一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌Lactobacillus fermentum strain suo及 ...的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillus fermentum suo)保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2013511及其用途，該菌株的耐酸性較強(qiáng)，在pH3.0的人工胃液下3h后存活率達(dá)到了92.46±4.06％，在1.0％濃度膽鹽下可以緩慢生長，生長效率達(dá)到無膽鹽培養(yǎng)的17.36±1.19％，Lactobacillus fermentum suo細(xì)胞的疏水性也達(dá)到了68.44±2.48％，在人的腸道內(nèi)正常生長。Lactobacillus fermentum suo能夠減緩便秘引起的小鼠體重減輕趨勢(shì)，加快排黑便時(shí)間，提高小腸推進(jìn)率，不同程度的增加血清的MTL、Gas、ET、AchE、SP和VIP因子水平，降低SS因子，增加攝食量和飲水量，降低排便量、排便顆粒數(shù)和糞便含水量下降的趨勢(shì)，與便秘藥物起到相似的作用，表現(xiàn)出一定的便秘預(yù)防效果。
CCTCC NO：M2013511
2013.10.25
【專利說明】一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌 Lactobacillus fermentum strain suo 及其用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，尤其涉及一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳 桿菌 Lactobacillus fermentum strain suo 及其用途。

【背景技術(shù)】
[0002] 乳桿菌與人類生活關(guān)系密切，是廣泛應(yīng)用于食品發(fā)酵、工業(yè)乳酸發(fā)酵及醫(yī)療保健 領(lǐng)域中的有益微生物之一?，F(xiàn)已認(rèn)識(shí)的乳桿菌屬和雙歧桿菌屬中的許多種都具有特定的優(yōu) 良性質(zhì)和遺傳性狀，表現(xiàn)出極強(qiáng)的益生菌特性。乳桿菌不僅能夠提高食品營養(yǎng)價(jià)值，改善食 品風(fēng)味，延長保存時(shí)間，還可以改善食品的功能性質(zhì)。它能夠通過分解食物中的蛋白質(zhì)、糖 類、合成維生素，提高食物的消化率和生物價(jià)，促進(jìn)消化吸收。還能夠減少人體膽固醇含量、 增強(qiáng)免疫功能、抗變異原性、抗腫瘤、抗高血壓等。近年來，乳桿菌以其特殊的生理活性和營 養(yǎng)功能而成為益生菌的主要來源，正日益引起人們的重視。
[0003] 便秘是非常普遍的一種疾病，在人群中的患病率高達(dá)27%，它可以影響各年齡段 的人。習(xí)慣性便秘因用力增加腹壓，屏氣使勁排便，是誘發(fā)中老年男性高血脂、心腦血管疾 病、動(dòng)脈硬化、腫瘤等疾病及其并發(fā)癥的罪魁禍?zhǔn)祝瑥亩鴮?dǎo)致老人心腦血管病變死亡率急劇 增加，出現(xiàn)痔瘡、肛裂等問題，令人痛苦不堪。另外長期便秘，大量便渣會(huì)滯留在腸道內(nèi)發(fā) 酵、腐爛，大量毒素和有害菌被腸道反復(fù)吸收，通過血液循環(huán)到達(dá)人體各部位，成為女性健 康和美麗的罪魁禍?zhǔn)?。便秘還會(huì)使小孩胃腸道菌群失衡，導(dǎo)致精力不集中、思維遲鈍、營養(yǎng) 不良、心情急躁、消瘦、免疫力下降、易感冒、生長遲緩，如不及時(shí)調(diào)理，可能造成不可逆的病 變。因便秘發(fā)病率高、病因復(fù)雜，患者常有許多苦惱，便秘嚴(yán)重時(shí)會(huì)影響生活質(zhì)量。因此，尋 找一種能夠代替藥物來預(yù)防便秘的生物制品有很大的現(xiàn)實(shí)意義，微生態(tài)療法恰是以一個(gè)嶄 新的手段解決了傳統(tǒng)療法存在的多種問題。
[0004] 國內(nèi)外對(duì)乳酸菌的生理功能有大量的研宄報(bào)道，但對(duì)乳酸菌預(yù)防便秘的功能性研 宄報(bào)道很少。關(guān)于乳酸菌預(yù)防便秘的研宄對(duì)食品科學(xué)、預(yù)防醫(yī)學(xué)和微生態(tài)學(xué)等許多學(xué)科都 有很大價(jià)值。發(fā)酵乳制品是人們攝入乳酸菌的一條重要渠道，篩選優(yōu)良的具有預(yù)防便秘和 安全的乳酸菌菌株，對(duì)于開發(fā)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳品的附加值將具 有重要意義。因此，具有預(yù)防便秘的乳酸菌具很大的研宄和應(yīng)用價(jià)值。
