾殘基是天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺和/或谷氨酰胺，并且使這些殘基 突變?yōu)橘嚢彼帷＿@種方法允許在最大程度上修飾蛋白質(zhì)上的凈電荷。
[0040] 在其它實施例中，蛋白質(zhì)可在修飾后在修飾蛋白質(zhì)上保持與未修飾蛋白質(zhì)上相同 的凈電荷。在其它實施例中，蛋白質(zhì)可在修飾后減少蛋白質(zhì)上的總凈電荷，而增加表面上帶 電殘基的總數(shù)。在某些實施例中，理論凈電荷增加至少+1、+2、+3、+4、+5、+10、+15、+20、 +25、+30或+35。在某些實施例中，理論凈電荷減少至少-1、-2、-3、-4、-5、-10、-15、-20、-2 5、-30或-35。在某些實施例中，使所選擇的氨基酸變?yōu)榉请x子極性殘基（例如，半胱氨酸、 絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺）。
[0041] 蛋白質(zhì)中的這些修飾或突變可使用所屬領(lǐng)域中已知的任何技術(shù)來實現(xiàn)。所屬 領(lǐng)域中熟知在蛋白質(zhì)序列中引入這些變化的重組DNA技術(shù)。在某些實施例中，通過定點 誘變編碼所述蛋白質(zhì)的多核苷酸進行修飾。引入突變的其它技術(shù)論述于以下文獻中：分 子克?。簩嶒炇沂謨裕∕olecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版，山姆布魯 克（Sambrook),福里茨（Fritsch)以及曼尼亞提斯（Maniatis)編，（冷泉港實驗室出版 社（Cold Spring Harbor Laboratory Press) :1989);論文酶學(xué)中的方法（Methods in Enzymology)(學(xué)術(shù)出版社（Academic Press, Inc.)，紐約（N. Y.));奧蘇貝爾（Ausubel)等 人，最新分子生物學(xué)實驗方法匯編（Current Protocols in Molecular Biology)(約翰威 利父子出版社（John Wiley&Sons, Inc.)，紐約（New York), 1999);各自以引用的方式并入 本文中。表達(dá)并測試所述修飾蛋白質(zhì)。在某些實施例中，制備一系列變異體并測試各變異 體確定其生物活性和其穩(wěn)定性。選擇用于后續(xù)使用的變異體可為最穩(wěn)定的變異體、最具活 性的變異體或者活性和穩(wěn)定性的組合總體最大的變異體。制備第一組變異體后，可以基于 從第一組變異體學(xué)到的知識制備另一組變異體。通常使用所屬領(lǐng)域中已知的重組技術(shù)產(chǎn)生 和過度表達(dá)變異體。
[0042] 已使用本發(fā)明系統(tǒng)產(chǎn)生了 GFP變異體。已顯示這些變異體更加穩(wěn)定并且保留其熒 光性。來自維多利亞水母（Aequorea victoria)的GFP描述于基因庫寄存編號P42212中， 其以引用的方式并入本文中。這一野生型GFP的氨基酸序列如下：
[0043] MSKGEELFTGWPILVELD ⑶ VNGHKFSVSGEGEGDATYGKLTLKFICTTGKLPVPW
[0044] PTLVTTFSYGVQCFSRYPDHMKAHDFFKSAMPEGYVQERTIFFKDDGNYKTRAEVK
[0045] FEGDTLVNRIELKGIDFKEDGNILGHKLEYNYNSHNVYIMADKQKNGIKVNFKIRHNI
[0046] EDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDNHYLSTQSALSKDPNEKRDHMVLLEFVTAA
[0047] GITHGMDELYK(SEQ ID NO :1)。
[0048] 野生型GFP的理論凈電荷為-7。使用本發(fā)明系統(tǒng)已產(chǎn)生理論凈電荷 為-29、-30、-25、+36、+48以及+49的變異體。即使加熱+36GFP到95°C后，100%的變異蛋 白質(zhì)也是可溶的并且蛋白質(zhì)保留> 70%的熒光性。
[0049] 已產(chǎn)生的GFP變異體的氨基酸序列包括：

【權(quán)利要求】
1. 一種野生型蛋白的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體包括與野生型序 列相比經(jīng)修飾的一級氨基酸序列，導(dǎo)致所述超帶電蛋白質(zhì)變體上的凈電荷為： 生理pH值下-10至-40,其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下所帶凈電荷比野生 型蛋白減小了至少-3;或 生理pH值下+10至+52，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下所帶凈電荷比野生 型蛋白增加了至少+3 ; 其中所述經(jīng)修飾的一級氨基酸序列包括用在生理pH值下帶正電或帶負(fù)電的天然氨基 酸殘基置換多個非保守表面殘基；以及 其中所述非保守表面殘基通過比較所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列與來自同一蛋白質(zhì)家族 或來自不同物種的蛋白質(zhì)的至少一個其它氨基酸序列來鑒定，其中如果在特定位置上有小 于或等于50 %的氨基酸序列為相同的氨基酸序列，那么殘基就是非保守的。
2. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述變體帶正電。
3. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述變體帶負(fù)電。
4. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下 所帶凈電荷比野生型蛋白增加了至少+4、至少+5、至少+10、至少+15、至少+20、至少+25、 至少+30、或至少+35。
5. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下 所帶凈電荷比野生型蛋白減小了至少-4、至少-5、至少-10、至少-15、至少-20、至少-25、 至少-30、或至少-35。
6. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下 的凈電荷在-40至-20或-40至-30范圍內(nèi)。
7. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體在生理pH值下 的凈電荷在+52至+20、+52至+30、或+52至+40范圍內(nèi)。
8. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體保留野生型蛋 白的至少50%、至少75%、至少90%、或至少95%的活性。
9. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述野生型蛋白是免疫球蛋白或其片 段。
10. 如權(quán)利要求9所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述免疫球蛋白或其片段是人類的 或是人源化的。
11. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述變體是融合蛋白。
12. 如權(quán)利要求11所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述融合蛋白包括連接子。
13. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體的經(jīng)修飾的 一級氨基酸序列包括用不同殘基置換野生型蛋白的至少一個帶電的非保守表面殘基。
14. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體的經(jīng)修飾的 一級氨基酸序列包括用不同電荷的殘基置換野生型蛋白的至少一個非保守表面殘基。
15. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體的經(jīng)修飾的 一級氨基酸序列包括用賴氨酸、組氨酸或精氨酸殘基置換野生型蛋白的至少一個非保守表 面殘基。
16. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體的經(jīng)修飾的 一級氨基酸序列包括用天冬氨酸或谷氨酸殘基置換野生型蛋白的至少一個非保守表面殘 基。
17. 如權(quán)利要求1所述的超帶電蛋白質(zhì)變體，其中所述超帶電蛋白質(zhì)變體的經(jīng)修飾的 一級氨基酸序列包括用不同殘基置換野生型蛋白的至少2個、至少5個、至少10個、至少20 個或至少30個非保守表面殘基。
18. -種以下氨基酸序列的綠色熒光蛋白（+36GFP): MGHHHHHHGGASKGERLFRGKVPILVELK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRNHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRDERYK 〇
19. 一種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求18所述的綠色熒光蛋白（+36GFP)。
