山羊脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種山羊脂聯(lián)素蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用。所述的山羊脂聯(lián)素基因編碼區(qū)的核苷酸序列如序列表SEQIDNO：1所示。將山羊脂聯(lián)素基因的完整編碼區(qū)片段經(jīng)過(guò)雙酶切，連接到同樣經(jīng)過(guò)雙酶切pEGFP-N1載體中，這樣可以構(gòu)建山羊脂聯(lián)素蛋白真核表達(dá)載體。該真核表達(dá)載體構(gòu)建方法簡(jiǎn)單可行，可以高效的增強(qiáng)山羊脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)，并且都包含綠色熒光蛋白，可以檢測(cè)山羊脂聯(lián)素蛋白真核細(xì)胞中的表達(dá)和定位。本發(fā)明提供的真核表達(dá)載體也可以應(yīng)用于研究脂聯(lián)素蛋白在山羊脂肪沉積過(guò)程中的作用。
【專利說(shuō)明】山羊脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建和應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于生物工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種山羊脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其在山羊脂肪沉積方面的應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002]動(dòng)物體內(nèi)脂肪組織既是重要的儲(chǔ)能器官，又是重要的內(nèi)分泌器官。脂肪組織能分泌多種脂肪因子，如脂聯(lián)素(Adiponectin, AdipoQ)、腫瘤壞死因子(Tumor necrosisfactor α , TNF α )、瘦素(Leptin, LEP)> 白介素-6 (Interleukin-6, IL-6)、抵抗素(Resistin,RETN)等。AdipoQ在血液中有很高的濃度(5?30 μ g/mL),達(dá)到血衆(zhòng)總蛋白的
0.01%?0.05%。AdipoQ在多中生理功能中都起著重要的作用，能增強(qiáng)II型糖尿病患者的胰島素敏感性，用于治療II型糖尿?。徽{(diào)控糖脂代謝，抑制糖原的水解，促進(jìn)血液中游離脂肪酸的氧化及葡糖糖的吸收；抑制粒細(xì)胞、單核巨噬細(xì)胞集落形成及巨噬細(xì)胞的吞噬活力，起到抗炎癥作用；抑制血管內(nèi)膜增厚及平滑肌細(xì)胞增殖，起到抗動(dòng)脈粥樣化作用等。AdipoQ通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)全身各個(gè)器官，以不同形式與相應(yīng)的受體結(jié)合，在整個(gè)機(jī)體中都起著重要作用。
[0003]研究發(fā)現(xiàn)在動(dòng)物模擬試驗(yàn)中改變脂聯(lián)素的含量或者用重組脂聯(lián)素體外處理細(xì)胞和肌肉都能調(diào)控葡萄糖和脂肪酸的代謝，其通過(guò)促進(jìn)葡萄糖運(yùn)載體4 (GLUT4)向細(xì)胞膜轉(zhuǎn)移來(lái)增加葡萄糖的吸收，激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)、p38絲裂原活化蛋白激酶(P38-MAPK)及過(guò)氧化物酶體增殖激活受體(PPARα )通路來(lái)增加脂肪酸的吸收和氧化,但這中作用可由Leptin引起的AdipoRl/2水平降低而減弱AdipoQ能改善高糖誘發(fā)的胰島素抵抗，并且降低血清中的甘油三酯(TG)和游離脂肪酸(FFA)水平，抑制脂蛋白酯酶活性及胰島素調(diào)控的葡萄糖產(chǎn)生[2]，另外發(fā)現(xiàn)AdipoRl和AdipoR2的表達(dá)量與胰島素敏感性呈正相關(guān)[3]。高血糖癥個(gè)體骨骼肌中AdipoRl的表達(dá)量降低50%，從而抑制了 gAd調(diào)控的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)體4 (GLUT4)轉(zhuǎn)位，降低對(duì)葡糖糖、脂肪酸的吸收及氧化；但增強(qiáng)了全長(zhǎng)型AdipoQ的糖、脂代謝功能[4]。