[0005] 在目前已經(jīng)公開的文獻(xiàn)與專利或?qū)＠暾?qǐng)中，例如CN101144064A公開了一種具 有抗致突變活性、產(chǎn)胞外多糖的短乳桿菌及其用途，用于發(fā)酵食品中以改善食品品質(zhì)，增 加其營養(yǎng)學(xué)功能。CN1796540A公開了具有抗腸道致病菌和抗氧化特性的雙歧桿菌及其用 途，用于制備食品組合物或藥物組合物，殺死或抑制幽門螺旋桿菌或大腸桿菌，治療由其引 起的各種疾病。CN102174450A公開了一種抗幽門螺桿菌感染的植物乳桿菌及其用途，用 于制備藥物組合物、發(fā)酵劑、動(dòng)物飼料添加劑和保健品中來預(yù)防或減輕幽門螺桿菌的感染。 CN101144065A公開了一種耐過氧化氫、清除自由基的抗氧化干酪乳桿菌及其用途，用于發(fā) 酵食品及乳品膠囊制品中以開發(fā)功能性乳制品、豐富現(xiàn)有乳制品種類、提高乳品的附加值。 但是，這些專利或?qū)＠暾?qǐng)沒有完全涉及具有調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘等性能的微生物。因 此，目前還需要有一種具有調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的微生物及其含有它們的食品。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 為了解決上述問題，本發(fā)明提供了一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌 及其用途，主要提供一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌菌株和提供一種所述發(fā) 酵乳桿菌在發(fā)酵食品中的用途。
[0007] 本發(fā)明提供的一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)于2013年10月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)， 該保藏中心的地址位于：中國.武漢.武漢大學(xué)，保藏編號(hào)為CCTCC NO :M 2013511。
[0008] 從自然發(fā)酵牦牛酸乳中篩選出一株發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)，利用形態(tài)特征、培養(yǎng)性狀和生理生化特征等微生物學(xué)特性對(duì)該乳酸桿菌 (Lactobacillus fermentum strain suo)鑒定為發(fā)酵乳桿菌，該菌株已于2013年10月25 日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)CCTCCNO :M 2013511。
[0009] 所述發(fā)酵乳桿菌的形態(tài)學(xué)特征具體為：
[0010] 菌體特征：呈革蘭氏染色陽性，細(xì)胞桿狀，菌體約0. 5-1. 0 μ m寬，1. 5-4 μ m長，成 單、成對(duì)或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形。
[0011] 菌落特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0.5-2. Omm之間，圓形，邊緣整 齊，乳白色，透明，表面濕潤光滑，不產(chǎn)生色素。
[0012] 所述發(fā)酵乳桿菌體內(nèi)耐受特征為：
[0013] 發(fā)酵乳桿菌的菌株耐酸性較強(qiáng)，在PH3.0的人工胃液下3h后存活率為 92. 46±4. 06 % ;在1.0 %濃度膽鹽下可以緩慢生長，生長效率達(dá)到無膽鹽培養(yǎng)的 17. 36±1. 19% ;發(fā)酵乳桿菌細(xì)胞的疏水性為68. 44±2. 48%。
[0014] 所述發(fā)酵乳桿菌來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食品，屬公認(rèn)安全（Generally Recognized As Safe，GRAS)菌種，用于發(fā)酵食品中。
[0015] 所述發(fā)酵食品為含有發(fā)酵乳桿菌的乳酸菌奶飲料、乳粉、膠囊制品或發(fā)酵乳中的 一種或多種。
[0016] 所述含有發(fā)酵乳桿菌的乳酸菌奶飲料是按照下述步驟制備得到的：
[0017] 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度-75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存， 或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?br> [0018] 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；
[0019] 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫?zé)釟⒕?s，冷卻到4°C，加入所 述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到10 6cfu/mL以上，在4°C冷藏保存。
[0020] 所述含有發(fā)酵乳桿菌的乳粉是按照下述步驟制備得到的：