20. 如權(quán)利要求19所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGGCATCATCATCATCACCACGGCGGGGCGTCTAAGGGAGAGCGCTTGTTTCGCGGCAAAGTCCCGATT CTTGTGGAGCTCAAAGGTGATGTAAATGGTCATAAATTTAGTGTGCGCGGGAAAGGGAAAGGAGATGCTACGCGGGG CAAGCTCACCCTGAAATTTATTTGCACAACCGGCAAACTGCCAGTGCCGTGGCCTACATTAGTCACTACTCTGACGT ACGGTGTTCAGTGCTTTTCTCGCTATCCCAAACACATGAAACGCCATGATTTCTTCAAGAGCGCGATGCCAAAAGGT TATGTGCAGGAACGCACCATCAGCTTTAAAAAAGACGGCAAATATAAAACCCGTGCAGAAGTTAAATTCGAAGGCCG CACCCTGGTCAACCGCATTAAACTGAAAGGTCGTGACTTCAAAGAGAAAGGTAATATTCTTGGTCACAAACTGCGCT ATAATTTCAACTCTCACAAAGTTTATATTACGGCGGATAAACGTAAAAACGGGATTAAAGCGAAATTTAAGATTCGT CATAATGTTAAAGACGGCAGTGTGCAGTTAGCGGATCATTATCAGCAGAATACCCCAATTGGTCGCGGTCCAGTGCT GCTGCCGCGTAACCATTATCTGTCGACCCGCAGCAAACTCAGCAAAGACCCGAAAGAAAAACGTGACCACATGGTAT TACTGGAATTTGTGACCGCAGCAGGCATTAAACATGGCCGCGATGAACGTTACAAATAG。
21. -種載體，其包括如權(quán)利要求19或20所述的多核苷酸。
22. -種氨基酸序列如下的綠色熒光蛋白（+42GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVELK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFEGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLADHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK 〇
23. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求22所述的綠色熒光蛋白（+42GFP)。
24. 如權(quán)利要求23所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGCCATCATCATCACCACCACGGCGGCCGCTCAAAAGGTAAACGCTTGTTCCGTGGTAAAGTACCGATC TTAGTGGAGCTCAAAGGGGATGTGAATGGCCATAAGTTCTCGGTTCGTGGCAAAGGTAAGGGAGATGCGACGCGCGG CAAATTAACGCTGAAATTCATTTGTACTACAGGTAAACTGCCGGTGCCATGGCCTACTCTCGTCACCACGTTGACCT ATGGGGTTCAATGCTTCAGCCGGTACCCTAAACACATGAAGCGCCACGATTTCTTCAAATCGGCGATGCCAAAGGGG TATGTCCAGGAACGCACTATCAGCTTCAAAAAAGACGGTAAGTATAAAACTCGTGCTGAAGTTAAATTCGAAGGACG CACACTGGTAAATCGCATTAAATTGAAGGGGCGCGACTTTAAGGAAAAAGGTAATATCTTAGGTCACAAATTGCGCT ACAACTTCAACTCTCATAAAGTTTACATTACAGCAGATAAGCGTAAAAATGGCATCAAAGCGAAATTCAAAATTCGT CACAATGTGAAAGATGGTAGCGTGCAATTAGCCGATCATTACCAGCAGAATACGCCGATCGGTCGCGGCCCAGTACT GTTGCCGCGCAAACATTACTTATCTACCCGGAGTAAACTGTCTAAAGACCCAAAAGAGAAGCGCGACCATATGGTTC TCCTGGAGTTTGTCACCGCCGCCGGAATTAAACACGGCCGCAAAGAGCGCTATAAATAG。
25. -種載體，其包括如權(quán)利要求23或24所述的多核苷酸。
26. -種氨基酸序列如下的綠色熒光蛋白（+48GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLLEFVTAAGIKHGRKERYK(SEQ ID N0:24)。
27. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求26所述的綠色熒光蛋白（+48GFP)。
28. -種載體，其包括如權(quán)利要求27所述的多核苷酸。
