通過脊椎動物細胞位點特異性并入非天然氨基酸的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供用于產生擴充脊椎動物細胞中基因編碼的氨基酸的數量的翻譯組件的組合物和方法。所述組件包括正交tRNA、正交氨?；?tRNA合成酶、tRNA/合成酶正交對和非天然氨基酸。還提供具有非天然氨基酸的蛋白質和在脊椎動物細胞中產生具有非天然氨基酸的蛋白質的方法。
【專利說明】通過脊椎動物細胞位點特異性并入非天然氨基酸
[0001] 分案說明
[0002] 本申請案是申請日為2007年9月7日，申請?zhí)枮?00780033055. 0(國際申請?zhí)枮?PCT/US2007/019654)，發(fā)明名稱為通過脊椎動物細胞位點特異性并入非天然氨基酸的專利 申請的分案申請。

【技術領域】
[0003] 本發(fā)明涉及脊椎動物細胞中的翻譯生物化學領域。本發(fā)明涉及在脊椎動物細胞中 產生正交tRNA、正交合成酶和其對的方法以及正交tRNA、正交合成酶與其對的組合物。本 發(fā)明還涉及非天然氨基酸組合物、包括非天然氨基酸的蛋白質以及在脊椎動物細胞中產生 包括非天然氨基酸的蛋白質的方法。

【背景技術】
[0004] 從細菌到人類，每一種已知生物體的遺傳密碼都編碼相同的二十種常見氨基酸。 這二十種相同天然氨基酸的不同組合形成實質上進行生命的所有復雜過程（光合作用 到信號轉導和免疫反應）的蛋白質。為研究和修飾蛋白質的結構和功能，科學家們曾嘗 試操縱蛋白質的遺傳密碼和氨基酸序列。然而，難以去除由遺傳密碼所強加的將蛋白質 局限于二十種基因編碼的標準結構單元（其中極少見的特例為，硒代半胱氨酸（例如參 看 A. Bock 等人，(1991), Molecular Microbiology 5:515-20)和批咯賴氨酸（例如參看 G. Srinivasan 等人，(2002). Science 296:1459-62))的約束。
[0005] 已取得一些進展來去除這些約束，但這一進展受到限制并且合理控制蛋白質結構 和功能的能力仍不成熟。舉例來說，化學家們已開發(fā)出合成和操縱小分子結構的方法和 策略（例如參看 E. J. Corey 和 X. -M. Cheng, The Logic of Chemical Synthesis (ffiley-Interscience, New York, 1995))。全合成（例如參看 B. Merrifield, (1986), Science232 :341-7(1986))和半合成方法（例如參看 D.Y. Jackson 等人，（1994)Science266:243-7; 以及 P. E. Dawson 和 S. B. Kent, (2000),Annual Review of Biochemistry69:923-60)使 得合成肽和小蛋白質成為可能，但這些方法限制了超過10千道爾頓（kiloDalton, kDa) 的蛋白質的效用。誘變方法盡管有效，但也局限于有限數量的結構改變。在多種情況下， 在整個蛋白質中競爭性并入常見氨基酸的極其接近的結構類似物已成為可能。例如參看 R. Furter, (1998), Protein Science 7:419-26 ;K. Kirshenbaum等人，(2002), ChemBioChem 3:235-7 ;和 V.Doring 等人，(2001), Science 292:501-4。
[0006] 在嘗試擴大操縱蛋白質結構和功能的能力的過程中，開發(fā)出使用經化學?；恼?交tRNA的活體外方法，其使得能在活體外響應無義密碼子選擇性并入非天然氨基酸（例如 參看，T.A.Ellman等人，（1992),Science255:197-200)。將具有新穎結構和物理特性的氨 基酸選擇性并入蛋白質中，來研究蛋白質折疊和穩(wěn)定性以及生物分子識別和催化。例如參 看，D. Mendel 等人(1995), Annual Review of Biophysics and Biomolecular Structure 24:435-462 ;和 V. W. Cornish等人（1995年 3 月 31 日），Angewandte Chemie-International Edition in English34:621-633。然而，這一方法的化學計量性質極大限制了能產生的蛋 白質的量。
[0007] 已將非天然氨基酸顯微注射到細胞中。舉例來說，通過顯微注射以化學方式錯 醜化的嗜熱四膜蟲（Tetrahymena thermophila) tRNA (例如，M. E. Saks 等人（1996)，An engineered Tetrahymena tRNAGln for in vivo incorporation of unnatural amino acids into proteins by nonsense suppression，J. Biol. Chem.271:23169-23175)和相關 mRNA而將非天然氨基酸引入爪蟾卵母細胞（Xenopus oocyte)中的煙堿型乙酰膽堿受體中 (例如，M. W. Nowak 等人（1998)，In vivo incorporation of unnatural amino acids into ion channels in Xenopus oocyte expression system. Method Enzymol. 293:504-529) 〇 這允許通過引入具有獨特物理或化學特性的含側鏈氨基酸來對卵母細胞中的受體進行詳 細生物物理研究。例如參看，D.A. Dougherty (2000)，Unnatural amino acids as probes of protein structure and function,Curr. Opin. Chem. Biol.4:645-652。不幸的是，這種 方法局限于細胞中可進行顯微注射的蛋白質，并且由于相關tRNA是在活體外以化學方式 酰化并且無法再?；?，故蛋白質的產率極低。
[0008] 為克服這些缺點，將新組件添加到原核生物大腸桿菌（Escherichia coli， E. coil)的蛋白質生物合成機器中（參看L. Wang等人，(2001), Science 292:498-500)， 這允許在活體內基因編碼非天然氨基酸。已使用這種方法響應琥珀密碼子TAG將多 種具有新穎化學、物理或生物特性的新氨基酸有效且高保真地并入大腸桿菌的蛋白 質中，所述新氨基酸包括光親和標記和光致異構化氨基酸、酮基氨基酸和糖基化氨基 酸。例如參看 J. W. Chin 等人，(2002), Journal of the American Chemical Society 124:9026-9027 ；J. ff. Chin, &P. G. Schultz, (2002), Chem BioChem 11:1135-1137 ；J.ff. Chin 等人，(2002). PNAS United States of America 99:11020-11024;和 L. Wang, &P. G. Schultz, (2002)，Chem. Comm.，1-10。然而，原核生物和真核生物的翻譯機器并不高度 保守；因此，添加到大腸桿菌中的生物合成機器的組件通常無法用于將非天然氨基酸位 點特異性并入脊椎動物細胞中的蛋白質中。舉例來說，用于大腸桿菌中的詹氏甲烷球菌 (Methanococcus jannaschii)酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA對在脊椎動物細胞中并不正交。 此外，真核生物而非原核生物中tRNA的轉錄是通過RNA聚合酶III進行，并且這會限制能 在脊椎動物細胞中轉錄的tRNA結構基因的一級序列。而且，與原核生物細胞相比，脊椎動 物細胞中的tRNA都是從轉錄tRNA的細胞核輸出到細胞質，以進行翻譯。最后，脊椎動物的 80S核糖體與70S原核生物核糖體截然不同。因此，需要開發(fā)出經改進的生物合成機器組件 以擴充脊椎動物遺傳密碼。如在仔細查看以下揭示內容后將顯而易見，本發(fā)明滿足這些要 求和其它要求。


【發(fā)明內容】

[0009] 本發(fā)明對脊椎動物細胞提供翻譯組件，例如正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)與正 交tRNA(0-tRNA)對和其個別組件，所述翻譯組件可用于脊椎動物蛋白質生物合成機器中 以將非天然氨基酸并入脊椎動物細胞中正在生長的多肽鏈中。
[0010] 本發(fā)明的組合物包括包含正交氨?；?tRNA合成酶（0-RS)(例如，得自非脊椎動 物生物體，諸如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌（Bacillus stearothermophilus)等）的脊椎 動物細胞（例如，哺乳動物細胞、禽類細胞、魚細胞、爬行動物細胞、兩棲動物細胞、得自非 哺乳動物的細胞等），其中0-RS優(yōu)先在脊椎動物細胞中利用至少一個非天然氨基酸將正交 tRNA(O-tRNA)氨酰化?？扇芜x將指定脊椎動物細胞中的兩個或兩個以上OtRNA氨?；?。一 方面，0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?，這與具有（例如）如SEQ ID NO. :86或45 中所述的氨基酸序列的0-RS例如至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少75 %、至 少80 %或者甚至90 %或90 %以上有效。在一個實施例中，本發(fā)明的0-RS利用非天然氨基 酸將0-tRNA氨酰化，這比0-RS利用天然氨基酸將0-tRNA氨?；行Ю缰辽?0倍、至少 20倍、至少30倍等。
[0011] 在一個實施例中，0-RS或其部分是由如SEQ ID N0. :3-35中任一序列所述的 多聚核苷酸序列或其互補多聚核苷酸序列編碼。在另一實施例中，0-RS包含如SEQ ID NO. :36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列，或其保守變異體。在另一實施例中， 0-RS包含例如與天然存在的酪氨?；滨；?tRNA合成酶（TyrRS)的氨基酸序列至少 90%、至少95%、至少98%、至少99%或至少99. 5%或99. 5%以上一致并且包含兩個或兩 個以上來自A-E組的氨基酸的氨基酸序列。A組包括在與大腸桿菌TyrRS的Tyr37對應的 位置的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或蘇氨酸。B組包括在與大腸桿菌 TyrRS的Asnl26對應的位置的天冬氨酸。C組包括在與大腸桿菌TyrRS的Aspl82對應的位 置的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸。D組包括在與大腸桿菌TyrRS的Phel83對 應的位置的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；并且E組包括在與大腸桿菌TyrRS的Leu 186對應的位置的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨酸或丙氨酸。
[0012] 在另一實施例中，0-RS具有一種或多種相比天然氨基酸改進或增強的針對非天然 氨基酸的酶特性。舉例來說，相比天然氨基酸，改進或增強的針對非天然氨基酸的特性包括 例如較高Km、較低Km、較高kcat、較低kcat、較低kcat/km、較高kcat/km等。
[0013] 脊椎動物細胞還任選包括非天然氨基酸。脊椎動物細胞任選包括正交 tRNA (0-tRNA)(例如，得自非脊椎動物生物體，諸如大腸桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等），其中 0-tRNA識別選擇性密碼子且優(yōu)先通過0-RS利用非天然氨基酸氨?；Ｒ环矫?，0-tRNA例如 以至少45 %、至少50 %、至少60 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或99 %的包 含如SEQ ID N0. : 65中所述的多聚核苷酸序列或在細胞中由如SEQ ID N0. : 65中所述的多 聚核苷酸序列加工的tRNA的效率，介導將非天然氨基酸并入蛋白質中。另一方面，0-tRNA 包含SEQ ID NO. : 65的序列，且0-RS包含選自SEQ ID NO. : 36-63和/或86中任一序列中 所述的氨基酸序列的多肽序列和/或其保守變異體。
[0014] 在另一實施例中，脊椎動物細胞包含包括編碼所關注多肽的多聚核苷酸的核酸， 其中所述多聚核苷酸包含由0-tRNA所識別的選擇性密碼子。一方面，包含非天然氨基酸的 所關注多肽的產率例如為從多聚核苷酸缺乏選擇性密碼子的細胞中獲得天然存在的所關 注多肽的產率的至少2. 5%、至少5%、至少10%、至少25%、至少30%、至少40%、50%或 更多。另一方面，細胞在不存在非天然氨基酸的情況下以一定產率產生所關注多肽，所述產 率例如為在存在非天然氨基酸的情況下多肽產率的不到35%、不到30%、不到20%、不到 15%、不到10%、不到5%、不到2. 5%等。
[0015] 本發(fā)明還提供一種脊椎動物細胞，其包含正交氨?；?tRNA合成酶（0-RS)、正交 tRNA (0-tRNA)、非天然氨基酸和包含編碼所關注多肽的多聚核苷酸的核酸。所述多聚核苷 酸包含由O-tRNA識別的選擇性密碼子。此外，在脊椎動物細胞中，0-RS優(yōu)先利用非天然氨 基酸將正交tRNA(O-tRNA)氨酰化，且所述細胞在不存在非天然氨基酸的情況下以一定產 率產生所關注多肽，所述產率例如為在存在非天然氨基酸的情況下多肽產率的不到30%、 不到20%、不到15%、不到10%、不到5%、不到2. 5%等。
[0016] 包括包含正交tRNA(O-tRNA)的脊椎動物細胞的組合物也為本發(fā)明的特征。通常， 0-tRNA介導在活體內將非天然氨基酸并入蛋白質中，所述蛋白質是由包含由0-tRNA識別 的選擇性密碼子的多聚核苷酸編碼。在一個實施例中，0-tRNA例如以至少45 %、至少50 %、 至少60 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或甚至99 %或99 %以上的包含如SEQ ID N0. :65中所述的多聚核苷酸序列或在細胞中由如SEQ ID N0. :65中所述的多聚核苷酸 序列加工的tRNA的效率，介導將非天然氨基酸并入蛋白質中。在另一實施例中，0-tRNA包 含如SEQ ID N0. :65中所述的多聚核苷酸序列或其保守變異體，或者是由如SEQ ID N0. :65 中所述的多聚核苷酸序列或其保守變異體加工。在另一實施例中，0-tRNA包含可重復利用 的 0-tRNA。
[0017] 在本發(fā)明一方面中，0-tRNA經轉錄后修飾。本發(fā)明還提供一種在脊椎動物細胞中 編碼0-tRNA的核酸，或其互補多聚核苷酸。在一個實施例中，核酸包含A盒和B盒。