[0021] 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存， 或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?br> [0022] 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；
[0023] 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37°C， 再以原料乳體積的4%接菌量接種所述的發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，37°C下發(fā)酵16h，得到發(fā) 酵乳桿菌發(fā)酵乳；所述發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照I : 3(v : V)配比加入， 進(jìn)行均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到含發(fā)酵乳桿菌的乳粉。
[0024] 所述含有發(fā)酵乳桿菌的膠囊制品是按照下述步驟制備得到的：
[0025] 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存， 或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?br> [0026] 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；
[0027] 將原料乳在140°C高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻至37°C，以原料乳體積的4%接菌量接 種所述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，在37°C下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳；將所述發(fā)酵乳 桿菌發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照以I : 3(V : V))配比加入，均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥 處理后得到乳粉，將得到含有發(fā)酵乳桿菌的膠囊制品。
[0028] 所述含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵乳是按照下述步驟制備得到的：
[0029] 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存， 或者在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫?br> [0030] 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑；
[0031] 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37°C， 再按照3-5% (體積）加入發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，再加入3-5% (體積）可共生的用于制 備發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑，混勻后在37°C下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計(jì)0. 6-0. 7%，然后 冷卻至4°C，再進(jìn)行冷藏保存得到含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵乳。
[0032] 所述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑的制備方法包括：
[0033] 將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于12% (重量）的脫脂乳中，IKTC滅菌 lOmin，在37°C條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，連續(xù)培養(yǎng)活化兩代，用作母發(fā)酵劑；將所述母發(fā) 酵劑按3-5% (體積）接種于滅菌乳中，培養(yǎng)14-16h至凝乳，此時(shí)該凝乳中的活菌數(shù)約 109cfu/mL，得到工作發(fā)酵劑，可以直接將這種工作發(fā)酵劑添加到食品中，或者與可共生的 制備發(fā)酵乳的商業(yè)發(fā)酵劑如保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌一起使用制備發(fā)酵乳；或
[0034] 將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng) 12-16h進(jìn)行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4% (體積）接種于MRS培養(yǎng)基中， 培養(yǎng)16-18h，在4°C條件下4000r/min離心15min，去除上清夜，得到細(xì)胞沉淀，將沉淀用無 菌脫脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑。