29. -種氨基酸序列如下的綠色熒光蛋白（+49GFP): MGHHHHHHGGRSKGKRLFRGKVPILVKLK⑶VNGHKFSVRGKGKGDATRGKLTLKFICTTGKLPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPKHMKRHDFFKSAMPKGYVQERTISFKKDGKYKTRAEVKFKGRTLVNRIKLKGRDFKEKGNILGH KLRYNFNSHKVYITADKRKNGIKAKFKIRHNVKDGSVQLAKHYQQNTPIGRGPVLLPRKHYLSTRSKLSKDPKEKRD HMVLKEFVTAAGIKHGRKERYK 〇
30. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求29所述的綠色熒光蛋白（+49GFP)。
31. 如權(quán)利要求30所述的多核苷酸，其序列如下： ATGGGCCACCATCATCATCACCACGGGGGACGCTCTAAAGGTAAACGTCTGTTTCGTGGAAAGGTGCCCATT CTGGTTAAACTCAAAGGTGATGTCAACGGCCATAAGTTTTCGGTTCGTGGCAAAGGTAAAGGTGATGCGACGCGCGG GAAATTAACACTGAAATTTATTTGCACAACCGGAAAACTCCCTGTGCCGTGGCCGACTTTGGTGACCACATTAACCT ATGGTGTTCAATGCTTCTCACGTTATCCGAAGCATATGAAACGTCATGATTTTTTCAAATCGGCTATGCCGAAAGGT TACGTCCAGGAGCGCACCATCTCATTTAAGAAAGACGGTAAGTATAAAACCCGTGCTGAAGTAAAATTCAAAGGACG CACCCTGGTGAATCGCATTAAACTGAAAGGTCGTGATTTCAAAGAAAAGGGAAATATTTTAGGGCATAAGCTCCGTT ATAATTTTAACAGTCATAAGGTGTATATTACCGCTGATAAACGCAAAAACGGAATCAAAGCGAAATTTAAGATCCGT CATAATGTAAAAGATGGCTCAGTCCAACTGGCAAAACATTACCAGCAGAATACCCCGATCGGCCGCGGTCCTGTGCT TCTGCCGCGTAAACACTACTTGTCGACCCGGTCAAAATTGAGTAAAGATCCGAAGGAAAAGCGTGATCACATGGTCT TGAAGGAATTTGTAACTGCAGCAGGTATTAAACACGGGCGCAAAGAACGTTACAAATAG〇
32. -種載體，其包括如權(quán)利要求30或31所述的多核苷酸。
33. -種鏈霉親和素（+52SAV)，其包括以下氨基酸序列： MGHHHHHHGGAKAGITGTWYNQLGSTFIVTAGAKGALTGTYESAVGNAKSRYVLTGRYDSAPATKGSGTALGW TVAWKNKYRNAHSATTWSGQYVGGAKARINTQWLLTSGTTKAKAffKSTLVGHDTFTKVKPSAASo
34. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求33所述的鏈霉親和素（+52SAV)。
35. 如權(quán)利要求34所述的多核苷酸，其序列如下： GGTTCAGCCATGGGTCATCACCACCACCATCACGGTGGCGCCAAAGCAGGTATTACCGGTACCTGGTATAAC CAGTTAGGCTCAACCTTTATTGTGACCGCGGGAGCGAAAGGCGCCTTAACCGGTACCTACGAATCAGCTGTAGGAAA CGCAAAATCACGCTACGTATTAACCGGTCGTTATGATAGCGCGCCGGCGACTAAAGGTAGCGGTACTGCTTTAGGTT GGACCGTAGCGTGGAAGAATAAGTATCGTAATGCGCACAGTGCTACCACTTGGTCAGGGCAGTACGTAGGGGGAGCC AAAGCACGTATCAACACGCAGTGGTTATTAACATCAGGTACCACCAAAGCGAAAGCCTGGAAGAGCACGTTAGTGGG TCATGATACCTTCACTAAAGTGAAACCTTCAGCTGCGTCATAATAATGACTCGAGACCTGCA。
36. -種載體，其包括如權(quán)利要求34或35所述的多核苷酸。
37. -種氨基酸序列如下的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（+50GST): MGHHHHHHGGPPYTITYFPVRGRCEAMRMLLADQKQSWKEEVVTMKTWPPLKPSCLFRQLPKFQDGKLTLYQ SNAILRHLGRSFGLYGKKQKEAALVDMVNDGVEDLRCKYATLIYTKYKAGKKKYVKKLPKHLKPFETLLSKNKGGKA FVVGSKISFADYNLLDLLRIHQVLNPSCLKAFPLLSAYVARLSARPKIKAFLASPEHVKRPINGNGKQo
38. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求37所述的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（+50GST)。
39. 如權(quán)利要求38所述的多核苷酸，其序列如下： GGTTCAGCCATGGGTCATCACCACCACCATCACGGTGGCCCGCCGTACACCATTACATACTTTCCGGTACGT GGTCGTTGTGAAGCGATGCGTATGTTATTAGCGGACCAGAAACAATCATGGAAAGAAGAAGTAGTGACAATGAAGAC CTGGCCGCCGTTAAAGCCTAGCTGTTTATTCCGTCAATTACCGAAGTTTCAGGATGGTAAATTAACCTTATACCAGT CTAACGCGATCTTACGTCATTTAGGTCGCTCATTTGGTTTATACGGTAAGAAGCAGAAAGAAGCAGCCTTAGTGGAT ATGGTGAATGATGGCGTGGAAGACTTACGTTGTAAATACGCGACGTTAATTTACACTAAATATAAAGCCGGTAAAAA GAAGTACGTGAAAAAATTACCTAAACACCTGAAGCCGTTTGAAACATTACTGAGCAAAAATAAAGGAGGTAAGGCGT TCGTAGTTGGTAGCAAGATTAGCTTCGCTGATTATAACTTATTAGACTTATTACGCATTCACCAGGTTTTAAATCCT AGCTGTTTAAAGGCTTTCCCGTTACTGAGCGCATATGTAGCGCGCCTGAGCGCCCGTCCGAAGATCAAAGCTTTCTT AGCGTCACCTGAACACGTGAAGCGCCCGATTAACGGAAACGGCAAGCAGTAATAATGAGGTACCACCTGCA。
40. -種載體，其包括如權(quán)利要求38或39所述的多核苷酸。
41. 一種超帶電蛋白質(zhì)，其選自： 鏈霉親和素蛋白（-40SAV)，其包括如下的氨基酸序列： MGHHHHHHGGAEAGITGTWYNQLGSTFIVTAGADGALTGTYESAVGDAESEYVLTGRYDSAPATDGSGTALGW TVAWKNDYENAHSATTWSGQYVGGAEARINTQWLLTSGTTEADAffKSTLVGHDTFTKVEPSAAS ； 綠色熒光蛋白（-30GFP)，其氨基酸序列如下： MGHHHHHHGGASKGEELFDGVVPILVELD⑶VNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVT TLTYGVQCFSDYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFE⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGH KLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRD HMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK ； 綠色熒光蛋白（-29GFP)，其氨基酸序列如下： MGHHHHHHGGASKGEELFDGEVPILVELD⑶VNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPDHMDQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKro⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGH KLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRD HMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK ； 綠色熒光蛋白（-25GFP)，其氨基酸序列如下： MGHHHHHHGGASKGEELFTGVVPILVELD⑶VNGHEFSVRGEGEGDATEGELTLKFICTTGELPVPWPTLVT TLTYGVQCFSRYPDHMKQHDFFKSAMPEGYVQERTISFKDDGTYKTRAEVKFE⑶TLVNRIELKGIDFKEDGNILGH KLEYNFNSHDVYITADKQENGIKAEFEIRHNVEDGSVQLADHYQQNTPI⑶GPVLLPDDHYLSTESALSKDPNEDRD HMVLLEFVTAAGIDHGMDELYK ;和 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（-40GST)，其氨基酸序列如下： MGHHHHHHGGPPYTITYFPVRGRCEAMRMLLADQDQSWEEEVVTMETWPPLKPSCLFRQLPKFQD⑶LTLYQ SNAILRHLGRSFGLYGEDEEEAALVDMVNDGVEDLRCKYATLIYTDYEAGKEEYVEELPEHLKPFETLLSENEGGEA FVVGSEISFADYNLLDLLRIHQVLNPSCLDAFPLLSAYVARLSARPEIEAFLASPEHVDRPINGNGKQo