[0018] 本發(fā)明還涉及產生例如0-RS或O-tRNA/0-RS對等翻譯組件的方法（和由這些方 法產生的翻譯組件）。舉例來說，本發(fā)明提供產生正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)的方法， 所述0-RS在脊椎動物細胞中優(yōu)先利用非天然氨基酸將正交tRNA氨?；?。所述方法包括例 如（a)在存在非天然氨基酸的情況下，使第一物種的脊椎動物細胞群經歷正選擇，其中所 述脊椎動物細胞各自包含：i)氨酰基-tRNA合成酶（RS)文庫成員，ii)正交tRNA (0-tRNA)， iii)編碼正選擇標記的多聚核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多聚核苷酸；其中在正選擇 下存活的細胞包含在存在非天然氨基酸的情況下將正交tRNA (0-tRNA)氨?；幕钚訰S。 使在正選擇下存活的細胞在不存在非天然氨基酸的情況下經歷負選擇，以除去利用天然氨 基酸將0-tRNA氨?；幕钚訰S。這提供優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨酰化的0-RS。
[0019] 在某些實施例中，將編碼正選擇標記的多聚核苷酸可操作性連接到反應元件，并 且所述細胞另外包含一種多聚核苷酸，其a)編碼調節(jié)由反應元件進行的轉錄的轉錄調節(jié) 蛋白（例如，脊椎動物轉錄調節(jié)蛋白等）；且b)包含至少一個選擇性密碼子。通過利用非 天然氨基酸氨酰化的0-tRNA將非天然氨基酸并入轉錄調節(jié)蛋白中，將會引起正選擇標記 的轉錄。在一個實施例中，轉錄調節(jié)蛋白為轉錄活化蛋白（例如GAL4等），且選擇性密碼子 為琥珀終止密碼子，例如其中所述琥珀終止密碼子位于編碼轉錄活化蛋白的DNA結合結構 域的多聚核苷酸的一部分中，或實質上鄰近編碼轉錄活化蛋白的DNA結合結構域的多聚核 苷酸的一部分。
[0020] 正選擇標記可為多種分子中任一者。在一個實施例中，正選擇標記包含供生長的 營養(yǎng)補充并且所述選擇是在缺乏所述營養(yǎng)補充的培養(yǎng)基上執(zhí)行。在另一實施例中，編碼正 選擇標記的多聚核苷酸例如為ura3、leu2、lys2、lacZ基因、his3 (例如，其中his3基因編 碼咪唑甘油磷酸酯脫水酶，通過提供3-氨基三唑（3-AT)檢測）等。在另一實施例中，編碼 正選擇標記的多聚核苷酸包含選擇性密碼子。
[0021] 與正選擇標記相同，負選擇標記也可為多種分子中的任一者。在某些實施例中，將 編碼負選擇標記的多聚核苷酸可操作性連接到反應元件，轉錄調節(jié)蛋白通過所述反應元件 介導轉錄。通過利用天然氨基酸氨?；腛-tRNA將天然氨基酸并入轉錄調節(jié)蛋白中，將會 引起負選擇標記的轉錄。在一個實施例中，編碼負選擇標記的多聚核苷酸為例如ura3基 因，且負選擇是在包含5-氟乳清酸（5-F0A)的培養(yǎng)基上實現。在另一實施例中，用于負選擇 的培養(yǎng)基包含轉化成通過負選擇標記可檢測的物質的選擇或篩選劑。在本發(fā)明一方面中， 可檢測物質為有毒物質。在一個實施例中，編碼負選擇標記的多聚核苷酸包含選擇性密碼 子。
[0022] 在某些實施例中，正選擇標記和/或負選擇標記包含在存在適當反應物的 情況下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應的多肽。在本發(fā)明一方面中，通過熒光活化細胞分選 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)或通過發(fā)光來檢測正選擇標記和/或負 選擇標記。在某些實施例中，正選擇標記和/或負選擇標記包含基于親和力的篩選標記或 轉錄調節(jié)蛋白。在一個實施例中，同一多聚核苷酸編碼正選擇標記和負選擇標記。
[0023] 在一個實施例中，編碼本發(fā)明的正選擇標記和/或負選擇標記的多聚核苷酸可包 含至少兩個選擇性密碼子，其各自或都可包含至少兩個不同選擇性密碼子或至少兩個相同 選擇性密碼子。
[0024] 其它水平的選擇/篩選嚴格度也可用于本發(fā)明方法中。在一個實施例中，所述方 法可例如包含在步驟（a)、（b)或（a)和（b)中提供不同量的無活性合成酶，其中所述不同 量的無活性合成酶提供另一水平的選擇或篩選嚴格度。在一個實施例中，用于產生0-RS的 方法的步驟（a)、（b)或步驟（a)和（b)包括改變例如正和/或負選擇標記的選擇或篩選嚴 格度。所述方法任選包括使優(yōu)先利用非天然氨基酸將〇-tRNA氨?；?-RS經歷另一回合 選擇，例如另一回合（數回合）正選擇、另一回合（數回合）負選擇或另一回合正和負選擇 的組合。
[0025] 在一個實施例中，選擇/篩選包含一次或多次例如選自氨基酸滲透性改變、翻譯 效率改變、翻譯保真度改變等的正或負選擇/篩選。所述一種或多種改變是建立在一個或 多個編碼用于產生蛋白質的正交tRNA-tRNA合成酶對的組件的多聚核苷酸突變的基礎上。
[0026] 通常，RS文庫（例如，突變型RS文庫）包含由例如來自非脊椎動物生物體的至少 一種氨?；?tRNA合成酶（RS)得到的RS。在一個實施例中，RS文庫是從無活性RS得到， 例如其中所述無活性RS是由使活性RS突變而產生。在另一實施例中，無活性RS包含氨基 酸結合袋并且一個或多個包含所述結合袋的氨基酸經一個或多個不同氨基酸取代，例如所 述經取代氨基酸經丙氨酸取代。
[0027] 在某些實施例中，產生0-RS的方法另外包括對編碼RS的核酸執(zhí)行隨機突變、位 點特異性突變、重組、嵌合構建或其任何組合，從而產生突變型RS文庫。在某些實施例中， 所述方法另外包括例如（c)分離出編碼0-RS的核酸；（d)由所述核酸產生一組編碼突變 型0-RS的多聚核苷酸（例如，通過隨機誘變、位點特異性誘變、嵌合構建、重組或其任何組 合）；和（e)重復步驟（a)和/或（b)，直到獲得優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨酰化的 突變型0-RS。在本發(fā)明一方面中，將步驟（c)-(e)執(zhí)行至少2次。
[0028] 產生O-tRNA/0-RS對的方法也為本發(fā)明的特征。在一個實施例中，如上文所述獲 得0-RS，且通過使第一物種的脊椎動物細胞群（其中所述脊椎動物細胞包含tRNA文庫成 員）經歷負選擇以除去包含經對于脊椎動物細胞為內源性的氨?；?tRNA合成酶（RS)氨 ?；膖RNA文庫成員的細胞，來獲得0-tRNA。這提供與第一物種的脊椎動物細胞正交的 tRNA池。在本發(fā)明一方面中，tRNA文庫包含由例如來自非脊椎動物生物體的至少一個tRNA 得到的tRNA。在本發(fā)明另一方面中，氨?；?tRNA合成酶（RS)文庫包含由例如來自非脊椎 動物生物體的至少一個氨酰基-tRNA合成酶（RS)得到的RS。在本發(fā)明另一方面中，tRNA 文庫包含由來自第一非脊椎動物生物體的至少一個tRNA得到的tRNA。氨?；?tRNA合成 酶（RS)文庫任選包含由來自第二非脊椎動物生物體的至少一個氨酰基-tRNA合成酶（RS) 得到的RS。在一個實施例中，第一與第二非脊椎動物生物體相同。或者，第一與第二非脊椎 動物生物體可不同。由本發(fā)明方法產生的特定O-tRNA/0-RS對也為本發(fā)明的特征。
[0029] 本發(fā)明另一特征為用于在一種物種中產生翻譯組件并將選擇/篩選的翻譯組件 引入第二物種中的方法。舉例來說，在第一物種（例如，脊椎動物物種，諸如酵母等）中產 生O-tRNA/0-RS對的方法另外包括將編碼0-tRNA的核酸和編碼0-RS的核酸引入第二物種 (例如，哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類、植物等）的脊椎動物細胞中。第二物種可使用引入的翻 譯組件在活體內例如在翻譯期間將非天然氨基酸并入正在生長的多肽鏈中。
[0030] 在另一實例中，在脊椎動物細胞中產生優(yōu)先利用非天然氨基酸將正交tRNA氨酰 化的正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)的方法包括：(a)在存在非天然氨基酸的情況下，使 第一物種（例如，脊椎動物物種，諸如酵母等）的脊椎動物細胞群經歷正選擇。第一物種的 脊椎動物細胞各自包含：i)氨?；?tRNA合成酶（RS)文庫成員，ii)正交tRNA (0-tRNA)， iii)編碼正選擇標記的多聚核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多聚核苷酸。在正選擇中存 活的細胞包含在存在非天然氨基酸的情況下將正交tRNA (0-tRNA)氨酰化的活性RS。使在 正選擇下存活的細胞在不存在非天然氨基酸的情況下經歷負選擇，以除去利用天然氨基酸 將0-tRNA氨?；幕钚訰S，從而提供優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?-RS。將 編碼0-tRNA的核酸和編碼0-RS的核酸引入第二物種（例如，哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類、 植物等）的脊椎動物細胞中。當在第二物種中翻譯時，可使用這些組件將非天然氨基酸并 入第二物種中的所關注蛋白質或多肽中。在一個實施例中，將0-tRNA和/或0-RS引入第 二物種的脊椎動物細胞中。
[0031] 在某些實施例中，通過使第一物種的脊椎動物細胞群（其中所述脊椎動物細胞包 含tRNA文庫成員）經歷負選擇以除去包含經對于脊椎動物細胞為內源性的氨?；?tRNA 合成酶（RS)氨酰化的tRNA文庫成員的細胞，來獲得0-tRNA。這提供與第一物種和第二物 種的脊椎動物細胞正交的tRNA池。
[0032] 具有至少一個非天然氨基酸的蛋白質（或所關注多肽）也為本發(fā)明的特征。在 本發(fā)明某些實施例中，具有至少一個非天然氨基酸的蛋白質包括至少一個翻譯后修飾。在 一個實施例中，至少一個翻譯后修飾包含通過[3+2]環(huán)加成將包含第二反應性基團的分子 (例如，染料、例如聚乙二醇衍生物等聚合物、光交聯(lián)劑、細胞毒性化合物、親和標記、生物 素衍生物、樹脂、第二蛋白質或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸 (例如，DNA、RNA等）等）與至少一個包含第一反應性基團的非天然氨基酸連接。舉例來 說，第一反應性基團為炔基部分（例如，在非天然氨基酸對-炔丙基氧基苯丙氨酸中）（這 個基團有時也稱為乙炔部分），且第二反應性基團為疊氮基部分。在另一實例中，第一反應 性基團為疊氮基部分（例如，在非天然氨基酸對疊氮基-L-苯丙氨酸中）且第二反應性基 團為炔基部分。在某些實施例中，本發(fā)明的蛋白質包括至少一個包含至少一個翻譯后修飾 的非天然氨基酸（例如，酮基非天然氨基酸），其中所述至少一個翻譯后修飾包含糖部分。 在某些實施例中，翻譯后修飾是于脊椎動物細胞中在活體內進行。
[0033] 在某些實施例中，蛋白質包括至少一個在活體內由脊椎動物細胞所產生的翻譯后 修飾，其中所述翻譯后修飾通常不是由原核細胞進行。翻譯后修飾的實例包括（但不限于） 乙?；?、酰化、脂質修飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂連接修飾等。在一個實施例 中，翻譯后修飾包含通過GlcNAc-天冬酰胺鍵聯(lián)將寡糖與天冬酰胺連接在一起（例如，寡糖 包含（GlcNAc-Man) 2-Man-GlcNAc-GlcNAc等的情形）。在另一實施例中，翻譯后修飾包含通 過GalNAc-絲氨酸、GalNAc-蘇氨酸、GlcNAc-絲氨酸或GlcNAc-蘇氨酸鍵聯(lián)將寡糖（例如， Gal-GalNA C、Gal-GlcNAc等）與絲氨酸或蘇氨酸連接在一起。在某些實施例中，本發(fā)明的 蛋白質或多肽可包含分泌或定位序列、抗原決定基標簽（epitope tag)、FLAG標簽、聚組氨 酸標簽、GST融合體等。
[0034] 通常，蛋白質與任何可用蛋白質（例如，治療性蛋白質、診斷性蛋白質、工業(yè)酶或 其部分等）例如至少60 %、至少70 %、至少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或甚至至 少99 %或99 %以上一致，且其包含一個或多個非天然氨基酸。在一個實施例中，本發(fā)明的 組合物包括所關注蛋白質或多肽和賦形劑（例如，緩沖液、醫(yī)藥學上可接受的賦形劑等）。
[0035] 所關注蛋白質或多肽可含有至少一個、至少兩個、至少三個、至少四個、至少五個、 至少六個、至少七個、至少八個、至少九個或者十個或十個以上非天然氨基酸。非天然氨基 酸可相同或不同，例如可在蛋白質中1、2、3、4、5、6、7、8、9、10個或更多不同位點包含1、2、 3、4、5、6、7、8、9、10個或更多不同非天然氨基酸。在某些實施例中，天然存在的蛋白質型式 中所存在的至少一個（但少于全部）特定氨基酸經非天然氨基酸取代。
[0036] 蛋白質（或所關注多肽）的實例包括（但不限于）例如，細胞因子、生長因子、 生長因子受體、干擾素、白細胞介素、炎癥分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、類固 醇激素受體、促紅細胞生成素（EP0)、胰島素、人生長激素、ci-1抗胰蛋白酶、血管抑素 (Angiostatin)、抗溶血因子（Antihemolytic factor)、抗體、載脂蛋白、脫輔基蛋白、心房 利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、Gro-a、Gro-b、 Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit 配體、細胞因子、CC 趨化因 子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎癥蛋 白-1 a、單核細胞炎癥蛋白-1 p、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、 T64262、CD40、CD40配體、C-kit配體、膠原蛋白、群落刺激因子（CSF)、補體因子5a、補體抑 制劑、補體受體1、細胞因子、DHFR、上皮中性粒細胞活化肽-78、GR〇a /MGSA、GR〇P、GR〇y、 MIP-1 a、MIP-1 S、MCP-1、表皮生長因子（EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、促紅細胞生成素 (EP0)、脫落毒素、因子IX、因子VII、因子VIII、因子X、成纖維細胞生長因子（FGF)、纖維蛋 白原、纖維粘連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、生長因子、生長因子受體、 刺猬蛋白（hedgehog protein)、血紅蛋白、肝細胞生長因子（HGF)、水蛭素（hirudin)、人 血清白蛋白、ICAM-1、ICAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、胰島素、類胰島素生長因子（IGF)、 IGF-I、IGF-II、干擾素（IFN)、IFN-a、IFN-P、IFN-y、白細胞介素、IL-l、IL-2、IL-3、IL-4、 IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子（KGF)、乳鐵蛋白、 白血病抑制因子、熒光素酶、神經營養(yǎng)因子、中性粒細胞抑制因子（NIF)、抑瘤素M、成骨蛋 白、癌基因產物、甲狀旁腺激素、PD-ECSF、H)GF、肽激素、人生長激素、多效生長因子、蛋白質 A、蛋白質G、致熱性外毒素A、B或C、松馳素、腎素、SCF、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超 抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物 歧化酶（SOD)、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺肽a 1、組織型纖溶酶原活化劑、腫瘤生長因子 (TGF)、TGF-a、TGF-0、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子0、腫瘤壞死因子 受體（TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子（VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、 Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL 受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、透明質酸（hyalurin) /CD44、 皮質酮、存在于Genebank或其它可用數據庫中的蛋白質等，和/或其部分。在一個實施例 中，所關注多肽包括轉錄調節(jié)蛋白（例如，轉錄活化蛋白（諸如GAL4)或轉錄阻遏蛋白等） 或其部分。