[0035] 所述的加熱殺菌是例如使用上海沃迪自動(dòng)化裝備股份有限公司銷售的TW10D1000 型管式殺菌機(jī)進(jìn)行的。
[0036] 所述的高溫?zé)釟⒕抢缡褂帽本┯聞?chuàng)嘉業(yè)機(jī)械設(shè)備有限公司銷售的YC-104型 板式超尚溫殺菌機(jī)進(jìn)彳丁的。
[0037] 所述的均質(zhì)是例如使用常州市均質(zhì)機(jī)械有限公司銷售的GJB500-40小型均質(zhì)機(jī) 進(jìn)行的。
[0038] 所述的濃縮是例如使用上海偉宙輕工機(jī)械有限公司銷售的真空濃縮鍋進(jìn)行的。
[0039] 所述的噴霧干燥是例如使用上海沃迪科技有限公司銷售的實(shí)驗(yàn)型噴霧干燥機(jī)進(jìn) 行的。
[0040] 所述的商品發(fā)酵劑優(yōu)選的是保加利亞乳桿菌或嗜熱鏈球菌。
[0041] 在本發(fā)明的意義上，所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復(fù)原奶的原料 乳。
[0042] 本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案帶來的有益效果如下：
[0043] 本發(fā)明為一種分離自四川省紅原縣牧民家自然發(fā)酵牦牛酸乳中的可調(diào)節(jié)腸道運(yùn) 動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌和以該菌株為發(fā)酵劑或添加的發(fā)酵乳、健康食品以及動(dòng)物保健 制品中的應(yīng)用，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)菌株的耐酸性較強(qiáng)， 在PH3.0的人工胃液下3h后存活率達(dá)到了 92.46±4.06%，在1.0%濃度膽鹽下可以緩慢 生長，生長效率達(dá)到無膽鹽培養(yǎng)的 17. 36±L 19%，Lactobacillus fermentum strain suo 細(xì)胞的疏水性也達(dá)到了 68. 44±2. 48%。這表明發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)能在人的腸道內(nèi)正常生長。小鼠體內(nèi)試驗(yàn)還表明，發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)能夠減緩便秘引起的小鼠體重減輕趨勢(shì)，加快排黑便時(shí)間，提高小 腸推進(jìn)率，不同程度的增加血清的奶1、6&8 31^(^、5?和￥1?因子水平，降低55因子，增 加攝食量和飲水量，降低排便量、排便顆粒數(shù)和糞便含水量下降的趨勢(shì)，與便秘藥物起到相 似的作用，表現(xiàn)出一定的便秘預(yù)防效果。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0044] 為了更清楚的說明本發(fā)明實(shí)施例的技術(shù)方案，下面將對(duì)實(shí)施例描述中所需要使用 的附圖作簡(jiǎn)單的介紹，顯而易見的，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實(shí)施例，對(duì)于本 領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的 附圖。
[0045] 圖 1 發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)菌落形態(tài)；
[0046] 圖 2 發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)的菌體形態(tài)（IOOOx);
[0047] 圖3小鼠體重隨實(shí)驗(yàn)時(shí)間的變化；
[0048] 圖4不同組小鼠首次排黑便所需時(shí)間；
[0049] 圖5不同組小鼠的小腸總長度；
[0050] 圖6不同組小鼠的小腸推進(jìn)率；
[0051] 圖7不同組小鼠血清中各因子水平。
[0052] 本發(fā)明的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)于 2013 年 10 月 25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，該保藏中心的地址位于：中國.武漢.武漢大學(xué)，編 號(hào)為 CCTCC NO :M 2013511。

【具體實(shí)施方式】
[0053] 下面將結(jié)合本發(fā)明實(shí)施例中的附圖，對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完 整的描述，顯然所描述的實(shí)施例僅是本發(fā)明的一部分實(shí)施例，不是全部的實(shí)施例，基于本發(fā) 明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有付出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí) 施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。
