一種pcr反應(yīng)液及試劑盒和pcr方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種PCR反應(yīng)液及試劑盒和PCR方法。所述PCR反應(yīng)液，包括如下原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10×PCR buffer，溴酚藍(lán)溶液，溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30％的甘油溶液和rTaq酶。本發(fā)明優(yōu)化了PCR實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)液，特別是加入一定比例的甘油溶液，并加入BSA與DMSO的組合，保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活性，并減少引物二聚體的形成，減少PCR反應(yīng)液配置時(shí)間，在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物時(shí)，只需加入核酸染料即可檢測(cè)，可以大量節(jié)省PCR產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)間，提高PCR的擴(kuò)增效率。
【專利說明】-種PCR反應(yīng)液及試劑盒和PCR方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種PCR反應(yīng)液及試劑盒和PCR方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Polymerasechainreaction，PCR)是一種體外快速擴(kuò)增特定 DNA片段的技術(shù)，它是現(xiàn)代分子生物學(xué)最重要的手段之一。其基本原理是根據(jù)獲諾貝爾 1953年生理學(xué)獎(jiǎng)的DNA雙螺旋模型所建立的體細(xì)胞復(fù)制的機(jī)制以及雙鏈DNA在體外可隨溫 度變化發(fā)生變性與復(fù)性的特點(diǎn)設(shè)計(jì)。1985年Randll.K.Skaii等利用KlenowDNA聚合酶建 立了聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)技術(shù)，并將其應(yīng)用于鐮刀形貧血病的基因診斷。它是80年代分子生物 學(xué)領(lǐng)域的一項(xiàng)革命性突破，被譽(yù)為分子生物學(xué)資源發(fā)展史上的又一里程碑。此項(xiàng)技術(shù)一經(jīng) 問世就因其操作簡(jiǎn)單、快速、靈敏度高和特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)迅速在與分子生物學(xué)相關(guān)的學(xué)科 得到廣泛應(yīng)用，如分子生物學(xué)研究、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、動(dòng)植物檢驗(yàn)、法醫(yī)鑒定及考古等各個(gè)領(lǐng)域。
[0003] 在PCR過程中，DNA聚合酶起著關(guān)鍵性作用。目前已有100多個(gè)DNA聚合酶的相 關(guān)基因被克隆和測(cè)序，Thermusaquaticus是一種水生嗜熱菌，從該菌中分離出的DNA聚合 酶（TaqDNA聚合酶）具有催化以DNA為模板合成DNA的功能。
[0004] TaqNDA聚合酶是Mg2+依賴性酶，該酶的催化活性對(duì)Mg2+濃度非常敏感。研究表 明，Mg2+濃度低于ImM，dNTP過多，鰲合Mg2+作用強(qiáng)時(shí)，Mg2+對(duì)TaqDNA聚合酶的催化作用幾 乎喪失，不產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物。隨著Mg2+濃度的增加，其催化作用增強(qiáng)，擴(kuò)增產(chǎn)物增多，但產(chǎn)物濃 度增大的同時(shí)，背景也明顯增強(qiáng)。
[0005] 常規(guī)的PCR擴(kuò)增體系配置，往往是將DNTP、Buffer、rTaq酶等試劑單獨(dú)保存，待要 進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，將樣品分別加到同一PCR管中，在操作過程中除了經(jīng)常忘記加入個(gè)別試劑 的缺點(diǎn)外，多次的取用會(huì)對(duì)試劑造成污染，影響后續(xù)使用。因此，急需研發(fā)一種PCR擴(kuò)增體 系對(duì)于減少PCR擴(kuò)增體系配置時(shí)間以及提高PCR體系配置的準(zhǔn)確性和減少PCR擴(kuò)增過程中 的污染。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006] 本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是：提供一種減少PCR反應(yīng)液配置時(shí)間的含有溴酚藍(lán) 指示劑的PCR反應(yīng)液的配置方法。
[0007] 為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：提供一種PCR反應(yīng)液，包括如 下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白，DNTP，10XPCRbuffer，溴酚藍(lán)溶液，溶質(zhì)體積 百分?jǐn)?shù)為30%的甘油溶液和rTaq酶。
[0008] 本發(fā)明的另一技術(shù)方案為提供一種PCR試劑盒，其包含上述的PCR反應(yīng)液。
[0009] 本發(fā)明的又一技術(shù)方案為提供一種PCR方法，包含使用上述的PCR反應(yīng)液的步驟。
[0010] 本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明優(yōu)化了PCR實(shí)驗(yàn)的PCR反應(yīng)液，特別是加入一定比 例的甘油溶液，以保證rTaq酶的活性，加入BSA與DMS0的組合保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活 性，并減少引物二聚體的形成，減少PCR反應(yīng)液配置時(shí)間，在瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物 時(shí)，只需加入核酸染料即可檢測(cè)，與常規(guī)的PCR檢測(cè)相比，使用本發(fā)明PCR反應(yīng)液無需再加 入溴酚藍(lán)指示劑，可以大量節(jié)省PCR產(chǎn)品檢測(cè)時(shí)間，提高PCR的擴(kuò)增效率，適用于大批量PCR 產(chǎn)品的檢測(cè)。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0011] 圖1為本發(fā)明【具體實(shí)施方式】中的轉(zhuǎn)基因水稻GUS基因結(jié)果檢測(cè)圖；
[0012] 其中泳道1，2是常規(guī)PCR方法配置的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道3、4是含有溴酚藍(lán)指示 劑的PCR反應(yīng)液的PCR檢測(cè)結(jié)果，泳道5是DNAmarker。