[0037] 本發(fā)明的脊椎動物細胞提供合成包含大量有用非天然氨基酸的蛋白質的能力。舉 例來說，可產生在細胞提取物、緩沖液、醫(yī)藥學上可接受的賦形劑等中濃度為例如至少10 微克/升、至少50微克/升、至少75微克/升、至少100微克/升、至少200微克/升、至 少250微克/升或至少500微克/升或更多蛋白質的包含非天然氨基酸的蛋白質。在某些 實施例中，本發(fā)明的組合物包括例如至少10 U g、至少50 y g、至少75 y g、至少100 y g、至少 200 ii g、至少250 ii g或至少500 ii g或更多包含非天然氨基酸的蛋白質。
[0038] 在某些實施例中，所關注蛋白質或多肽（或其部分）是由核酸編碼。通常，核酸包 含至少一個選擇性密碼子、至少兩個選擇性密碼子、至少三個選擇性密碼子、至少四個選擇 性密碼子、至少五個選擇性密碼子、至少六個選擇性密碼子、至少七個選擇性密碼子、至少 八個選擇性密碼子、至少九個選擇性密碼子或甚至十個或十個以上選擇性密碼子。
[0039] 本發(fā)明還提供用于在脊椎動物細胞中產生至少一種包含至少一個非天然氨基酸 的蛋白質的方法（以及由所述方法產生的蛋白質）。所述方法包括例如使包含包括至少一 個選擇性密碼子且編碼蛋白質的核酸的脊椎動物細胞在適當培養(yǎng)基中生長。脊椎動物細胞 還包含正交tRNA(O-tRNA)，其在細胞中起作用并且識別選擇性密碼子；和正交氨酰基tRNA 合成酶（0-RS)，其優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨酰化；并且所述培養(yǎng)基包含非天然氨 基酸。在一個實施例中，0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?，這與具有（例如）如SEQ ID N0. :86或45中所述序列的氨基酸序列的0-RS例如至少45%、至少50%、至少60%、至 少75 %、至少80 %、至少90 %、至少95 %或者甚至99 %或99 %以上有效。在另一實施例中， 0-tRNA包含SEQ ID N0. : 64或65或者其互補多聚核苷酸序列；由SEQ ID N0. : 64或65或 者其互補多聚核苷酸序列加工；或由SEQ ID N0. :64或65或者其互補多聚核苷酸序列編 碼。在另一實施例中，CKRS包含如SEQ ID N0. : 36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸 序列。
[0040] 在一個實施例中，所述方法另外包括將非天然氨基酸并入蛋白質中，其中所述非 天然氨基酸包含第一反應性基團；和使所述蛋白質與包含第二反應性基團的分子（例如， 染料、例如聚乙二醇衍生物等聚合物、光交聯(lián)劑、細胞毒性化合物、親和標記、生物素衍生 物、樹脂、第二蛋白質或多肽、金屬螯合劑、輔因子、脂肪酸、碳水化合物、多聚核苷酸（例 如，DNA、RNA等）等）接觸。第一反應性基團與第二反應性基團反應以通過[3+2]環(huán)加成將 所述分子與非天然氨基酸連接。在一個實施例中，第一反應性基團為炔基或疊氮基部分且 第二反應性基團為疊氮基或炔基部分。舉例來說，第一反應性基團為炔基部分（例如，在非 天然氨基酸對炔丙基氧基苯丙氨酸中）且第二反應性基團為疊氮基部分。在另一實例中， 第一反應性基團為疊氮基部分（例如，在非天然氨基酸對疊氮基-L-苯丙氨酸中）且第二 反應性基團為炔基部分。
[0041] 在某些實施例中，所編碼的蛋白質包含治療性蛋白質、診斷性蛋白質、工業(yè)酶或其 部分。在一個實施例中，由所述方法產生的蛋白質進一步通過非天然氨基酸來得以修飾。 舉例來說，例如通過親核-親電反應、[3+2]環(huán)加成等來修飾非天然氨基酸。在另一實施例 中，在活體內通過至少一個翻譯后修飾（例如，N-糖基化、0-糖基化、乙酰化、?；?、脂質修 飾、棕櫚?；?、棕櫚酸鹽加成、磷酸化、糖脂連接修飾等）來修飾由所述方法產生的蛋白質。 [0042] 還提供產生篩選或選擇轉錄調節(jié)蛋白的方法（以及由所述方法產生的篩選或選 擇轉錄調節(jié)蛋白）。所述方法包括例如選擇第一多聚核苷酸序列，其中所述多聚核苷酸序 列編碼核酸結合結構域；和使所述第一多聚核苷酸序列突變以包括至少一個選擇性密碼 子。這將提供篩選或選擇多聚核苷酸序列。所述方法還包括例如選擇第二多聚核苷酸序 列，其中所述第二多聚核苷酸序列編碼轉錄活化結構域；提供包含可操作性連接到第二多 聚核苷酸序列的篩選或選擇多聚核苷酸序列的構建體；和將所述構建體、非天然氨基酸、正 交tRNA合成酶（0-RS)和正交tRNA(O-tRNA)引入細胞中。利用這些組件，0-RS優(yōu)先利用 非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?，且0-tRNA識別選擇性密碼子，并響應篩選或選擇多聚核苷 酸序列中的選擇性密碼子將非天然氨基酸并入核酸結合結構域中。這將提供篩選或選擇轉 錄調節(jié)蛋白。
[0043] 在某些實施例中，本發(fā)明的組合物和方法包括脊椎動物細胞。本發(fā)明的脊椎動物 細胞包括例如哺乳動物細胞、酵母細胞、真菌細胞、植物細胞、昆蟲細胞等中的任一種。本發(fā) 明的翻譯組件可得自多種生物體，例如非脊椎動物生物體，諸如原核生物體（例如，大腸桿 菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等）或古細菌；或例如脊椎動物生物體。
[0044] 本發(fā)明的選擇性密碼子將擴充脊椎動物蛋白質生物合成機器的遺傳密碼子框架。 多個選擇性密碼子中的任一個可用于本發(fā)明中，包括終止密碼子（例如，琥珀密碼子、赭石 密碼子或蛋白石終止密碼子）、無義密碼子、稀有密碼子、四（或更多）堿基密碼子等。 [0045] 可用于本文所述的組合物和方法中的非天然氨基酸的實例包括（但不限于） ： 對-乙?；?L-苯丙氨酸；對-碘-L-苯丙氨酸；0-甲基-L-酪氨酸；對-炔丙基氧基苯 丙氨酸；對-炔丙基-苯丙氨酸；L-3-(2-萘基）丙氨酸；3-甲基-苯丙氨酸；0-4-烯丙 基-L-酪氨酸；4-丙基-L-酪氨酸；三-0-乙?；?GlcNAc 0 -絲氨酸；L-多巴（L-Dopa); 氟化苯丙氨酸；異丙基-L-苯丙氨酸；對-疊氮基-L-苯丙氨酸；對-?；?L-苯丙氨酸； 對-苯甲?；?L-苯丙氨酸；L-磷酸絲氨酸；膦酸絲氨酸；膦酸酪氨酸；對-溴苯丙氨酸； 對-氨基-L-苯丙氨酸；異丙基-L-苯丙氨酸；酪氨酸氨基酸的非天然類似物；谷氨酰胺氨 基酸的非天然類似物；苯丙氨酸氨基酸的非天然類似物；絲氨酸氨基酸的非天然類似物； 蘇氨酸氨基酸的非天然類似物；烷基、芳基、?；?、疊氮基、氰基、鹵基、肼、酰肼、羥基、烯基、 炔基、醚、硫醇、磺酰基、硒基、酯、硫代酸、硼酸酯基（borate)、硼酸酯基（boronate)、磷酸 基、膦酸基、膦、雜環(huán)、烯酮、亞胺、醛、羥胺、酮基或氨基取代的氨基酸，或其任何組合；具有 可光活化交聯(lián)劑的氨基酸；自旋標記的氨基酸；發(fā)熒光氨基酸；結合金屬的氨基酸；含金屬 氨基酸；放射性氨基酸；光籠蔽（photocaged)和/或光致異構化氨基酸；含生物素或生物 素類似物氨基酸；含酮基氨基酸；包含聚乙二醇或聚醚的氨基酸；重原子取代的氨基酸；化 學可裂解或可光裂解氨基酸；具有伸長側鏈的氨基酸；含有毒基團的氨基酸；糖取代的氨 基酸；含碳連接的糖的氨基酸；具有氧化還原活性的氨基酸；含a -羥基的酸；氨基硫代 酸；a，a雙取代氨基酸邛-氨基酸；除脯氨酸或組氨酸外的環(huán)狀氨基酸；除苯丙氨酸、酪 氨酸或色氨酸外的芳香族氨基酸等。
[0046] 本發(fā)明還提供多肽（0-RS)和多聚核苷酸，例如0-tRNA、編碼0-RS或其部分（例 如，合成酶活性位點）的多聚核苷酸、用于構建氨酰基-tRNA合成酶突變體的寡聚核苷酸、 編碼所關注蛋白質或多肽的包含一個或多個選擇性密碼子的多聚核苷酸等。舉例來說，本 發(fā)明的多肽包括：包含如SEQ ID N0. :36-63和/或86中任一序列中所述的氨基酸序列的 多肽；包含由如SEQ ID N0. :3-35中任一序列所述的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列的 多肽；以及與對包含如SEQ ID N0. : 36-63和/或86中任一序列中所示的氨基酸序列的多 肽具特異性的抗體特異性免疫反應的多肽；或包含由如SEQ ID N0. :3-35中任一序列所示 的多聚核苷酸序列編碼的氨基酸序列的多肽。
[0047] 本發(fā)明的多肽中還包括包含與天然存在的酪氨酰基氨?；?tRNA合成酶（TyrRS) 的氨基酸序列（例如，SEQ ID NO. :2)至少90%-致的氨基酸序列且包含兩個或兩個以 上A-E組（上文所述）氨基酸的多肽。類似地，本發(fā)明的多肽還任選包括包含SEQ ID NO. : 36-63和/或86中任一序列的至少20個相鄰氨基酸以及兩個或兩個以上如上文在A-E 組中所述的氨基酸取代的多肽。還包括包含任一上述多肽的保守變異體的氨基酸序列作為 本發(fā)明的多肽。
[0048] 在一個實施例中，組合物包括本發(fā)明的多肽和賦形劑（例如，緩沖液、水、醫(yī)藥學 上可接受的賦形劑等）。本發(fā)明還提供與本發(fā)明的多肽特異性免疫反應的抗體或抗血清。[0049] 本發(fā)明中還提供多聚核苷酸。本發(fā)明的多聚核苷酸包括具有一個或多個選擇性 密碼子的編碼本發(fā)明的所關注蛋白質或多肽的多聚核苷酸。此外，本發(fā)明的多聚核苷酸包 括例如：包含如SEQ ID N0. :3-35、64-85中任一序列所述的核苷酸序列的多聚核苷酸；與 其多聚核苷酸序列互補或編碼其多聚核苷酸序列的多聚核苷酸；和/或編碼包含如SEQ ID NO. : 36-63和/或86中任一序列中所述的氨基酸序列的多肽的多聚核苷酸，或其保守變異 體。本發(fā)明的多聚核苷酸還包括編碼本發(fā)明的多肽的多聚核苷酸。類似地，在高度嚴格條件 下在實質上整個核酸長度上與上文所述的多聚核苷酸雜交的核酸為本發(fā)明的多聚核苷酸。
[0050] 本發(fā)明的多聚核苷酸還包括編碼多肽的多聚核苷酸，所述多肽包含與天然存在的 酪氨?；滨；?tRNA合成酶（TyrRS)的氨基酸序列（例如，SEQ ID N0. : 2)至少90% - 致的氨基酸序列且包含兩個或兩個以上如上文在A-E組（上文指出）中所述的突變。本發(fā) 明的多聚核苷酸中還包括與上文所述的多聚核苷酸至少70% (或至少75%、至少80%、至 少85 %、至少90 %、至少95 %、至少98 %或至少99 %或更多）一致的多聚核苷酸，和/或包 含任一上文所述的多聚核苷酸的保守變異體的多聚核苷酸。
[0051] 在某些實施例中，載體（例如，質粒、柯斯質粒（cosmid)、噬菌體、病毒等）包含本 發(fā)明的多聚核苷酸。在一個實施例中，載體為表達載體。在另一實施例中，表達載體包括可 操作性連接到一個或多個本發(fā)明的多聚核苷酸的啟動子。在另一實施例中，細胞包含包括 本發(fā)明的多聚核苷酸的載體。
[0052] 另一方面，本發(fā)明提供化合物的組合物和制造所述化合物的方法。舉例來說，化合 物包括例如非天然氨基酸（諸如對_(炔丙基氧基）_苯丙氨酸（例如，圖11中的1));疊氮 基染料（諸如化學結構4和化學結構6中所示）；炔基聚乙二醇（例如，如化學結構7中所 示），其中n為介于例如50與10, 000之間、75與5, 000之間、100與2, 000之間、100與1，000 之間等的整數等。在本發(fā)明的實施例中，炔基聚乙二醇具有例如約5, 000到約100, OOODa、 約 20, 000 到約 50, OOODa、約 20, 000 到約 10, OOODa (例如，20, OOODa)的分子量。
[0053] 還提供包含這些化合物，例如具有蛋白質和細胞的各種組合物。一方面，包括 對_ (炔丙基氧基）_苯丙氨酸非天然氨基酸的組合物進一步包括正交tRNA。可將非天然氨 基酸與正交tRNA鍵接（例如共價鍵接），例如通過氨?；I與正交tRNA共價鍵接、與正交 tRNA的末端核糖的3' 0H或2' 0H共價鍵接。
[0054] 試劑盒也為本發(fā)明的特征。舉例來說，提供在細胞中產生包含至少一個非天然 氨基酸的蛋白質的試劑盒，其中所述試劑盒包括含有編碼0-tRNA的多聚核苷酸序列或 0-tRNA以及編碼0-RS的多聚核苷酸序列或0-RS的容器。在一個實施例中，試劑盒另外包 括至少一個非天然氨基酸。在另一實施例中，試劑盒另外包含用于產生蛋白質的說明材料。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0055] 圖1繪示將對乙?；奖彼岵⑷雋GH中。
[0056] 圖2繪示將各種濃度的對乙?；奖彼岵⑷雋GH中。
[0057] 圖3繪示實例3結果的長條圖；其中y軸顯示Fc滴定濃度（毫克/毫升），x軸顯 示具有不同pAFRS/I21/4xhtRNA比例的CH0細胞。

【具體實施方式】
[0058] 在詳細描述本發(fā)明之前，應了解，本發(fā)明不限于特定裝置或生物系統(tǒng)，其當然可以 變化。還應了解，本文所使用的術語只是出于描述特定實施例的目的，并且不打算限制本發(fā) 明。除非內容另作明確指示，否則如本說明書和隨附權利要求中所使用，單數形式"一"和 "所述"包括多個參考物。因此，例如提及"一細胞"包括兩個或兩個以上細胞的組合；提及 "細菌"包括細菌混合物等。
[0059] 除非本文或下文說明書的剩余部分中另作定義，否則本文所使用的所有科技術語 都具有與本發(fā)明所屬領域技術人員通常所了解相同的含義。
[0060] 厘遞：當蛋白質和/或蛋白質序列是天然或以人工方式從共同的祖先蛋白質或蛋 白質序列得到時，其為"同源"的。類似地，當核酸和/或核酸序列是天然或以人工方式從共 同的祖先核酸或核酸序列得到時，其為同源的。舉例來說，可通過任何可用的誘變方法來修 飾任何天然存在的核酸以使其包括一個或多個選擇性密碼子。當表達時，這一經誘變核酸 將編碼包含一個或多個非天然氨基酸的多肽。當然，突變方法可另外改變一個或多個標準 密碼子，從而也使所得突變蛋白質中的一個或多個標準氨基酸改變。同源性一般是從兩種 或兩種以上核酸或蛋白質（或其序列）之間的序列相似性推斷得出。可用于確定同源性的 序列之間相似性的確切百分比隨所討論的核酸和蛋白質而變化，但通常使用僅25%的序列 相似性來確定同源性。較高的序列相似性水平（例如，30%、40 %、50 %、60 %、70 %、80 %、 90%、95%或99%或更多）也可用于確定同源性。測定序列相似性百分比的方法（例如，使 用默認參數的BLASTP和BLASTN)在本文中得以描述并且一般可用。