[0004]Wu等[5]利用地塞米松、異丁基甲基黃嘌呤和胰島素聯(lián)合誘導(dǎo)劑處理綿羊SMSCs，結(jié)果表明SMSCs能沉積脂肪并分化為類脂肪細(xì)胞。Teboul等[6]研究發(fā)現(xiàn)脂肪酸能使C2C12細(xì)胞沉積脂肪并分化為類脂肪細(xì)胞，同時(shí)檢測(cè)到相關(guān)脂肪酸合成基因的表達(dá)量顯著升高。研究還發(fā)現(xiàn)高濃度葡萄糖能通過(guò)SREBP-1c通路調(diào)控肌管中脂肪酸的從頭合成，并在mRNA和蛋白水平均檢測(cè)到SREBP-lc、ACC和FAS等脂肪酸合成基因表達(dá)量有顯著性升高并分化為脂肪細(xì)胞等，表明SMSCs是具有多分化潛能的肌源性干細(xì)胞m。AdipoQ作為一種重要的脂肪因子，在肌肉中的糖脂代謝調(diào)節(jié)等發(fā)面起著重要作用。因此可以通過(guò)AdipoQ來(lái)調(diào)控肌肉中脂肪酸的合成，增加肌內(nèi)脂肪含量，從而改善山羊肌肉品質(zhì)。
[0005][I]Yamauchi Tj Kamon Jj Ito Y，et al.Cloning of adiponectin receptorsthat mediate antidiabetic metabolic effects [J].Nature, 2003，423(6941):762-769. [2]CombsTPj Pajvani UBj Berg AHj et al.A transgenic mouse with adelet1n in the collagenous domain of adiponectin displays elevated circulatingadiponectin and improved insulin sensitivity[J].Endocrinology, 2004，145(1):367-383.[3]CivitareseAEj Ukropcova B，Carling S，et al.Role of adiponectin inhuman skeletal muscle b1energetics[J].Cell metabolism, 2006，4(1): 75-87.[4]Fang X， Palanivel R， Zhou X， et al.Hyperglycemia- andhyperinsulinemia-1nduced alterat1n of adiponectin receptor express1n andadiponectin effects in L6 myoblasts [J].J Mol Endocrinol, 2005， 35(3):465-476.[5]Wu Hj Ren Y，Li S，et al.1n vitro culture and induced differentiat1nof sheep skeletal muscle satellite cells[J].Cell B1l Intj 2012，36(6):579-587.[6]Teboul Lj Gaillard D， Staccini L， et al.Thiazolidined1nes and fattyacids convert myogenic cells into adipose-like cells [J].J B1l Chemj 1995，270(47): 28183-28187.[7]Guillet-Deniau I， Pichard A-Lj Kone A， et al.Glucose induces de novolipogenesis in rat muscle satellite cells through a sterol-regulatory-element-binding-protein-lc-dependent pathway[J].J Cell Scij 2004， 117(10): 1937-1944。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本發(fā)明的目的在于提供一種山羊脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建方法及其在山羊脂肪沉積方面的應(yīng)用。
[0007]本發(fā)明通過(guò)以下技術(shù)實(shí)現(xiàn):根據(jù)pEGFP-Nl載體的多克隆位點(diǎn)和山羊脂聯(lián)素基因的編碼區(qū)序列，設(shè)計(jì)帶有保護(hù)性堿基、末端分別帶有Hind III和BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物，擴(kuò)增產(chǎn)物包含山羊脂聯(lián)素基因的編碼區(qū)序列。將其構(gòu)建入pEGFP-Nl載體的Hind III和BamH I兩個(gè)酶切位點(diǎn)之間。得到山羊脂聯(lián)素基因不同綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體 pEGFP-Nl-AD。