42. -種多核苷酸，其編碼如權(quán)利要求41中的任一超帶電蛋白質(zhì)。
43. 如權(quán)利要求42所述的多核苷酸，其選自由以下組成的群組： 編碼權(quán)利要求41中的鏈霉親和素蛋白（-40SAV)的多核苷酸，其序列如下： GGTTCAGCCATGGGTCATCACCACCACCATCACGGTGGCGCCGAAGCAGGTATTACCGGTACCTGGTATAAC CAGTTAGGCTCAACCTTTATTGTGACCGCGGGAGCGGACGGCGCCTTAACCGGTACCTACGAATCAGCTGTAGGTGA CGCGGAATCAGAGTACGTATTAACCGGTCGTTATGATAGCGCGCCGGCGACTGACGGTAGCGGTACTGCTTTAGGTT GGACCGTAGCGTGGAAGAATGATTATGAAAACGCACATAGCGCAACAACGTGGTCAGGGCAGTACGTTGGCGGAGCT GAGGCGCGCATTAACACGCAGTGGTTATTAACTAGCGGCACCACTGAAGCTGATGCCTGGAAGAGCACGTTAGTGGG TCATGATACCTTCACTAAAGTGGAACCTTCAGCTGCGTCATAATAATGACTCGAGACCTGCA ； 編碼權(quán)利要求41中的綠色熒光蛋白（-30GFP)的多核苷酸，其序列如下： ATGGGGCATCACCATCATCATCATGGCGGTGCGTCTAAGGGGGAGGAGTTATTTGATGGTGTGGTGCCGATC CTGGTGGAGCTTGATGGCGATGTTAACGGCCATGAATTTTCTGTCCGCGGTGAAGGGGAGGGTGATGCCACGGAAGG GGAGCTGACACTTAAATTTATTTGCACCACCGGTGAACTCCCGGTCCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCT ACGGCGTTCAATGCTTTTCAGATTATCCGGATCACATGGACCAACACGACTTCTTTAAAAGCGCGATGCCTGAAGGC TATGTTCAAGAACGTACAATTAGTTTTAAAGATGACGGCACCTACAAGACCCGTGCGGAAGTAAAATTTGAAGGGGA CACTTTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAAGGGATCGATTTTAAAGAAGATGGGAATATCCTGGGACACAAACTTGAAT ACAACTTTAATAGTCATGACGTCTATATCACGGCGGACAAACAGGAAAACGGAATTAAGGCAGAATTTGAGATTCGG CATAATGTCGAAGATGGCTCGGTACAGTTGGCTGATCACTATCAGCAGAATACGCCGATTGGAGATGGTCCGGTTTT ATTACCAGACGATCACTATCTGTCCACCGAATCCGCCCTGAGCAAAGATCCGAATGAAGACCGGGACCATATGGTTC TGCTGGAATTTGTTACGGCGGCTGGTATTGACCATGGCATGGATGAGCTGTATAAGTAG ； 編碼權(quán)利要求41中的綠色熒光蛋白（-29GFP)的多核苷酸，其序列如下： ATGGGGCATCACCATCATCATCATGGCGGTGCGTCTAAGGGGGAGGAGTTATTTGATGGTGAAGTGCCGATC CTGGTGGAGCTTGATGGCGATGTTAACGGCCATGAATTTTCTGTCCGCGGTGAAGGGGAGGGTGATGCCACGGAAGG GGAGCTGACACTTAAATTTATTTGCACCACCGGTGAACTCCCGGTCCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCT ACGGCGTTCAATGCTTTTCACGTTATCCGGATCACATGGACCAACACGACTTCTTTAAAAGCGCGATGCCTGAAGGC TATGTTCAAGAACGTACAATTAGTTTTAAAGATGACGGCACCTACAAGACCCGTGCGGAAGTAAAATTTGAAGGGGA CACTTTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAAGGGATCGATTTTAAAGAAGATGGGAATATCCTGGGACACAAACTTGAAT