[0061] 正交:如本文所使用，術語"正交"是指與對于細胞或翻譯系統(tǒng)為內源的相應分子 相比，以降低的效率利用細胞的內源性組件起作用，或者無法利用細胞的內源性組件起作 用的分子（例如，正交tRNA (O-tRNA)和/或正交氨酰基tRNA合成酶（0-RS))。在tRNA和 氨?；?tRNA合成酶的情況下，正交是指與利用內源性tRNA合成酶起作用的內源性tRNA 相比，正交tRNA無法利用內源性tRNA合成酶起作用或以降低的效率（例如，低于20%的 效率、低于10 %的效率、低于5 %的效率或低于1 %的效率）利用內源性tRNA合成酶起作 用；或者與利用內源性tRNA起作用的內源性tRNA合成酶相比，正交氨酰基-tRNA合成酶無 法利用內源性tRNA起作用或以降低的效率（例如，低于20%的效率、低于10%的效率、低 于5%的效率或低于1 %的效率）利用內源性tRNA起作用。正交分子在細胞中缺乏功能性 內源互補分子。舉例來說，當與通過內源性RS將內源性tRNA氨?；啾容^時，細胞中的任 何內源性RS以降低的效率或甚至為零的效率將所述細胞中的正交tRNA氨酰化。在另一實 例中，當與通過內源性RS將內源性tRNA氨?；啾容^時，正交RS以降低的效率或甚至為 零的效率將所關注細胞中的任何內源性tRNA氨?；??？蓪⒌诙环肿右爰毎袕亩?與第一正交分子一起作用。舉例來說，正交tRNA/RS對包括所引入的在細胞中相對于相應 內源性tRNA/RS對以一定效率（例如，50 %效率、60 %效率、70 %效率、75 %效率、80 %效率、 90 %效率、95 %效率或99 %或更高效率）一起作用的互補組件。
[0062]互補:術語"互補"是指可一起作用的正交對0-tRNA與0-RS的組件，例如其中 0-RS將0-tRNA氨?；?。
[0063]優(yōu)先氨?；盒g語"優(yōu)先氨?；?，是指與0-RS將天然存在的tRNA或用于產生 0-tRNA的原材料氨酰化相比，0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨酰化的效率，例如70% 效率、75%效率、85%效率、90%效率、95%效率或99%或更高效率。將非天然氨基酸以高保 真度，例如以對指定選擇性密碼子高于75%的效率、對指定選擇性密碼子高于約80%的效 率、對指定選擇性密碼子高于約90%的效率、對指定選擇性密碼子高于約95%的效率或對 指定選擇性密碼子高于約99%或更高效率并入正在生長的多肽鏈中。
[0064]詵擇件密碼子:術語"選擇性密碼子"是指在翻譯過程中由0-tRNA識別且不被內 源性tRNA識別的密碼子。0-tRNA反密碼子環(huán)識別mRNA上的選擇性密碼子并且在多肽中的 這一位點并入其氨基酸，例如非天然氨基酸。選擇性密碼子可例如包括無義密碼子，諸如終 止密碼子，例如琥珀密碼子、赭石密碼子和蛋白石密碼子；四個或四個以上堿基的密碼子； 稀有密碼子；從天然或非天然堿基對獲得的密碼子等。
[0065]抑制件tRNA:抑制性tRNA是（例如）通過提供響應選擇性密碼子將氨基酸并入多 肽鏈的機制來改變指定翻譯系統(tǒng)中信使RNA (mRNA)的閱讀的tRNA。舉例來說，抑制性tRNA 可通讀例如終止密碼子、四堿基密碼子或稀有密碼子等。
[0066]可重復利用tRNA:術語"可重復利用tRNA"是指在翻譯期間經氨?；铱衫冒?基酸（例如非天然氨基酸）反復地再氨?；詫⑺霭被幔ɡ绶翘烊话被幔┎⑷胍?個或多個多肽鏈中的tRNA。
[0067]翻譯系統(tǒng):術語"翻譯系統(tǒng)"是指將天然存在的氨基酸并入正在生長的多肽鏈（蛋 白質）的組件集合。翻譯系統(tǒng)的組件可包括例如核糖體、tRNA、合成酶、mRNA、氨基酸等。本 發(fā)明的組件（例如，0RS、0tRNA、非天然氨基酸等）可添加到活體外或活體內翻譯系統(tǒng)中，例 如脊椎動物細胞，例如酵母細胞、哺乳動物細胞、植物細胞、藻類細胞、真菌細胞、昆蟲細胞 等。
[0068] 非天然氨基酸:如本文所使用，術語"非天然氨基酸"是指不為20種常見的天然存 在的氨基酸中的一種或者硒代半胱氨酸或吡咯賴氨酸的任何氨基酸、經修飾氨基酸和/或 氨基酸類似物。
[0069] 晝轟:如本文所使用，術語"得自"是指從特定分子或生物體分離或者使用來自特 定分子或生物體的信息制得的組件。
[0070]無活性RS:如本文所使用，術語"無活性RS"是指已突變以致其無法再利用氨基酸 將其天然同源tRNA氨酰化的合成酶。
[0071] if詵擇或篩詵標記:如本文所使用，術語"正選擇或篩選標記"是指當存在（例如， 經表達、經活化等）時導致將具有正選擇標記的細胞從不具有正選擇標記的細胞中鑒別出 的標記。
[0072]負詵擇或篩詵標記:如本文所使用，術語"負選擇或篩選標記"是指當存在（例如， 經表達、經活化等）時使得鑒別出不具有所需特性（例如，當與具有所需特性的細胞相比較 時）的細胞的標記。
[0073] 報告基因：如本文所使用，術語"報告基因"是指可用于選擇所關注系統(tǒng)中的革巴 組件的組件。舉例來說，報告基因可包括熒光篩選標記（例如，綠色熒光蛋白質）；發(fā)光標 記（例如，螢火蟲熒光素酶蛋白）；基于親和力的篩選標記；或可選擇標記基因，諸如his3、 ura3、leu2、lys2、lacZ、0 -gal/lacZ ( 0 -半乳糖苷酶）、Adh (醇脫氫酶）等。
[0074] 脊椎動物：如本文所使用，術語"脊椎動物"是指屬于系統(tǒng)發(fā)生域真核生物的生物 體，諸如動物，例如哺乳動物、爬行動物、鳥類等。
[0075] 非真核生物:如本文所使用，術語"非真核生物"是指非脊椎動物生物體。舉例來 說，非脊椎動物生物體可屬于真細菌（例如，大腸桿菌（Escherichia coli)、極端嗜熱細菌 (Thermus thermophilics)、嗜熱脂肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus)等）系統(tǒng) 發(fā)生域；或古細菌（例如，詹氏甲燒球菌（Methanococcus jannaschii)、嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌 (Methanobacterium thermoautotrophicum)、諸如沃氏嗜鹽富饒菌（Haloferax volcanii) 和嗜鹽菌屬 NRC_l(Halobacterium species NRC-1)的嗜鹽菌（Halobacterium)、超嗜熱 古菌（Archaeoglobus fulgidus)、強烈嗜熱球菌（Pyrococcus furiosus)、極端嗜熱古菌 (Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細菌（Aeuropyrum pernix)等）系統(tǒng)發(fā)生域。
[0076] 抗述:如本文所使用，術語"抗體"包括（但不限于）實質上由一個或多個特異性 結合并識別分析物（抗原）的免疫球蛋白基因或其片段所編碼的多肽。實例包括多克隆抗 體、單克隆抗體、嵌合抗體和單鏈抗體等。如本文所使用的術語"抗體"中也包括免疫球蛋白 的片段，包括Fab片段和由表達文庫（包括噬菌體呈現）所產生的片段。有關抗體結構和 技術例如參看 Paul, Fundamental Immunology,第 4 版，1999，Raven Press, New York。 [0077] 保守變異體：術語"保守變異體"是指在功能上與得到保守變異體的組件(例如 0-tRNA或0-RS)類似但序列變異的翻譯組件，例如保守變異體0-tRNA或保守變異體0-RS。 舉例來說，0-RS將利用非天然氨基酸將互補0-tRNA或保守變異體0-tRNA氨酰化，但所 述0-tRNA和所述保守變異體0-tRNA不具有相同序列。保守變異體的序列可具有例如一 處變異、兩處變異、三處變異、四處變異或者五處或五處以上變異，只要保守變異體與相應 0-tRNA或0-RS互補即可。
[0078] 詵擇或篩詵劑:如本文所使用，術語"選擇或篩選劑"是指當存在時允許從群體中 選擇/篩選某些組件的試劑。舉例來說，選擇或篩選劑例如包括（但不限于）養(yǎng)分、抗生素、 光波長、抗體、經表達多聚核苷酸（例如，轉錄調節(jié)蛋白）等?？衫缤ㄟ^濃度、強度等來改 變選擇劑。
[0079]可檢測物質：如本文所使用，術語"可檢測物質"是指當經活化、改變、表汰等時允 許從群體中選擇/篩選出某些組分的試劑。舉例來說，可檢測物質可為化學劑，例如5-氟 乳清酸（5-F0A)，其在某些條件下，例如表達URA3報告基因時，變?yōu)槔鐨⑺辣磉_URA3報告 基因的細胞的可檢測的有毒產物。
[0080] 除由遺傳密碼所強加的化學約束外，直接在脊椎動物細胞中基因修飾蛋白質結構 的能力將提供探查和操縱細胞過程的有力的分子工具。本發(fā)明提供擴充脊椎動物細胞中基 因編碼的氨基酸數量的翻譯組件。其包括tRNA (例如，正交tRNA (0-tRNA))、氨?；?tRNA 合成酶（例如，正交合成酶（0-RS))、0-tRNA/0-RS對和非天然氨基酸。
[0081] 通常，有效地表達和加工本發(fā)明的0-tRNA且其在脊椎動物細胞中的翻譯過程中 起作用，但不會被宿主的氨?；?tRNA合成酶有效氨酰化。在mRNA翻譯期間，本發(fā)明的 0-tRNA響應選擇性密碼子將不編碼常見20種氨基酸中的任一種的非天然氨基酸遞送到正 在生長的多肽鏈中。
[0082] 本發(fā)明的0-RS在脊椎動物細胞中優(yōu)先利用非天然氨基酸將本發(fā)明的0-tRNA氨酰 化，但不會將任何細胞質中宿主的tRNA氨酰化。此外，本發(fā)明的氨?；?tRNA合成酶的特 異性使得能接受非天然氨基酸，同時排除任何內源性氨基酸。包括例如0-RS的氨基酸序列 的多肽或其部分也為本發(fā)明的特征。此外，編碼翻譯組件0-tRNA、0-RS和其部分的多聚核 苷酸為本發(fā)明的特征。
[0083] 本發(fā)明還提供產生所需翻譯組件（例如）0-RS和或正交對（正交tRNA和正交氨 ?；?tRNA合成酶）的方法，所述正交對利用非天然氨基酸用于脊椎動物細胞中，（和由所 述方法產生的翻譯組件）。舉例來說，來自大腸桿菌的酪氨酰-tRNA合成酶/tRNA euA對為本 發(fā)明的O-tRNA/0-RS對。此外，本發(fā)明還提供在一種脊椎動物細胞中選擇/篩選翻譯組件 并且當選擇/篩選后將這些組件用于不同脊椎動物細胞（未用于選擇/篩選的脊椎動物細 胞）中的方法。舉例來說，可在酵母（例如釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae))中進 行產生用于脊椎動物細胞的翻譯組件的選擇/篩選方法，且隨后可將這些所選組件用于另 一脊椎動物細胞中，例如另一酵母細胞、哺乳動物細胞、昆蟲細胞、植物細胞、真菌細胞等。
[0084] 本發(fā)明進一步提供在脊椎動物細胞中產生蛋白質的方法，其中所述蛋白質包含非 天然氨基酸。所述蛋白質是使用本發(fā)明的翻譯組件產生。本發(fā)明還提供包括非天然氨基酸 的蛋白質（和由本發(fā)明的方法產生的蛋白質）。所關注蛋白質或多肽還可包括翻譯后修飾， 其例如是通過[3+2]環(huán)加成或親核_親電反應添加，并非由原核細胞所產生等。在某些實 施例中，利用非天然氨基酸產生轉錄調節(jié)蛋白的方法（和由所述方法產生的蛋白質）也都 包括在本發(fā)明中。包括包含非天然氨基酸的蛋白質的組合物也為本發(fā)明的特征。
[0085] 用于產生具有非天然氨基酸的蛋白質或多肽的試劑盒也為本發(fā)明的特征。
[0086] 正交氨?；?TRNA合成酶（0-RS)
[0087]為了將非天然氨基酸特異性并入脊椎動物細胞中的所關注蛋白質或多肽中，將改 變合成酶的底物特異性，以致僅將所需非天然氨基酸而非常見20種氨基酸中任一種裝入 tRNA中。如果正交合成酶混雜，那么其將產生在靶位置具有天然與非天然氨基酸的混合 物的突變蛋白質。本發(fā)明提供對特定非天然氨基酸具有經修飾的底物特異性的正交氨酰 基-tRNA合成酶的組合物以及產生所述合成酶的方法。
[0088] 包括正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)的脊椎動物細胞為本發(fā)明的特征。0-RS在 脊椎動物細胞中優(yōu)先利用非天然氨基酸將正交tRNA(0-tRNA)氨?；Ｔ谀承嵤├?， 0-RS利用一個以上非天然氨基酸，例如兩個或兩個以上、三個或三個以上等。因此，本發(fā)明 的0-RS可具有優(yōu)先利用不同非天然氨基酸將0-tRNA氨?；哪芰Α＿@允許通過選擇將何 種非天然氨基酸或非天然氨基酸組合放于細胞中和/或通過選擇不同量的放于細胞中的 非天然氨基酸以供其并入來達到另一層面的控制。
[0089] 本發(fā)明的0-RS任選具有一種或多種相比天然氨基酸改進或增強的針對非天然氨 基酸的酶特性。這些特性包括例如與天然存在的氨基酸（例如，20種已知常見氨基酸中的 一種）相比較，針對非天然氨基酸的較高Km、較低Km、較高kcat、較低kcat、較低kcat/km、 較高kcat/km等。
[0090] 可任選通過包括0-RS的多肽和/或編碼0-RS或其部分的多聚核苷酸將0-RS提 供到脊椎動物細胞中。舉例來說，0-RS或其部分是由如SEQ ID N0. :3-35中任一序列所 述的多聚核苷酸序列或其互補多聚核苷酸序列編碼。在另一實例中，0-RS包含如SEQ ID NO. : 36-63和/或86中任一序列所述的氨基酸序列，或其保守變異體。關于例示性0-RS分 子的序列，例如參看本文中表5、6和8以及實例6。
[0091] 0-RS還可包含與天然存在的酪氨酰基氨酰基-tRNA合成酶（TyrRS)的氨基酸序 列（例如，如SEQ ID N0. :2中所述）例如至少90%、至少95%、至少98%、至少99%或甚 至至少99. 5 %-致且包含兩個或兩個以上A-E組的氨基酸的氨基酸序列。A組包括在與大 腸桿菌TyrRS的Tyr37對應的位置的纈氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、甘氨酸、絲氨酸、丙氨酸或 蘇氨酸；B組包括在與大腸桿菌TyrRS的Asnl26對應的位置的天冬氨酸；C組包括在與大腸 桿菌TyrRS的Asp 182對應的位置的蘇氨酸、絲氨酸、精氨酸、天冬酰胺或甘氨酸；D組包括 在與大腸桿菌TyrRS的Phel83對應的位置的甲硫氨酸、丙氨酸、纈氨酸或酪氨酸；且E組包 括在與大腸桿菌TyrRS的Leul86對應的位置的絲氨酸、甲硫氨酸、纈氨酸、半胱氨酸、蘇氨 酸或丙氨酸。也例如參看本文中的表4、表6和表8。
[0092] 除0-RS外，本發(fā)明的脊椎動物細胞還可包括其它組件，例如非天然氨基酸。脊椎 動物細胞還包括正交tRNA (0-tRNA)(例如，得自非脊椎動物生物體，諸如大腸桿菌、嗜熱脂 肪芽孢桿菌等），其中0-tRNA識別選擇性密碼子且優(yōu)先通過0-RS利用非天然氨基酸氨酰 化。所述細胞中還可存在包含編碼所關注多肽的多聚核苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸 包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子或者一個或多個所述密碼子的組合。