【具體實(shí)施方式】
[0013] 為詳細(xì)說明本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、所實(shí)現(xiàn)目的及效果，以下結(jié)合實(shí)施方式并配合附 圖予以說明。
[0014] 本發(fā)明最關(guān)鍵的構(gòu)思在于：本發(fā)明在PCR反應(yīng)液中加入甘油、BSA與DMS0有保證 Tag酶的穩(wěn)定性及活性，制備出可以直接使用的PCR混合液提高PCR的擴(kuò)增效率。
[0015] 實(shí)施例1
[0016] -種PCR反應(yīng)液，包括如下原料制備而成：6_8li 1二甲亞砜，6_8li 1質(zhì)量體積百分 數(shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液，9-lliil lOmMDNTP溶液，18-22iil 10XPCRbuffer，2-4iil 溴酚藍(lán)溶液，45-55 ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和4-6 ill rTaq酶。
[0017] 傳統(tǒng)配制PCR反應(yīng)液時(shí)，將DNTP、Buffer、rTaq酶等試劑進(jìn)行混合，制備出可以直 接使用的PCR混合液，將PCR混合液放于-20°C保存，rTaq酶的活性會(huì)下降。因此，本發(fā)明 在混合液中加入一定比例的甘油溶液和BSA與DMS0的組合保證了Tag酶的穩(wěn)定性及活性， 并減少引物二聚體的形成。
[0018] 一種PCR反應(yīng)液，所述反應(yīng)液由如下組分混合而成：6ii1二甲亞砜，1質(zhì)量體積 百分?jǐn)?shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液,9iillOmMDNTP溶液，18iil10XPCRbuffer，2iil溴 酚藍(lán)溶液，45ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和4illrTaq酶。
[0019] 一種PCR反應(yīng)液，所述反應(yīng)液由如下組分混合而成：8ii1二甲亞砜，1質(zhì)量體積 百分?jǐn)?shù)為0.1%的牛血清蛋白溶液，111111011110見13溶液，2211110\?〇?131^€61'，4111溴 酚藍(lán)溶液，55ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和6illrTaq酶。
[0020] 實(shí)施例2
[0021] -種PCR反應(yīng)液，所述反應(yīng)液包括7. 5 ii 1二甲亞砜，7. 5 ii 1質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為 0.1%牛血清蛋白溶液lOiil lOmMDNTP溶液，20iil 10XPCRbuffer，5iil溴酚藍(lán)溶液， 47 ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%甘油溶液和5 ill rTaq酶。將配置好的溶液混勻后離心，存 放于-20°C冰箱中。
[0022] 進(jìn)一步的，上述的PCR反應(yīng)液中，所述10XPCR buffer包含50-150mM的PH為8.3 的Tris-Hcl，250-750mM Kcl和5-20mM Mgcl2。
[0023] 進(jìn)一步的，上述的PCR反應(yīng)液中，所述溴酚藍(lán)溶液包含體積百分?jǐn)?shù)為30 %的甘油 和質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為〇. 05%溴酚藍(lán)粉末。
[0024] -種PCR試劑盒，其特征在于，其包含上述任一項(xiàng)的PCR反應(yīng)液。
[0025] 上述PCR反應(yīng)液的使用：從冰箱中取出2XPCR反應(yīng)液，配置PCR體系，20iU的 ?〇?體系配置如下：2父？〇?反應(yīng)液10111，引物1?1111，引物？1111，轉(zhuǎn)基因水稻基因組模 板1Ul，滅菌水7ill。進(jìn)行PCR后，PCR程序如下；
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：二甲亞砜，牛血清蛋白， DNTP，10XPCRbuffer，溴酚藍(lán)溶液，溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30%的甘油溶液和rTaq酶。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：6-8 yl 二甲亞砜，6-8iil質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0. 1%的牛血清蛋白溶液，9-lliillOmM DNTP溶液， 18-22 ill 10 XPCR buffer，2-4 ill溴酚藍(lán)溶液，45-55 ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %甘油溶 液和 4-6 u 1 rTaq 酶。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)液，其特征在于，包括如下的原料制備而成：7. 5 yl 二甲亞砜，7. 5iil質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0. 1%牛血清蛋白溶液lOiil 10mM DNTP溶液，20iil 10 X PCR buffer，5 ill溴酚藍(lán)溶液，47 ill溶質(zhì)體積百分?jǐn)?shù)為30 %甘油溶液和5 ill rTaq 酶。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述10XPCR buffer包含 50-150mM 的 PH 為 8. 3 的 Tris-Hcl，250-750mM Kcl 和 5-20mM Mgcl2。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的PCR反應(yīng)液，其特征在于，所述溴酚藍(lán)溶液包含體積百分?jǐn)?shù)為 30%的甘油和質(zhì)量體積百分?jǐn)?shù)為0. 05%溴酚藍(lán)粉末。
6. -種PCR試劑盒，其特征在于，其包含權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的PCR反應(yīng)液。
7. -種PCR方法，其特征在于，包含使用權(quán)利要求1-5任一項(xiàng)所述的PCR反應(yīng)液的步 驟。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104328170SQ201410581850
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月24日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月24日
【發(fā)明者】王清水, 余彥 申請(qǐng)人:福建師范大學(xué)