[0054] 實(shí)施例1 :發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)的分離、純化及 初步定。
[0055] 該實(shí)施例按照下述步驟進(jìn)行：
[0056] (I)Lactobacillus fermentum strain suo 的分離、純化。
[0057] 以無菌操作吸取傳統(tǒng)發(fā)酵牦牛酸奶樣品500 μ L加入至5mL滅菌生理鹽水混合作 成1 : 10的均勻稀釋液，并繼續(xù)作一定比例的稀釋。選擇合適梯度的稀釋液，用無菌槍頭 各吸取100 μ L分別涂布到MRS固體平板培養(yǎng)基中，30°C培養(yǎng)48_72h，觀察記錄菌落形態(tài)如 圖1所示。
[0058] 用接種環(huán)（或滅菌牙簽）從平板表面及內(nèi)部挑取不同菌落接種于MRS液體培養(yǎng)基 中，置30°C，300r/min搖床培養(yǎng)24-48h ;重復(fù)以上步驟連續(xù)活化2代后進(jìn)行涂片革蘭氏染 色鏡檢如圖2所示。
[0059] 確定為G+菌的繼續(xù)活化，直至得到純菌落（鏡檢無雜菌），并進(jìn)行過氧化氫酶實(shí) 驗(yàn)。將G+和過氧化氫酶陰性的無芽孢桿菌、球菌及鏈球菌均暫定為乳酸菌，并保存，具體操 作參照《微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)》。
[0060] 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，從紅原安曲地區(qū)的十個(gè)樣品中共分離出乳酸菌58多株，樣本乳酸 菌活菌數(shù)平均在10 8cfu/mL數(shù)量級(jí)。其中Lactobacillus fermentum strain suo是編號(hào) 為54的菌株。
[0061] (2)Lactobacillus fermentum strain suo 的初步鑒定。
[0062] 革蘭氏染色：取典型菌落涂片，進(jìn)行革蘭氏染色，在微生物顯微鏡油鏡下觀察菌體 形態(tài)及其排列方式。挑取視野清晰、形態(tài)典型的菌株，進(jìn)行拍照。過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)：挑取固 體培養(yǎng)基上菌落一接種環(huán)，置于潔凈試管內(nèi)，滴加3 %過氧化氫溶液2mL，觀察結(jié)果（于半分 鐘內(nèi)發(fā)生氣泡者為陽性，不發(fā)生氣泡者為陰性）。
[0063] 結(jié)果表明，從樣品中共分離純化出58株乳酸菌，這些菌株均能在含5%。CaC〇j9 MRS平板培養(yǎng)基上生長，并在菌落周圍形成溶鈣圈，革蘭氏染色陽性，過氧化氫酶試驗(yàn)陰性。
[0064] 實(shí)施例 2 :發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)的體外篩選。
[0065] (1)益生菌耐受ρΗ3· 0人工胃液的篩選。
[0066] 人工胃液的配制：NaCl 0.2%、胃蛋白酶0.35%、用IM的HCl調(diào)整pH值為3.0后， 在無菌操作臺(tái)中用真空泵抽濾除菌后備用。
[0067] 益生菌對(duì)人工胃液耐受性的測(cè)定：取5mL已經(jīng)活化好的菌株培養(yǎng)液，在無菌操作 臺(tái)中倒入已滅菌IOmL離心管中，經(jīng)3000r/min離心IOmin收集菌體，加入5mL滅菌生理鹽 水混勾制成菌懸液，取ImL菌懸液與9mL pH3. 0的人工胃液混合，搖勾，置于恒溫振蕩器 中培養(yǎng)（37°C，300r/min)，并分別在Oh和3h取樣，用MRS瓊脂培養(yǎng)基傾注37°C培養(yǎng)48h。 用平板計(jì)數(shù)法測(cè)定活菌數(shù)，計(jì)算其存活率:存活率（％)= 3h的活菌數(shù)/Oh的活菌 數(shù) X100%〇
[0068] (2)益生菌耐受不同濃度膽鹽的測(cè)定。
[0069] 選擇在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上的菌種做不同膽鹽濃度下的生長測(cè) 試。將活化好的菌種5mL按2%的接種量（100 μ L)用移液槍分別接種于含0.0%牛膽鹽 (即空白）、〇· 3%牛膽鹽、0.5%牛膽鹽、1.0%牛膽鹽（W/V)的MRS-THIO培養(yǎng)基（MRS培養(yǎng) 基中加0. 2%的巰基乙酸鈉）。在恒溫振蕩器中37°C培養(yǎng)24h后，以空白培養(yǎng)基為對(duì)照（未 接種的MRS-THIO培養(yǎng)基），分別測(cè)定上述不同濃度培養(yǎng)基的OD值，計(jì)算菌株對(duì)膽鹽的耐受 力。膽鹽耐受力=含膽鹽的培養(yǎng)基的OD值/空白培養(yǎng)基的OD值X 100%。
[0070] (3)菌液濃度調(diào)整。