[0093] 一方面，0-tRNA例如以至少45%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至 少90%、至少95%或99%的包含如SEQ ID N0. :65中所述的多聚核苷酸序列或由如SEQ ID NO. :65中所述的多聚核苷酸序列加工的tRNA的效率，介導將非天然氨基酸并入蛋白質中。 另一方面，0-tRNA 包含 SEQ ID N0. :65,且 0-RS 包含 SEQ ID N0. :36-63 和 / 或 86 中任一 序列中所述的多肽序列和/或其保守變異體。關于例示性0-RS和0-tRNA分子的序列，也 例如參看本文中表5和實例6。
[0094] 在一個實例中，脊椎動物細胞包含正交氨?；?tRNA合成酶（0-RS)、正交 tRNA (0-tRNA)、非天然氨基酸和包含編碼所關注多肽的多聚核苷酸的核酸，所述多聚核苷 酸包含由O-tRNA識別的選擇性密碼子。在脊椎動物細胞中，0-RS優(yōu)先利用非天然氨基酸 將正交tRNA(O-tRNA)氨?；宜黾毎诓淮嬖诜翘烊话被岬那闆r下以一定產率產 生所關注多肽，所述產率例如為在存在非天然氨基酸的情況下多肽產率的不到30%、不到 20%、不到15%、不到10%、不到5%、不到2. 5%等。
[0095] 用于產生0-RS的方法（其為本發(fā)明的特征）任選包括：由野生型合成酶框架產生 突變合成酶池，且隨后根據相對于常見20種氨基酸，針對非天然氨基酸的特異性選擇突變 RS。為分離出所述合成酶，其選擇方法：（i)敏感，因為由最初幾回合得到的所需合成酶的 活性較低且群體較?。唬╥i)"可調"，因為需要以不同選擇回合改變選擇嚴格度；和（iii)通 用，以致所述方法可用于不同非天然氨基酸。
[0096] 在脊椎動物細胞中產生優(yōu)先利用非天然氨基酸將正交tRNA氨?；恼话滨?基-tRNA合成酶（0-RS)的方法通常包括應用正選擇隨后負選擇的組合。在正選擇過程中， 抑制正標記非必需位置處所引入的選擇性密碼子將使脊椎動物細胞能在正選擇壓力下存 活。因此，在存在非天然氨基酸的情況下，存活細胞編碼將非天然氨基酸裝于正交抑制tRNA 的活性合成酶。在負選擇的過程中，抑制負標記非必需位置處所引入的選擇性密碼子將去 除具有天然氨基酸特異性的合成酶。負選擇和正選擇的存活細胞編碼只能（或至少優(yōu)先） 利用非天然氨基酸將正交抑制tRNA氨?；ㄑb入）的合成酶。
[0097] 舉例來說，所述方法包括：(a)在存在非天然氨基酸的情況下，使第一物種的脊椎 動物細胞群經歷正選擇，其中所述脊椎動物細胞各自包含：i)氨?；?tRNA合成酶（RS)文 庫成員，ii)正交tRNA(0-tRNA)，iii)編碼正選擇標記的多聚核苷酸和iv)編碼負選擇標 記的多聚核苷酸；其中在正選擇下存活的細胞包含在存在非天然氨基酸的情況下將正交 tRNA (0-tRNA)氨酰化的活性RS ;和（b)在不存在非天然氨基酸的情況下，使在正選擇下存 活的細胞經歷負選擇，以除去利用天然氨基酸將0-tRNA氨?；幕钚訰S，從而提供優(yōu)先利 用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?-RS。
[0098] 正選擇標記可為多種分子中任一個。在一個實施例中，正選擇標記為提供營 養(yǎng)補充以供生長的產物，并且所述選擇是在缺乏所述營養(yǎng)補充的培養(yǎng)基上執(zhí)行。編碼 正選擇標記的多聚核苷酸的實例包括（但不限于）例如基于補充細胞的氨基酸營養(yǎng) 缺陷的報告基因、his3基因（例如，其中所述his3基因編碼咪唑甘油磷酸酯脫水酶， 通過提供3-氨基三唑（3-AT)檢測）、ura3基因、leu2基因、lys2基因、lacZ基因、 adh 基因等。例如參看 G.M.Kishore，&D. M. Shah, (1988)，Amino acid biosynthesis inhibitors as herbicides,Annual Review of Biochemistry 57:627-663。 在一 個實施例中，通過鄰-硝基苯基-0-D-半乳糖吡喃糖苷（0NPG)水解檢測lacZ產 生。例如參看1.6.56代131'；[181^；[；[，&￡.六.601611118，（2000)，118680；1^13。2 1：081：11(17區(qū)6116 function:evaluation of beta-galactosidase assays employed in the yeast two-hybrid system. Analytical Biochemistry 285:1-15。其它正選擇標記包括例如突光 素酶、綠色熒光蛋白質（6--)、￥--46--、1^\抗生素抗性基因的產物（例如，氯霉素乙酰轉 移酶（CAT))、轉錄調節(jié)蛋白（例如GAL4)等。編碼正選擇標記的多聚核苷酸任選包含選擇 性密碼子。
[0099] 可將編碼正選擇標記的多聚核苷酸可操作性連接到反應元件。還可存在另一多 聚核苷酸，其編碼調節(jié)由反應元件進行的轉錄的轉錄調節(jié)蛋白且包含至少一個選擇性密碼 子。通過經非天然氨基酸氨?；腛-tRNA將非天然氨基酸并入轉錄調節(jié)蛋白中，將引起編 碼正選擇標記的多聚核苷酸（例如報告基因）的轉錄。選擇性密碼子任選位于編碼轉錄調 節(jié)蛋白的DNA結合結構域的多聚核苷酸的一部分中或實質上鄰近編碼轉錄調節(jié)蛋白的DNA 結合結構域的多聚核苷酸的一部分。
[0100] 還可將編碼負選擇標記的多聚核苷酸可操作性連接到反應元件，轉錄調節(jié)蛋 白將通過所述反應元件介導轉錄。例如參看A.J.DeMaggio等人，（2000)，The yeast split-hybrid system. Method Enzymol. 328:128-137 ;H. M. Shih等人，（1996)，A positive genetic selection for disrupting protein-protein interactions:identification of CREB mutations that prevent association with the coactivator CBP. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:13896-13901 ：M. Vidal 等人，（1996)，Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system.「comment"!,Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A.93:10321-10326 :和M. Vidal 等人，(1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions, [comment],Proc. Natl. Acad. Sci. U.S. A.93:10315-10320。通過經天然氨基酸氨?；?_tRNA將天然氨基酸并入轉錄調節(jié) 蛋白中，將引起負選擇標記的轉錄。負選擇標記任選包含選擇性密碼子。在一個實施例中， 本發(fā)明的正選擇標記和/或負選擇標記可包含至少兩個選擇性密碼子，其各自或都可包含 至少兩個不同選擇性密碼子或至少兩個相同選擇性密碼子。
[0101] 轉錄調節(jié)蛋白為結合（直接或間接）核酸序列（例如，反應元件）且調節(jié)可操作 性連接到反應元件的序列的轉錄的分子。轉錄調節(jié)蛋白可為轉錄活化蛋白（例如，GAL4、核 激素受體、API、CREB、LEF/tcf家族成員、SMAD、VP16、SP1等）、轉錄阻遏蛋白（例如，核激 素受體、Groucho/tle家族、Engrailed家族等）或可視環(huán)境而具有兩種活性的蛋白質（例 如LEF/tcf、同源異型盒蛋白等）。反應元件通常為轉錄調節(jié)蛋白所識別的核酸序列或與轉 錄調節(jié)蛋白一起作用的額外試劑。
[0102] 轉錄調節(jié)蛋白的另一實例為轉錄活化蛋白GAL4。例如參看A. Laughon等 人，(1984),Identification of two proteins encoded by the Saccharomyces cerevisiae GAL4gene,Molecular&Cellular Biology 4:268-275 ；A. Laughon, &R. F.Gesteland, (1984),Primary structure of the Saccharomyces cerevisiae GAL4 gene. Molecular&Cellular Biology4:260-267 ：L.Keegan 等人，(1986),Separation of DNA binding from the transcription-activating function of a vertebrate regulatory protein. Science 231_. 699-704 ;和 M. Ptashne, (1988), How vertebrate transcriptional activators work, Nature335:683-689 〇 此 881 個氨基酸的蛋白質 的N末端147個氨基酸形成特異性結合DNA序列的DNA結合結構域（DBD)。例如參看 M. Carey 等人，（1989), An amino-terminal fragment of GAL4 binds DNA as a dimer, J. Mol. Biol. 209:423-432 :和 E. Giniger 等人，(1985)，Specific DNA binding of GAL4, a positive regulatory protein of yeast，Cel 140:767-774。DBD通過插入蛋白質序列連接 到當結合DNA時可活化轉錄的C末端113個氨基酸的活化結構域（AD)。例如參看J. Ma，&M. Ptashne，（1987)，Deletion analysis of GAL4 defines two transcriptional activating segments，Cell48:847-853 ;和 J. Ma，&M. Ptashne，（1987)，The carboxy-terminal 30amino acids of GAL4 are recognized by GAL80, Cell 50:137-142。將玻拍密碼子朝向 例如含有GAL4的N末端DBD和其C末端AD的單一多肽的N末端DBD放置，可將由0-tRNA/ 0-RS對執(zhí)行的琥珀抑制連接到由GAL4執(zhí)行的轉錄活化。可使用GAL4活化的報告基因以利 用所述基因執(zhí)行正選擇和負選擇。
[0103]用于負選擇的培養(yǎng)基可包含轉化成通過負選擇標記可檢測的物質的選擇或 篩選劑。在本發(fā)明一方面中，可檢測物質為有毒物質。編碼負選擇標記的多聚核苷酸 可例如為ura3基因。舉例來說，可將URA3報告基因置于含有GAL4DNA結合位點的啟 動子的控制下。當例如通過翻譯編碼具有選擇性密碼子的GAL4的多聚核苷酸產生負 選擇標記時，GAL4將活化URA3的轉錄。在包含5-氟乳清酸（5-F0A)的培養(yǎng)基上實現 負選擇，所述5-F0A將經ura3基因的基因產物轉化成可檢測物質（例如，殺死細胞的 有毒物質）。例如參看 J.D.Boeke 等人，（1984)，A positive selection for mutants lacking orotidine_5,-phosphate decarboxylase activity in yeast:5-fluoroorotic acid resistance,Molecular&General Genetics 197:345-346 ;M. Vidal 等人， (1996),Genetic characterization of a mammalian protein-protein interaction domain by using a yeast reverse two-hybrid system, fcomment].Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10321-10326 ：和 M. Vidal 等人，（1996), Reverse two-hybrid and one-hybrid systems to detect dissociation of protein-protein and DNA-protein interactions, [comment], Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 93:10315-10320。
[0104] 與正選擇標記相同，負選擇標記也可為多種分子中的任一個。在一個實施例中，正 選擇標記和/或負選擇標記為在存在適當反應物的情況下發(fā)熒光或催化發(fā)光反應的多肽。 舉例來說，負選擇標記包括（但不限于）例如熒光素酶、綠色熒光蛋白質（GFP)、YFP、EGFP、 RFP、抗生素抗性基因的產物（例如，氯霉素乙酰轉移酶（CAT))、lacZ基因的產物、轉錄調節(jié) 蛋白等。在本發(fā)明一方面中，通過熒光活化細胞分選（FACS)或通過發(fā)光來檢測正選擇標記 和/或負選擇標記。在另一實例中，正選擇標記和/或負選擇標記包含基于親和力的篩選 標記。同一多聚核苷酸可編碼正選擇標記和負選擇標記。
[0105] 其它水平的選擇/篩選嚴格度也可用于本發(fā)明方法中。在產生0-RS的方法的一 個或兩個步驟中可改變選擇或篩選嚴格度。這可包括例如改變編碼正選擇和/或負選擇標 記的多聚核苷酸中反應元件的量；將不同量的無活性合成酶添加到一個或兩個步驟中；改 變所使用的選擇/篩選劑的量等。還可執(zhí)行額外回合的正和/或負選擇。
[0106] 選擇或篩選也可包含一次或多次正或負選擇或篩選，所述選擇或篩選包括例如氨 基酸滲透性的改變、翻譯效率的改變、翻譯保真度的改變等。通常，一種或多種改變是建立 在一個或多個包含或編碼用于產生蛋白質的正交tRNA-tRNA合成酶對組件的多聚核苷酸 突變的基礎上。
[0107] 還可使用模型富集研究從過量無活性合成酶中迅速選擇活性合成酶?？蛇M行正和 /或負模型選擇研究。舉例來說，將包含潛在活性氨?；?tRNA合成酶的脊椎動物細胞與 不同倍數過量的無活性氨?；?tRNA合成酶混合。在生長于非選擇性培養(yǎng)基中并例如通過 X-GAL覆蓋分析的細胞與生長于選擇性培養(yǎng)基（例如，在不存在組氨酸和/或尿嘧啶的情況 下）中且能存活并例如通過X-GAL分析的細胞之間進行比率比較。對于負選擇模型，將潛 在活性氨酰基-tRNA合成酶與不同倍數過量的無活性氨?；?tRNA合成酶混合，并利用例 如5-F0A等負選擇物質執(zhí)行選擇。
[0108] 通常,RS文庫（例如，突變型RS文庫）包含由例如來自非脊椎動物生物體的至少 一種氨?；?tRNA合成酶（RS)得到的RS。在一個實施例中，RS文庫是得自無活性RS，例 如其中無活性RS是通過使活性RS例如在所述合成酶的活性位點、所述合成酶的編輯機制 位點、由組合合成酶的不同結構域得到的不同位點等突變而產生。舉例來說，使RS活性位 點中的殘基突變成例如丙氨酸殘基。將編碼丙氨酸突變的RS的多聚核苷酸用作模板，以將 丙氨酸殘基誘變?yōu)樗?0種氨基酸。選擇/篩選突變型RS的文庫以產生0-RS。在另一 實施例中，無活性RS包含氨基酸結合袋并且一個或多個包含所述結合袋的氨基酸經一個 或多個不同氨基酸取代。在一個實例中，經取代氨基酸是經丙氨酸取代。任選將編碼丙氨 酸突變的RS的多聚核苷酸用作模板以將丙氨酸殘基誘變?yōu)樗?0種氨基酸，并加以選擇 /篩選。