[0008]本發(fā)明的效果是:利用一對(duì)引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增可以克隆山羊脂聯(lián)素基因的完整編碼區(qū)，該真核表達(dá)載體構(gòu)建方法簡(jiǎn)單可行，可以高效的增強(qiáng)山羊脂聯(lián)素蛋白的表達(dá)，并且都包含綠色熒光蛋白，是研究山羊脂聯(lián)素蛋白功能的重要技術(shù)。
[0009]更詳細(xì)的技術(shù)方案請(qǐng)參見(jiàn)《【具體實(shí)施方式】》中的實(shí)施例。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0010]序列表SEQ ID NO:1是本發(fā)明克隆的山羊脂聯(lián)素基因的核苷酸序列。
[0011]圖1是山羊脂聯(lián)素基因的綠色熒光蛋白融合的真核表達(dá)載體pEGFP-Nl-AD的結(jié)構(gòu)圖。
[0012]圖2是山羊脂聯(lián)素蛋白的綠色熒光蛋白融合表達(dá)載體pEGFP-Nl-AD通過(guò)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染導(dǎo)入山羊骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞后脂肪酸合成及成脂分化相關(guān)基因AdipoRl、C/EBP a和PPAR γ )表達(dá)量的變化。
[0013]【具體實(shí)施方式】:
實(shí)施例1:(一)山羊脂聯(lián)素基因編碼區(qū)序列的克隆
1.總RNA的提取
(I)將適量液氮倒入研缽中預(yù)冷，待溫度降低后將組織放入研缽中，再加適當(dāng)液氮并將組織樣研磨成粉末狀，然后取粉末樣品100 mg于1.5 mL的EP管中，加入I mL預(yù)冷的Trizol試劑，震蕩混勻，室溫靜置5 min。
[0014](2)加入氯仿200 μ L，旋渦儀上振蕩15 sec混勻，室溫靜置5 min，然后在4°C條件下 12，000X g 離心 15 min。
[0015](3)將上層水相約500 μ L轉(zhuǎn)移至另一新1.5 mL的EP管，加入等體積的預(yù)冷異丙醇，輕輕顛倒數(shù)次混勻，置于室溫靜置10 min，然后在4°C條件下12，OOOXg離心10 min。
[0016](4)移除上清，加入4°C預(yù)冷的75 % DEPC酒精I(xiàn) mL，冰上靜置5 min，然后4°C條件下7，500 X g離心5 min ；
(5)移除上清，用移液槍吸取多余的液體，室溫干燥沉淀。
[0017](6)根據(jù)RNA的沉淀的量加入適量的DEPC水溶解RNA，并保存于_80°C超低溫冰箱。
[0018]2.cDNA 的合成
利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScript RT reagent Kit進(jìn)行cDNA第一條鏈的合成。第一步除去基因組 DNA:取上述提取的 RNA I μ g，5 XgDNA Eraser Buffer 2 μ L, gDNA Eraser Iμ Ld^WRnase Free dH20至10 μ L,輕輕混勻后瞬時(shí)離心,42°C條件下反應(yīng)2 min。第二步為cDNA的合成:在原體系中加入5 XPrimerScript Buffer 2試劑4 μ L, PrimeScriptRT Enzyme Mix I I μ L, RT Primer Mix I μ L,補(bǔ) RNase Free dH20 至 20 μ L,混勻后瞬時(shí)離心,37°C條件下反應(yīng)15 min,然后升溫至85°C反應(yīng)5 sec滅活合成酶。合成的cDNA于-20°C保存。
[0019]3.RT-PCR擴(kuò)增山羊脂聯(lián)素基因
利用源自脂肪組織的cDNA為模板進(jìn)行相關(guān)基因的克隆。反應(yīng)體系為:cDNA模板2 μ L，上下游引物各 0.8 μ L (20 PM), 2 XMaster Mix Taq 酶 10 μ L，加滅菌 ddH20 至 20 μ L。
[0020]4.脂聯(lián)素基因的克隆
(I)根據(jù)PMD 19-Τ載體使用說(shuō)明，向1.5 mL離心管加入0.5 μ? PMD 19-T Vector,4.5μ L的PCR回收產(chǎn)物，5 μ L Solut1n I，輕輕混勻，并置于16°C條件下水浴連接5 h。