ACAACTTTAATAGTCATGACGTCTATATCACGGCGGACAAACAGGAAAACGGAATTAAGGCAGAATTTGAGATTCGG CATAATGTCGAAGATGGCTCGGTACAGTTGGCTGATCACTATCAGCAGAATACGCCGATTGGAGATGGTCCGGTTTT ATTACCAGACGATCACTATCTGTCCACCGAATCCGCCCTGAGCAAAGATCCGAATGAAGACCGGGACCATATGGTTC TGCTGGAATTTGTTACGGCGGCTGGTATTGACCATGGCATGGATGAGCTGTATAAGTAG ； 編碼權(quán)利要求41中的綠色熒光蛋白（-25GFP)的多核苷酸，其序列如下： ATGGGGCATCACCATCATCATCATGGCGGTGCGTCTAAGGGGGAGGAGTTATTTACGGGTGTGGTGCCGATC CTGGTGGAGCTTGATGGCGATGTTAACGGCCATGAATTTTCTGTCCGCGGTGAAGGGGAGGGTGATGCCACGGAAGG GGAGCTGACACTTAAATTTATTTGCACCACCGGTGAACTCCCGGTCCCGTGGCCGACCCTGGTGACCACCCTGACCT ACGGCGTTCAATGCTTTTCACGTTATCCGGATCACATGAAGCAACACGACTTCTTTAAAAGCGCGATGCCTGAAGGC TATGTTCAAGAACGTACAATTAGTTTTAAAGATGACGGCACCTACAAGACCCGTGCGGAAGTAAAATTTGAAGGGGA CACTTTAGTGAACCGCATCGAGCTGAAAGGGATCGATTTTAAAGAAGATGGGAATATCCTGGGACACAAACTTGAAT ACAACTTTAATAGTCATGACGTCTATATCACGGCGGACAAACAGGAAAACGGAATTAAGGCAGAATTTGAGATTCGG CATAATGTCGAAGATGGCTCGGTACAGTTGGCTGATCACTATCAGCAGAATACGCCGATTGGAGATGGTCCGGTTTT ATTACCAGACGATCACTATCTGTCCACCGAATCCGCCCTGAGCAAAGATCCGAATGAAGACCGGGACCATATGGTTC TGCTGGAATTTGTTACGGCGGCTGGTATTGACCATGGCATGGATGAGCTGTATAAGTAG ;以及 編碼權(quán)利要求41中的谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶（-40GST)的多核苷酸，其序列如下：GGTTCAGCCATGGGTCATCACCACCACCATCACGGTGGCCCGCCGTACACCATTACATACTTTCCGGTACGT GGTCGTTGTGAAGCGATGCGTATGTTATTAGCGGACCAGGACCAATCATGGGAAGAAGAAGTAGTGACAATGGAAAC CTGGCCGCCGTTAAAGCCTAGCTGTTTATTCCGTCAATTACCGAAGTTTCAGGATGGTGATTTAACCTTATACCAGT CTAACGCGATCTTACGTCATTTAGGTCGCTCATTTGGTTTATACGGTGAAGATGAAGAAGAAGCAGCCTTAGTGGAT ATGGTGAATGATGGCGTGGAAGACTTACGTTGTAAATACGCGACGTTAATTTACACTGATTATGAAGCCGGTAAAGA GGAGTACGTGGAAGAATTACCTGAACACCTGAAGCCGTTTGAAACATTACTGAGCGAAAATGAAGGAGGTGAGGCGT TCGTAGTTGGTAGCGAAATTAGCTTCGCTGATTATAACTTATTAGACTTATTACGCATTCACCAGGTTTTAAATCCT AGCTGTTTAGACGCTTTCCCGTTACTGAGCGCATATGTAGCGCGCCTGAGCGCCCGTCCGGAAATTGAAGCTTTCTT AGCGTCACCTGAACACGTAGACCGCCCGATTAACGGAAACGGCAAGCAGTAATAATGAGGTACCACCTGCA。
44. 一種載體，其包括如權(quán)利要求42或43中的任一多核苷酸。
45. -種醫(yī)藥組合物，其包括如權(quán)利要求1-18、22、26、29、33、37和41中任一項所述的 超帶電蛋白質(zhì)和任選地醫(yī)藥上可接受的輔料。
【文檔編號】C12N15/54GK104356230SQ201410575610
【公開日】2015年2月18日 申請日期:2007年6月1日 優(yōu)先權(quán)日:2006年6月2日
【發(fā)明者】大衛(wèi)·R·劉, 凱文·約翰·菲利普斯, 邁克爾·S·勞倫斯 申請人:哈佛大學(xué)校長及研究員協(xié)會