[0109] 產生0-RS的方法可進一步包括通過使用所屬領域中已知的各種誘變技術產生RS 文庫。舉例來說，可通過位點特異性突變、隨機點突變、同源重組、DNA改組或其它遞歸式誘 變方法、嵌合構建或其任何組合產生突變型RS。舉例來說，可由兩個或兩個以上其它（例 如）較小、較少多樣性的"子文庫"產生突變型RS文庫。在使合成酶經歷正和負選擇/篩 選策略后，可隨后使這些合成酶經歷進一步誘變。舉例來說，可分離出編碼0-RS的核酸； 可由所述核酸產生一組編碼突變型0-RS的多聚核苷酸（例如，通過隨機誘變、位點特異性 誘變、重組或其任何組合）；且可重復這些個別步驟或這些步驟的組合，直到獲得優(yōu)先利用 非天然氨基酸將0-tRNA氨?；耐蛔冃?-RS。在本發(fā)明一方面中，將所述步驟執(zhí)行至少2 次。
[0110] 有關產生0-RS的其它細節(jié)可見于題為"Methodsandcompositionsforthe productionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetasepairs?"的W0 2002/086075 中。還參看 Hamano-Takaku等人，（2000)AmutantEscherichiacoliTyrosyl-tRNA SynthetaseUtilizestheUnnaturalAminoAcidAzatyrosineMoreEfficiently thanTyrosine,JournalofBiologicalChemistry. 275(51):40324-40328：Kiga等人 (2002),AnengineeredEscherichiacolityrosyl-tRNAsynthetaseforsite-specific incorporationofanunnaturalaminoacidintoproteinsinvertebrate translationanditsapplicationinawheatgermcell-freesystem.PNAS 99(15) :9715_9723 ;和Francklyn等人，（2002),Aminoacyl-tRNAsynthetases:Versatile playersinthechangingtheateroftranslation:RNA.8:1363-1372。
[0111]正交 tRNA
[0112] 本發(fā)明提供包括正交tRNA (0-tRNA)的真核細胞。正交tRNA介導在活體內將非天 然氨基酸并入蛋白質中，所述蛋白質是由包含由0-tRNA識別的選擇性密碼子的多聚核苷 酸編碼。在某些實施例中，本發(fā)明的0-tRNA例如以至少40 %、至少45 %、至少50 %、至少 60%、至少75%、至少80%或甚至90%或更高的包含如SEQ ID N0. :65中所述的多聚核苷 酸序列或在細胞中由如SEQ ID N0. : 65中所述的多聚核苷酸序列加工的tRNA的效率，介導 將非天然氨基酸并入蛋白質中。參看本文中表5。
[0113] 本發(fā)明0-tRNA的實例為SEQ ID N0. : 65 (參看本文中實例6和表5)。SEQ ID NO. : 65為剪接前/加工前轉錄物，其在細胞中任選例如使用標準內源細胞剪接和加工機器 加工，且經修飾以形成活性O-tRNA。通常，所述剪接前轉錄物群在細胞中形成活性tRNA群。 本發(fā)明還包括O-tRNA的保守變異體和其經加工細胞產物。舉例來說，O-tRNA的保守變異 體包括功能與SEQ ID NO. : 65的O-tRNA類似且保持經加工形式的tRNA L形結構，但不具 有相同序列的分子（且不為野生型tRNA分子）。通常，由于O-tRNA可在活體內再氨?；?， 從而再次介導響應選擇性密碼子將非天然氨基酸并入由多聚核苷酸編碼的蛋白質中，故本 發(fā)明的O-tRNA為可重復利用的O-tRNA。
[0114] 真核生物而非原核生物中tRNA的轉錄是通過RNA聚合酶III進行，這將限制能在 脊椎動物細胞中轉錄的tRNA結構基因的一級序列。而且，在脊椎動物細胞中，tRNA需要從 轉錄tRNA的細胞核輸出到細胞質，以進行翻譯。編碼本發(fā)明的O-tRNA或其互補多聚核苷 酸的核酸也為本發(fā)明的特征。在本發(fā)明一個方面中，編碼本發(fā)明的O-tRNA的核酸包括內部 啟動子序列，例如A盒（例如，TRGCNNAGY)和B盒（例如，GGITCGANTCC，SEQ ID N0:87)。A 盒和 B 盒序列的其它實例可見于 Geiduschek, (1988)，Transcription By RNA Polymerase III,Ann-Rev. Biochem.57:873-914。本發(fā)明的〇-tRNA也可經轉錄后修飾。舉例來說，真核 生物中tRNA基因的轉錄后修飾包括分別通過Rnase P和3' -內切核酸酶去除5' -和3' -側 接序列。添加3' -CCA序列也為真核生物中tRNA基因的轉錄后修飾。
[0115] 在一個實施例中，通過使第一物種的脊椎動物細胞群（其中所述脊椎動物細胞包 含tRNA文庫成員）經歷負選擇來獲得O-tRNA。負選擇除去包含如下tRNA文庫成員的細 胞，所述tRNA文庫成員經對于脊椎動物細胞為內源性的氨?；?tRNA合成酶（RS)氨?；?。 這提供與第一物種的脊椎動物細胞正交的tRNA池。
[0116] 另外，或者與上文所述其它方法組合，使用反式翻譯系統(tǒng)以將非天然氨基酸并入 多肽中。此系統(tǒng)涉及存在于大腸桿菌中的稱為tmRNA的分子。這一 RNA分子在結構上與丙 氨酰tRNA相關且經丙氨酰合成酶氨酰化。tmRNA與tRNA之間的差異在于，反密碼子環(huán)經特 定較大序列置換。這一序列允許核糖體使用tmRNA內編碼的開放式閱讀框作為模板在已停 止的序列上重新開始翻譯。在本發(fā)明中，可產生優(yōu)先經正交合成酶氨?；已b載有非天然 氨基酸的正交tmRNA。通過所述系統(tǒng)轉錄基因，核糖體將在特定位點停止；將非天然氨基酸 引入此位點處，并且使用正交tmRNA內編碼的序列重新開始翻譯。
[0117] 有關產生重組正交tRNA的其它方法可見于例如題為"Methodsand compositionsfortheproductionoforthogonaltRNA-aminoacyltRNAsynthetase pairs. "的國際專利申請案TO2002/086075中。還參看Forster等人，（2003) Programmingpeptidomimeticsynthetasesbytranslatinggeneticcodesdesignedde novoPNAS100 (11) :6353_6357 ;和Feng等人，（2003)，ExpandingtRNArecognitionofa tRNAsynthetasebyasingleaminoacidchange.PNAS100(10) :5676-5681。
[0118] 正交TRNA與正交氨?；?TRNA合成酶對
[0119] 正交對是由例如抑制tRNA、移碼tRNA等0-tRNA與0-RS構成。0-tRNA不經內源 性合成酶?；?，且能夠在活體內介導將非天然氨基酸并入蛋白質中，所述蛋白質是由包含 由0-tRNA識別的選擇性密碼子的多聚核苷酸編碼。在脊椎動物細胞中，0-RS識別0-tRNA 且優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?。本發(fā)明中包括用于產生正交對的方法連同由 所述方法產生的正交對，和用于脊椎動物細胞中的正交對組合物。多種正交tRNA/合成酶 對的開發(fā)可允許使用不同密碼子將多個非天然氨基酸同時并入脊椎動物細胞中。
[0120] 可通過利用無效跨物種氨?；斎雭碜圆煌矬w的對（例如，無義抑制子對） 在脊椎動物細胞中產生正交O-tRNA/0-RS對。在脊椎動物細胞中有效表達和加工0-tRNA 和0-RS，并且將0-tRNA從細胞核有效地輸出到細胞質。舉例來說，一種所述對為來自大 腸桿菌的酪氨酰 -tRNA合成酶/tRNA^A對（例如參看，H. M. Goodman等人，（1968)，Nature 217:1019-24 ;和 D.G. Barker 等人，(1982). FEBS Lettersl50:419-23) 〇 當在釀酒酵母 細胞質中表達大腸桿菌酪氨酰-tRNA合成酶和其同源大腸桿菌tRNAeuA時，大腸桿菌酪氨 酰-tRNA合成酶有效地將其同源大腸桿菌tRNA euA氨酰化，但不會將釀酒酵母tRNA氨酰化。 例如參看，H. Edwards, &P. Schimmel, (1990), Molecular&Cellular Biology 10:1633-41 ; 和 H. Edwards 等人，(1991),PNAS UnitedStates of America 88:1153-6。此外，大腸桿 菌酪氨酰tRNAeuA為釀酒酵母氨酰基-tRNA合成酶的弱底物（例如參看V. Trezeguet等 人，(1991), Molecular&Cellular Biologyll: 2744-51)，但其有效地在釀酒酵母的蛋白質 翻譯中起作用。例如參看，H. Edwards, &P. Schimmel, (1990)Molecular&Cellular Biology 10:1633-41 ;H. Edwards 等人，(1991), PNAS United States of America 88:1153-6;和 V. Trezeguet 等人，(1991), Molecular&Cellular Biology 11:2744_51。此外，大腸桿菌 TyrRS不具有校對接合到tRNA的非天然氨基酸的編輯機制。
[0121] 0-tRNA和0-RS可為天然存在的，或可通過使來自多種生物體的天然存在的tRNA 和/或RS突變得到，這將產生tRNA文庫和/或RS文庫。參看本文中題為"來源和宿主"的 章節(jié)。在各個實施例中，0-tRNA和0-RS是得自至少一種生物體。在另一實施例中，0-tRNA 得自第一物種的天然存在或突變的天然存在的tRNA，且0-RS得自第二物種的天然存在或 突變的天然存在的RS。在一個實施例中，第一與第二非脊椎動物生物體相同?；蛘?，第一與 第二非脊椎動物生物體可不同。
[0122] 有關產生0-RS和0-tRNA的方法，參看本文中題為"正交氨?；?tRNA合成酶 (Orthogonal aminoacyl-tRNA synthetases)" 和"0-tRNA" 的章節(jié)。還參看題為"Methods and compositions for the production of orthogonal tRNA-aminoacyltRNA synthetase pairs. "的國際專利申請案W0 2002/086075。
[0123] 保真度、效率和產率
[0124] 保真度是指將所需分子（例如非天然氨基酸或氨基酸）并入正在生長的多肽中的 所需位置的準確度。本發(fā)明的翻譯組件響應選擇性密碼子以高保真度將非天然氨基酸并 入蛋白質中。舉例來說，與并入正在生長的多肽鏈中所需位置的特定天然氨基酸的不合需 要的并入相比，使用本發(fā)明的組件將所需非天然氨基酸并入正在生長的多肽鏈中所需位置 (例如響應選擇性密碼子）的效率為例如大于75%、大于85%、大于95%或甚至大于99% 有效。
[0125] 效率還可以指與相關對照相比，0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；某潭取?本發(fā)明的0-RS可通過其效率定義。在本發(fā)明某些實施例中，將0-RS與另一 0-RS相比較。例 如，本發(fā)明的0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?，這與具有（例如）如SEQ ID N0. :86 或45中所述的氨基酸序列的0-RS或表5)中另一特定RS將0-tRNA氨?；啾壤缰辽?40%、至少50%、至少60%、至少75%、至少80%、至少90%、至少95%或甚至99%或更高 有效。在另一實施例中，本發(fā)明的0-RS利用非天然氨基酸將0-tRNA氨?；?，這比0-RS利 用天然氨基酸將0-tRNA氨?；行Ю缰辽?0倍、至少20倍、至少30倍等。
[0126] 使用本發(fā)明的翻譯組件，包含非天然氨基酸的所關注多肽的產率例如為從多聚 核苷酸缺乏選擇性密碼子的細胞中獲得天然存在的所關注多肽的產率的至少5%、至少 10%、至少20%、至少30%、至少40%、50%或更多。另一方面，細胞在不存在非天然氨基酸 的情況下以一定產率產生所關注多肽，所述產率例如為在存在非天然氨基酸的情況下多肽 產率的不到30%、不到20%、不到15%、不到10%、不到5%、不到2. 5%等。
[0127] 來源和宿主生物體
[0128] 本發(fā)明的正交翻譯組件通常得自非脊椎動物生物體從而用于脊椎動物細胞 或翻譯系統(tǒng)。舉例來說，正交0-tRNA可得自非脊椎動物生物體，例如真細菌，諸如大 腸桿菌、極端嗜熱細菌（Thermus thermophilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌等；或古細菌，例 如詹氏甲燒球菌、嗜熱自養(yǎng)甲燒桿菌（Methanobacterium thermoautotrophicum)、嗜 鹽古菌（Halobacterium)(諸如沃氏嗜鹽富饒菌（Haloferax volcanii)和嗜鹽古菌 NRC_l(Halobacterium species NRC-1))、閃爍古生球菌（Archaeoglobus fulgidus)、強烈 火球菌（Pyrococcus furiosus)、掘越氏熱球菌（Pyrococcus horikoshii)、嗜熱泉生古細 菌（Aeuropyrum pernix)等，而正交0-RS可得自非脊椎動物生物體，例如真細菌，諸如大腸 桿菌、極端嗜熱細菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌等；或古細菌，例如詹氏甲烷球菌、嗜熱自養(yǎng)甲烷桿 菌、嗜鹽古菌（諸如沃氏嗜鹽富饒菌和嗜鹽古菌NRC-1)、閃爍古生球菌、強烈火球菌、掘越 氏熱球菌、嗜熱泉生古細菌等。另外，還可使用脊椎動物來源，例如植物、藻類、原生生物、真 菌、酵母、動物（例如，哺乳動物、昆蟲、節(jié)肢動物等）等，例如其中所述組件與所關注細胞或 翻譯系統(tǒng)正交，或其中其經修飾（例如，突變）而與所述細胞或翻譯系統(tǒng)正交。
[0129] O-tRNA/0-RS對的個別組件可得自相同生物體或不同生物體。在一個實施例中， O-tRNA/0-RS對是來自相同生物體。舉例來說，O-tRNA/0-RS對可得自大腸桿菌的酪氨 酰-tRNA合成酶/tRNA euA對?；蛘逴-tRNA/0-RS對的0-tRNA和0-RS任選來自不同生物體。
[0130] 正交0-tRNA、0-RS或O-tRNA/0-RS對可經選擇或篩選和/或用于脊椎動物細胞中 以產生具有非天然氨基酸的多肽。脊椎動物細胞可來自各種來源，例如任何脊椎動物（例 如，哺乳動物、兩棲動物、鳥類、爬行動物、魚類等）等。具有本發(fā)明的翻譯組件的脊椎動物 細胞的組合物也為本發(fā)明的特征。