[0071] 選擇在pH3. 0人工胃液中存活率在10%以上、耐膽鹽較強(qiáng)的的菌種，經(jīng)鏡檢觀察 菌體生長形態(tài)良好后進(jìn)行試驗(yàn)，將活化好的細(xì)菌培養(yǎng)物5mL，在無菌操作臺(tái)中倒入已滅菌 10mT,離心管中，以3000r/min離心IOmin收集菌體。以5mL PBS (50mM，pH6. 5)緩沖液洗絳 菌體，3000r/min離心lOmin，重復(fù)洗滌兩次。以PBS緩沖液為空白對(duì)照，用緩沖液調(diào)整受試 菌株菌體濃度，使其在560nm波長下AO值約為1. 00。
[0072] 取4mL調(diào)整好濁度的菌液于已滅菌IOmL離心管中，加入0. 8mL二甲苯，對(duì)照組不 加二甲苯，振蕩30s，停頓10s，后再振蕩30s，于試管架上靜置5?IOmin分層，取下層水 相，以PBS緩沖液為空白對(duì)照，在560nm下測(cè)量A值并進(jìn)行記錄。疏水率=[ (AO-A) / AO] X 100其中AO和A分別是與二甲苯混勻前、后菌液在560nm下測(cè)量得到的A值。
[0073] 乳酸菌是正常腸道菌的一部分，作為益生菌的首要條件之一，是能在胃和小腸前 段存活，被篩選的菌株應(yīng)具有足夠的耐酸性和酸性環(huán)境下生長發(fā)育的特性。
[0074] Lactobacillus fermentum strain suo 的篩選結(jié)果如下表 1 所不：
[0075]

【權(quán)利要求】
1. 一種可調(diào)節(jié)腸道運(yùn)動(dòng)、預(yù)防便秘的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentum strain suo)于2013年10月25日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC)，保藏編號(hào)為CCTCC NO : M 2013511。
2. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌，其特征在于，所述發(fā)酵乳桿菌的形態(tài)學(xué)特征具體 為： 菌體特征：呈革蘭氏染色陽性，細(xì)胞桿狀，菌體約0. 5-1. 0 y m寬，1. 5-4 y m長，成單、成 對(duì)或者成鏈，不形成芽孢，兩端圓形。 菌落特征：在MRS培養(yǎng)基上形成明顯的菌落，直徑在0. 5-2. 0mm之間，圓形，邊緣整齊， 乳白色，透明，表面濕潤光滑，不產(chǎn)生色素。
3. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌，其特征在于，所述發(fā)酵乳桿菌體內(nèi)耐受特征為： 發(fā)酵乳桿菌的菌株耐酸性較強(qiáng)，在PH3. 0的人工胃液下3h后存活率為92. 46 ±4. 06%; 在1. 0 %濃度膽鹽下可以緩慢生長，生長效率達(dá)到無膽鹽培養(yǎng)的17. 36 ±1. 19% ;發(fā)酵乳桿 菌細(xì)胞的疏水性為68. 44±2. 48%。
4. 如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵乳桿菌，其特征在于，所述發(fā)酵乳桿菌來源于傳統(tǒng)發(fā)酵食 品，屬公認(rèn)安全（Generally Recognized As Safe，GRAS)菌種，用于發(fā)酵食品中。
5. 如權(quán)利要求4所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所述發(fā)酵食品為含有發(fā)酵乳 桿菌的乳酸菌奶飲料、乳粉、膠囊制品或發(fā)酵乳中的一種或多種。
6. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所述含有發(fā)酵乳桿菌的乳酸 菌奶飲料是按照下述步驟制備得到的： 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存，或者 在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫? 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑； 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫?zé)釟⒕?s，冷卻到4°C，加入所述發(fā) 酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，使其濃度達(dá)到106cfu/mL以上，在4°C冷藏保存； 所述的原料乳是一種或多種選自脫脂奶、鮮奶、復(fù)原奶的原料乳。
7. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所述含有發(fā)酵乳桿菌的乳粉 是按照下述步驟制備得到的： 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存，或者 在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫? 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑； 原料乳在95°C下加熱殺菌20min或在140°C下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37°C，再以 原料乳體積的4%接菌量接種所述的發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，37°C下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳 桿菌發(fā)酵乳；所述發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照1 : 3(V : V)配比加入，進(jìn)行 均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥得到含發(fā)酵乳桿菌的乳粉。
8. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所述含有發(fā)酵乳桿菌的膠囊 制品是按照下述步驟制備得到的： 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存，或者 在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫? 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑； 將原料乳在140°C高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻至37°C，以原料乳體積的4%接菌量接種所 述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，在37°C下發(fā)酵16h，得到發(fā)酵乳桿菌發(fā)酵乳；將所述發(fā)酵乳桿菌 發(fā)酵乳和滅菌后的原料乳按照以1 : 3(V : V))配比加入，均質(zhì)，真空濃縮、噴霧干燥處理 后得到乳粉，將得到含有發(fā)酵乳桿菌的膠囊制品。
9. 如權(quán)利要求5所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所述含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵 乳是按照下述步驟制備得到的： 所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種在溫度_75°C下以30% (重量）甘油懸液形式保存，或者 在溫度4°C下以冷凍干燥菌粉的形式保存?zhèn)溆茫? 利用所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種制備發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑； 原料乳在95 °C下加熱殺菌20min或在140 °C下高溫?zé)釟⒕?s，然后冷卻到37 °C，再按 照3-5% (體積）加入發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑，再加入3-5% (體積）可共生的用于制備 發(fā)酵乳制品的發(fā)酵劑，混勻后在37°C下混菌發(fā)酵至滴定酸度以乳酸計(jì)0. 6-0. 7%，然后冷 卻至4°C，再進(jìn)行冷藏保存得到含有發(fā)酵乳桿菌的發(fā)酵乳。
10. 如權(quán)利要求6至9中任意一項(xiàng)權(quán)利要求所述的發(fā)酵乳桿菌的用途，其特征在于，所 述發(fā)酵乳桿菌工作發(fā)酵劑的制備方法包括： 將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于12% (重量）的脫脂乳中，110°C滅菌lOmin， 在37°C條件下培養(yǎng)14-16h至凝乳，連續(xù)培養(yǎng)活化兩代，用作母發(fā)酵劑；將所述母發(fā)酵劑按 3-5% (體積）接種于滅菌乳中，培養(yǎng)14-16h至凝乳，至該凝乳中的活菌數(shù)約109cfu/mL，得 到工作發(fā)酵劑；或 將所述發(fā)酵乳桿菌的原始菌種接種于MRS液體培養(yǎng)基中，在37°C條件下培養(yǎng)12-16h 進(jìn)行活化，連續(xù)活化兩代，然后將活化培養(yǎng)物按2-4% (體積）接種于MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 16-18h，在4°C條件下4000r/min離心15min，去除上清夜，得到細(xì)胞沉淀，將沉淀用無菌脫 脂乳制成懸浮液，得到工作發(fā)酵劑。
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104498383SQ201410578559
【公開日】2015年4月8日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年5月28日
【發(fā)明者】索化夷, 李鍵, 騫宇, 趙欣, 陳煉紅, 蘭道亮, 謝婕 申請(qǐng)人:西南大學(xué)