[0131] 本發(fā)明還提供在一種物種中有效篩選以任選用于所述物種和/或第二物種（任選 無需額外選擇/篩選）中。舉例來說，在一種物種（例如，易于操縱的物種，諸如酵母細胞 等）中選擇或篩選O-tRNA/0-RS組件，且將其引入第二脊椎動物物種，例如植物（例如復雜 植物，諸如單子葉植物或雙子葉植物）、藻類、原生生物、真菌、酵母、動物（例如哺乳動物、 昆蟲、節(jié)肢動物等）等中，以用于在活體內將非天然氨基酸并入所述第二物種中。
[0132]舉例來說，由于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae，S. cerevisiae)為單 細胞的，具有快速換代時間和相對充分表征的遺傳學，故可將其選作脊椎動物第一物 種。例如參看 D. Burke 等人，(2000)Methods in Yeast Genetics. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY。此外，由于真核生物的翻譯機器高度保 守（例如參看(1996) Translational Control. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY ；Y.Kwok, &J. T. Wong, (1980),Evolutionary relationship between Halobacterium cutirubrum and eukaryotes determined by use of aminoacyl-tRNA synthetases as phylogenetic probes,Canadian Journal of Biochemistry 58:213-218;和(2001)The Ribosome. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY)，故可將在釀酒酵母中發(fā)現的用于并入非天然氨基酸的aaRS基因 引入高級脊椎動物生物體中，且與同源tRNA合作（例如參看K. Sakamoto等人，（2002) Site-specific incorporation of an unnatural amino acid into proteins in mammalian cells.Nucleic Acids Res.30:4692-4699 :和 C. Kohrer 等人,(2001)，Import of amber and ochre suppressor tRNA's into mammalian celIs:a general approach to site-specific insertion of amino acid analogues into proteins. Proc. Natl. Acad. Sci.U. S. A. 98:14310-14315)用于并入非天然氨基酸。
[0133] 在一個實例中，在如本文所述的第一物種中產生0-tRNA/0-RS對的方法另外包括 將編碼0-tRNA的核酸和編碼0-RS的核酸引入第二物種（例如，哺乳動物、昆蟲、真菌、藻 類、植物等）的脊椎動物細胞中。在另一實例中，產生在脊椎動物細胞中優(yōu)先利用非天然氨 基酸將正交tRNA氨?；恼话滨；?tRNA合成酶（0-RS)的方法包括：(a)在存在非天 然氨基酸的情況下，使第一物種（例如，酵母等）的脊椎動物細胞群經歷正選擇。所述脊椎 動物細胞各自包含：i)氨?；?tRNA合成酶（RS)文庫成員，ii)正交tRNA(0-tRNA)，iii) 編碼正選擇標記的多聚核苷酸，和iv)編碼負選擇標記的多聚核苷酸。在正選擇中存活的 細胞包含在存在非天然氨基酸的情況下將正交tRNA (0-tRNA)氨酰化的活性RS。使在正 選擇下存活的細胞在不存在非天然氨基酸的情況下經歷負選擇，以除去利用天然氨基酸將 0-tRNA氨?；幕钚訰S。這提供優(yōu)先利用非天然氨基酸將0-tRNA氨酰化的0-RS。將編碼 0-tRNA的核酸和編碼0-RS的核酸（或0-tRNA和/或0-RS的組件）引入第二物種（例如， 哺乳動物、昆蟲、真菌、藻類、植物等）的脊椎動物細胞中。通常，通過使第一物種的脊椎動 物細胞群經歷負選擇來獲得0-tRNA，其中所述脊椎動物細胞包含tRNA文庫成員。負選擇標 記除去包含tRNA文庫成員的細胞，所述tRNA文庫成員經對于脊椎動物細胞為內源性的氨 酰基-tRN合成酶（RS)氨?；涮峁┡c第一物種和第二物種的脊椎動物細胞正交的tRNA 池。
[0134] 選擇性密碼子
[0135] 本發(fā)明的選擇性密碼子將擴充蛋白質生物合成機器的遺傳密碼子框架。舉例來 說，選擇性密碼子包括例如獨特的三堿基密碼子、無義密碼子（諸如終止密碼子，例如琥珀 密碼子（UAG)、蛋白石密碼子（UGA))、非天然密碼子、至少四堿基的密碼子、稀有密碼子等。 可將多個（例如一個或多個、兩個或兩個以上、三個以上等）選擇性密碼子引入所需基因 中。基因可包括多個指定選擇性密碼子拷貝，或可包括多個不同選擇性密碼子或其組合。
[0136] 在一個實施例中，所述方法涉及使用作為終止密碼子的選擇性密碼子以在脊椎動 物細胞中于活體內并入非天然氨基酸。舉例來說，產生識別終止密碼子（例如UAG)且通過 0-RS利用所需非天然氨基酸氨?；?-tRNA。天然存在的宿主氨?；?tRNA合成酶不識別 所述0-tRNA?？墒褂贸Ｒ?guī)定點誘變將終止密碼子（例如TAG)引入所關注多肽中的所關注位 點處。例如參看 Sayers, J.R?等人（1988)，5，，3, Exonuclease in phosphorothioate-based oligonucleotide-directed mutagenesis.Nucleic Acids Res.791-802。當在活體內將 0-RS、0-tRNA和編碼所關注多肽的核酸組合時，響應UAG密碼子而并入非天然氨基酸從而 得到在指定位置處含有所述非天然氨基酸的多肽。
[0137] 在活體內并入非天然氨基酸可在不顯著干擾脊椎動物宿主細胞的情況下進行。舉 例來說，由于UAG密碼子的抑制效率視O-tRNA (例如，琥珀抑制性tRNA)與脊椎動物釋放因 子（例如，eRF)(其與終止密碼子結合并且起始正在生長的肽從核糖體釋放）之間的競爭 而定，故所述抑制效率可例如通過增加O-tRNA(例如，抑制性tRNA)的表達水平來調節(jié)。
[0138] 選擇性密碼子還包含擴充的密碼子，例如四個或四個以上堿基的密碼子，諸如四 堿基密碼子、五堿基密碼子、六堿基密碼子或更多個堿基的密碼子。四堿基密碼子的實例 包括例如AGGA、CUAG、UAGA、CCCU等。五堿基密碼子的實例包括例如AGGAC、CCCCU、CCCUC、 CUAGA、CUACU、UAGGC等。本發(fā)明的特征包括基于移碼抑制使用擴充的密碼子。四個或四 個以上堿基的密碼子可將例如一個或多個非天然氨基酸插入同一蛋白質中。舉例來說，在 存在具有反密碼子環(huán)、例如具有8-10nt反密碼子環(huán)的突變O-tRNA(例如，特定移碼抑制性 tRNA)的情況下，將四個或四個以上堿基的密碼子讀作單一氨基酸。在其它實施例中，反密 碼子環(huán)可解碼例如至少四堿基密碼子、至少五堿基密碼子或至少六堿基密碼子或更多堿基 的密碼子。由于存在256個可能的四堿基密碼子，故可在同一細胞中使用四個或四個以上 堿基的密碼子編碼多個非天然氨基酸。參看Anderson等人，（2002) Exploring the Limits of Codon and Anticodon Size,Chemistry and Biology. 9:237~244 ：Magliery, (2001) Expanding the Genetic Code:Selection of Efficient Suppressors of Four-base Codons and Identification of 〃Shifty〃Four_base Codons with a Library Approach in Escherichia coli. T. Mol. Biol. 307:755-769〇
[0139] 舉例來說，已使用四堿基密碼子使用活體外生物合成方法將非天然氨基酸并入蛋 白質中。例如參看 Ma 等人，(1993)Biochemistry,32:7939 :和 Hohsaka 等人,(1999) T. Am. Chem. Soc. 121:34。使用CGGG和AGGU利用兩個以化學方式?；囊拼a抑制性tRNA在活體 外將2-萘基丙氨酸和賴氨酸的NBD衍生物同時并入抗生蛋白鏈菌素中。例如參看Hohsaka 等人，(1999) T. Am. Chem. Soc. 121:12194。在活體內研究中，Moore等人檢查具有NCUA反密 碼子的tRNALeu衍生物抑制UAGN密碼子（N可為U、A、G或C)的能力，并且發(fā)現四聯(lián)體UAGA 可以通過具有UCUA反密碼子的tRNALeu以13%到26%的效率解碼且在0或-1框內極少 解碼。參看Moore等人，(2000)T. Mol. Biol. ,298:195。在一個實施例中，可將基于稀有密 碼子或無義密碼子的擴充密碼子用于本發(fā)明中，其可減少錯義通讀和其它不合需要的位點 處的移碼抑制。
[0140] 對于指定系統(tǒng)來說，選擇性密碼子也可包括一個天然三堿基密碼子，其中內源系 統(tǒng)不使用（或極少使用）天然堿基密碼子。舉例來說，這包括缺乏識別天然三堿基密碼子 的tRNA的系統(tǒng)和/或三堿基密碼子為稀有密碼子的系統(tǒng)。
[0141] 選擇性密碼子任選包括非天然堿基對。這些非天然堿基對使現有的遺傳代碼進一 步擴展。一種額外的堿基對使三聯(lián)體密碼子的數量從64增加到125。第三堿基對的特性 包括穩(wěn)定且具選擇性的堿基配對、通過聚合酶以高保真度有效酶促并入DNA中以及合成新 的非天然堿基對之后有效的持續(xù)引物延伸?？蛇m于方法和組合物的非天然堿基對的描述 包括例如 Hirao 等人，(2002) An unnatural base pair for incorporating amino acid analogues into protein.Nature Biotechnology. 20:177-182。其它相關公開案列于下文 中。
[0142] 對于活體內使用來說，非天然核苷可滲透膜并且磷酸化形成相應的三磷酸鹽。 此外，增加的遺傳信息穩(wěn)定并且不被細胞酶所破壞。Benner和其它人先前的工作利用不 同于規(guī)范Watson-Crick配對的氫鍵模式，最值得關注的實例為is〇-C:is〇-G配對。例 如參看 Switzer 等人，(1989) T. Am. Chem. Soc, 111 :8322 ;和 Piccirilli 等人，（1990) Nature, 343:33 ：Kool, (2000)Curr. Opin. Chem. Biol, 4:602〇 一般說來，這些喊基在某種程 度上與天然堿基錯配并且無法酶促復制。Kool和同事證實，堿基之間的疏水堆積相互作 用可替代氫鍵以驅動堿基對的形成。參看Kool，(2000)Curr. Opin. Chem. Biol. 4:602-M Guckian 及 Kool, (1998)Angew. Chem. Int. Ed. Engl., 36, 2825。在開發(fā)滿足所有上述需求的 非天然堿基對的工作中，Schultz、Romesberg和同事已系統(tǒng)地合成一系列非天然疏水堿基 并且對其進行研究。已發(fā)現，PICS:PICS自身配對比天然堿基對穩(wěn)定，并且能夠通過大腸桿 菌DNA聚合酶I的Klenow片段（KF)有效地并入DNA中。例如參看McMinn等人，（1999) T. Am. Chem. Soc. 121:11586 ;以及 Ogawa 等人，(2000)T. Am. Chem. Soc.122:3274。3MN: 3MN 自 身配對可通過KF以足以用于生物功能的效率和選擇性合成。例如參看Ogawa等人，（2000) T. Am. Chem. Soc. 122:8803〇然而，兩種堿基都充當用于進一步復制的鏈終止子。近來已開 發(fā)出可用于復制PICS自身配對的突變體DNA聚合酶。此外，可復制7AI自身配對。例如參 看Tae等人，(2001) T. Am. Chem. Soc, 123:7439〇也已開發(fā)出新穎的金屬堿基對Dipic:Py，其 在結合Cu (II)后形成穩(wěn)定的配對。參看Meggers等人，（2000).L Am. Chem. Soc, 122:10714。 由于擴充密碼子和非天然密碼子內在地與天然密碼子正交，故本發(fā)明的方法可利用這一特 性產生正交tRNA供其使用。
[0143] 也可使用翻譯旁路系統(tǒng)將非天然氨基酸并入所需多肽中。在翻譯旁路系統(tǒng)中，將 較大序列插入基因中但并不被翻譯成蛋白質。所述序列含有充當誘導核糖體越過所述序列 并且在插入下游重新開始翻譯的線索的結構。
[0144] 非天然氨基酸
[0145] 如本文所使用，非天然氨基酸是指除硒代半胱氨酸和/或吡咯賴氨酸和以下20種 基因編碼的a-氨基酸外的任何氨基酸、經修飾氨基酸或氨基酸類似物：丙氨酸、精氨酸、 天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨 酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸。通過式I說明 a _氨基酸的一般結構：
[0146]

【權利要求】
1. 一種脊椎動物細胞或細胞系，其包含正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)，其中所述 0-RS在所述脊椎動物細胞中優(yōu)先利用對乙酰基-苯丙氨酸（PAF)將正交tRNA(O-tRNA)氨 ?；?br> 2. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中所述0-RS利用PAF將所述0-tRNA氨酰 化，這比所述0-RS利用天然氨基酸將所述0-tRNA氨?；行е辽?0倍。
3. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中所述0-RS是得自非脊椎動物生物體。
4. 根據權利要求3所述的細胞或細胞系，其中所述非脊椎動物生物體為大腸桿菌 (Escherichia coli)或嗜熱月旨肪芽抱桿菌（Bacillus stearothermophilus) 〇
5. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中所述脊椎動物細胞或細胞系為哺乳動物 的。
6. 根據權利要求5所述的細胞系，其中所述脊椎動物細胞系為人類細胞系。
7. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中與天然氨基酸相比，所述0-RS具有一個 或多個改進或增強的關于至少一個非天然氨基酸的酶特性，所述特性選自由以下組成的群 組：較高Km、較低Km、較高krat、較低kMt、較低k Mt/km和較高krat/km。
8. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中所述0-tRNA是得自非脊椎動物生物體。
9. 根據權利要求8所述的細胞或細胞系，其中所述非脊椎動物生物體為大腸桿菌或嗜 熱脂肪芽孢桿菌。
10. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其另外包含包括編碼所關注多肽的多聚核 苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含由所述0-tRNA所識別的選擇性密碼子。
11. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子選自由以下組成的 群組：琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子或者四個或四個以上堿基的密碼子。
12. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為琥珀密碼子。
13. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為赭石密碼子。
14. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為蛋白石密碼子。
15. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子含有四個或四個以 上堿基密碼子。
16. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述包含所述至少一個非天然氨基酸 的所關注多肽的產率為從所述多聚核苷酸缺乏所述選擇性密碼子的細胞獲得所關注天然 存在的多肽的產率的至少5%。
17. 根據權利要求1所述的細胞或細胞系，其中所述細胞在不存在所述至少一個非天 然氨基酸的情況下以一定產率產生所述所關注多肽，所述產率為在存在所述至少一個非天 然氨基酸的情況下所述多肽產率的不到30%。
18. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述所關注多肽為治療性蛋白質、診 斷性蛋白質、工業(yè)酶或其部分。
19. 根據權利要求10所述的細胞或細胞系，其中所述所關注多肽包含選自由以下組 成的群組的蛋白質或蛋白質的一部分：細胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白細 胞介素、炎癥分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、類固醇激素受體、促紅細胞生成素 (EP0)、胰島素、人生長激素、a-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫 輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、 Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit 配體、CC 趨化 因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎癥蛋 白-1 a、單核細胞炎癥蛋白-1 p、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、 T64262、CD40、CD40配體、膠原蛋白、群落刺激因子（CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體 受體 1、DHFR、上皮中性粒細胞活化肽-78、GRO a /MGSA、GRO P、GRO y、MIP-1 a、MIP-1 S、 MCP-1、表皮生長因子（EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、脫落毒素、因子IX、因子VII、因子 VIII、因子X、成纖維細胞生長因子（FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、G-CSF、GM-CSF、 葡糖腦苷脂酶、促性腺激素、刺猬蛋白（hedgehog protein)、血紅蛋白、肝細胞生長因子 (HGF)、水蛭素、人血清白蛋白、I CAM-1、I CAM-1受體、LFA-1、LFA-1受體、類胰島素生長因子 (IGF)、IGF-I、IGF-II、IFN-a、IFN-P、IFN-y、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、角質細胞生長因子（KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、 熒光素酶、神經營養(yǎng)因子、中性粒細胞抑制因子（NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲狀旁腺激素、 H)-ECSF、TOGF、多效生長因子、蛋白質A、蛋白質G、致熱性外毒素A、B或C、松馳素、腎素、 SCF、可溶性補體受體I、可溶性I-CAM 1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調 節(jié)素、生長抑素、生長激素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、 SED、SEE、類固醇激素受體、超氧化物歧化酶（SOD)、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺肽a 1、組 織型纖溶酶原活化劑、腫瘤生長因子（TGF)、TGF-a、TGF-0、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子 a、腫瘤壞死因子3、腫瘤壞死因子受體（TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因 子（VEGEF)、尿激酶、Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕 酮受體、睪酮受體、醛固酮受體、LDL 受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/ LFA-1、透明質酸/⑶44和皮質酮。
20. -種脊椎動物細胞或細胞系，其包含正交氨酰基-tRNA合成酶（0-RS)，其中所述 0-RS在所述脊椎動物細胞中優(yōu)先利用對乙?；?苯丙氨酸將正交tRNA(O-tRNA)氨?；?。
21. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中所述0-RS利用所述對乙酰基-苯丙 氨酸將所述0-tRNA氨?；?，這比所述0-RS利用天然氨基酸將所述0-tRNA氨?；行е辽?10倍。
22. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中所述0-RS是得自非脊椎動物生物體。
23. 根據權利要求22所述的細胞或細胞系，其中所述非脊椎動物生物體為大腸桿菌或 嗜熱脂肪芽孢桿菌。
24. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中所述脊椎動物細胞或細胞系為哺乳動 物的。
25. 根據權利要求20所述的細胞系，其中所述脊椎動物細胞系為人類細胞系。
26. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中與天然氨基酸相比，所述0-RS具有一 個或多個改進或增強的關于至少一個非天然氨基酸的酶特性，所述特性選自由以下組成的 群組：較高Km、較低Km、較高krat、較低kMt、較低k Mt/km和較高krat/km。
27. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中所述0-tRNA是得自非脊椎動物生物 體。
28. 根據權利要求27所述的細胞或細胞系，其中所述非脊椎動物生物體為大腸桿菌或 嗜熱脂肪芽孢桿菌。
29. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其另外包含包括編碼所關注多肽的多聚核 苷酸的核酸，其中所述多聚核苷酸包含由所述O-tRNA所識別的選擇性密碼子。
30. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子選自由以下組成的 群組：琥珀密碼子、赭石密碼子、蛋白石密碼子或者四個或四個以上堿基的密碼子。
31. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為琥珀密碼子。
32. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為赭石密碼子。
33. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子為蛋白石密碼子。
34. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述選擇性密碼子含有四個或四個以 上堿基密碼子。
35. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述包含所述至少一個非天然氨基酸 的所關注多肽的產率為從所述多聚核苷酸缺乏所述選擇性密碼子的細胞獲得所關注天然 存在的多肽的產率的至少5%。
36. 根據權利要求20所述的細胞或細胞系，其中所述細胞在不存在所述至少一個非天 然氨基酸的情況下以一定產率產生所述所關注多肽，所述產率為在存在所述至少一個非天 然氨基酸的情況下所述多肽產率的不到30%。
37. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述所關注多肽為治療性蛋白質、診 斷性蛋白質、工業(yè)酶或其部分。
38. 根據權利要求29所述的細胞或細胞系，其中所述所關注多肽包含選自由以下組 成的群組的蛋白質或蛋白質的一部分：細胞因子、生長因子、生長因子受體、干擾素、白細 胞介素、炎癥分子、癌基因產物、肽激素、信號轉導分子、類固醇激素受體、促紅細胞生成素 (EPO)、胰島素、人生長激素、a-1抗胰蛋白酶、血管抑素、抗溶血因子、抗體、載脂蛋白、脫 輔基蛋白、心房利鈉因子、心房利鈉多肽、心房肽、C-X-C趨化因子、T39765、NAP-2、ENA-78、 Gro-a、Gro-b、Gro-c、IP-10、GCP-2、NAP-4、SDF-1、PF4、MIG、降鈣素、c-kit 配體、CC 趨化 因子、單核細胞趨化蛋白-1、單核細胞趨化蛋白-2、單核細胞趨化蛋白-3、單核細胞炎癥蛋 白-1 a、單核細胞炎癥蛋白-1 p、RANTES、1309、R83915、R91733、HCC1、T58847、D31065、 T64262、CD40、CD40配體、膠原蛋白、群落刺激因子（CSF)、補體因子5a、補體抑制劑、補體 受體 1、DHFR、上皮中性粒細胞活化肽-78、GRO a /MGSA、GRO P、GRO y、MIP-1 a、MIP-1 S、 MCP-1、表皮生長因子（EGF)、上皮中性粒細胞活化肽、脫落毒素、因子IX、因子VII、因子 VIII、因子X、成纖維細胞生長因子（FGF)、纖維蛋白原、纖維粘連蛋白、G-CSF、GM-CSF、葡 糖腦苷脂酶、促性腺激素、刺猬蛋白、血紅蛋白、肝細胞生長因子（HGF)、水蛭素、人血清白 蛋白、ICAM-1、ICAM-1 受體、LFA-1、LFA-1 受體、類胰島素生長因子（IGF)、IGF-I、IGF-II、 IFN-a、IFN-P、IFN-y、IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、 IL-11、IL-12、角質細胞生長因子（KGF)、乳鐵蛋白、白血病抑制因子、熒光素酶、神經營養(yǎng)因 子、中性粒細胞抑制因子（NIF)、抑瘤素M、成骨蛋白、甲狀旁腺激素、PD-ECSFJDGF、多效生 長因子、蛋白質A、蛋白質G、致熱性外毒素A、B或C、松馳素、腎素、SCF、可溶性補體受體I、 可溶性I-CAM 1、可溶性白細胞介素受體、可溶性TNF受體、生長調節(jié)素、生長抑素、生長激 素、鏈激酶、超抗原、葡萄球菌腸毒素、SEA、SEB、SEC1、SEC2、SEC3、SED、SEE、類固醇激素受 體、超氧化物歧化酶（SOD)、中毒性休克綜合癥毒素、胸腺肽a 1、組織型纖溶酶原活化劑、 腫瘤生長因子（TGF)、TGF-a、TGF-0、腫瘤壞死因子、腫瘤壞死因子a、腫瘤壞死因子旦、 腫瘤壞死因子受體（TNFR)、VLA-4蛋白、VCAM-1蛋白、血管內皮生長因子（VEGEF)、尿激酶、 Mos、Ras、Raf、Met、p53、Tat、Fos、Myc、Jun、Myb、Rel、雌激素受體、孕酮受體、睪酮受體、醒固 酮受體、LDL 受體、SCF/c-Kit、CD40L/CD40、VLA-4/VCAM-1、ICAM-1/LFA-1、透明質酸 /CD44 和皮質酮。
39. 根據權利要求1所述的脊椎動物細胞系，其中所述細胞系已經瞬時轉染。
40. 根據權利要求1所述的脊椎動物細胞系，其中所述細胞系已經穩(wěn)定轉染。
41. 一種脊椎動物細胞或細胞系，其包含正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA介導在 活體內將對乙?；?苯丙氨酸并入蛋白質中，所述蛋白質是由包含所述〇-tRNA識別的選擇 性密碼子的多聚核苷酸編碼。
42. 根據權利要求41所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質包含至少兩個非天然氨基 酸。
43. 根據權利要求41所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質包含至少兩個不同的非天 然氨基酸。
44. 根據權利要求41所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質另外包含醫(yī)藥學上可接受 的賦形劑。
45. -種細胞或細胞系，其包含正交tRNA(O-tRNA)，其中所述O-tRNA介導在活體內將 對氨基-苯丙氨酸并入蛋白質中，所述蛋白質是由包含所述O-tRNA識別的選擇性密碼子的 多聚核苷酸編碼。
46. 根據權利要求45所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質包含至少兩個非天然氨基 酸。
47. 根據權利要求45所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質包含至少兩個不同的非天 然氨基酸。
48. 根據權利要求45所述的細胞或細胞系，其中所述蛋白質另外包含醫(yī)藥學上可接受 的賦形劑。
49. 一種用于在細胞中產生包含至少兩個非天然氨基酸的蛋白質的試劑盒，所述試劑 盒包含：容器，其含有編碼O-tRNA的多聚核苷酸序列；和編碼0-RS的多聚核苷酸序列或 0-RS。
50. 根據權利要求49所述的試劑盒，其中所述試劑盒另外包含至少一個非天然氨基 酸。
51. 根據權利要求49所述的試劑盒，其中所述試劑盒另外包含關于產生所述蛋白質的 說明材料。
【文檔編號】C12N5/10GK104328086SQ201410578532
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2007年9月7日 優(yōu)先權日:2006年9月8日
【發(fā)明者】田鋒, 席雅·諾曼, 斯蒂芬妮·周 申請人:Ambrx公司