[0021](2)將感受態(tài)細(xì)胞從超低溫冰箱中取出后置于冰上慢慢融化，吸取30 μ L感受態(tài)細(xì)胞與上述連接液混合，輕輕混勻，然后冰浴30 min。
[0022](3) 42°C條件下水浴熱激轉(zhuǎn)化45 sec，然后冰上放置I?2 min。
[0023](4)向上述混合液中加入37°C預(yù)熱的不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基800 μ L，置于37°C恒溫?fù)u床(200 r/min)上培養(yǎng)45 min，復(fù)蘇感受態(tài)細(xì)胞。
[0024](5)室溫下4，OOOXg離心10 min，移除650 μ L上清，將剩下的培養(yǎng)基與沉淀吹打混勻，均勻的涂布在含抗生素的LB固體培養(yǎng)基平板上。先正置于37°C培養(yǎng)箱中培養(yǎng)I h,待混合菌液被固體培養(yǎng)基吸收后倒置培養(yǎng)12?16 ho
[0025]脂聯(lián)素基因的鑒定及測(cè)序待菌落形成后，挑選單個(gè)菌落，接種于含有抗生素LB液體培養(yǎng)基中，置于37°C恒溫?fù)u床(200 r/min)上培養(yǎng)6?8 h，待觀測(cè)到培養(yǎng)基中形成云霧狀后方可進(jìn)行菌液檢測(cè)。將菌液混勻，吸取菌液I μ L作為DNA模板，并進(jìn)行PCR擴(kuò)增，1.5%瓊脂糖檢測(cè)是否為目的條帶。檢測(cè)后將含目的條帶的菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
[0026]實(shí)施例2:(—)山羊脂聯(lián)素蛋白真核表達(dá)載體的構(gòu)建 1.載體構(gòu)建
(I)利用Primer Premier 5.0軟件分析山羊脂聯(lián)素基因⑶S區(qū)序列，找到不能酶切該基因CDS區(qū)的限制性內(nèi)切酶，并根據(jù)pEGFP-Nl載體所含酶切位點(diǎn)信息確定限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I。根據(jù)酶切位點(diǎn)序列和⑶S區(qū)序列信息設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增山羊脂聯(lián)素基因CDS 區(qū)，正向引物(Fl):5’ (5，-CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT-3’)和反向引物(Rl):3’(5’ -CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA-3’)。
[0027](2)根據(jù)操作說(shuō)明，酶切pEGFP-Nl載體和山羊脂聯(lián)素基因PCR產(chǎn)物。膠回收酶切產(chǎn)物，利用T4 DNA連接酶過(guò)夜連接。
[0028](3)將載體轉(zhuǎn)化到感受態(tài)細(xì)胞中。
[0029](4)挑選單個(gè)菌落，液體培養(yǎng)基擴(kuò)大繁殖，PCR檢測(cè)含目的基因條帶后，將菌液送至上海生工生物技術(shù)有限公司測(cè)序。
[0030]利用含酶切位點(diǎn)的弓丨物進(jìn)行PCR擴(kuò)增山羊脂聯(lián)素基因⑶S序列，膠回收PCR產(chǎn)物。限制性內(nèi)切酶Hind III和BamH I酶切PCR產(chǎn)物和pEGFP-Nl真核表達(dá)載體，酶切后凝膠電泳分離后膠回收產(chǎn)物，然后通過(guò)T4連接酶將山羊脂聯(lián)素基因⑶S區(qū)連入pEGFP-Nl載體，轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞中擴(kuò)繁后測(cè)序，得到正確的重組載體，載體長(zhǎng)度為5420 bp，結(jié)構(gòu)如圖1。
[0031]實(shí)施例3:(—)脂聯(lián)素基因?qū)ι窖蛑境练e的作用
1.細(xì)胞培養(yǎng)和瞬時(shí)轉(zhuǎn)染
(I)SMSCs以5 X 1VmL密度接種到六孔板中，生長(zhǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37°C，5% CO2條件下培養(yǎng)。
[0032](2)待細(xì)胞增殖至貼滿平皿底部80%左右時(shí)，將培養(yǎng)基更換為無(wú)抗生素培養(yǎng)基1.5mL。
[0033](3)根據(jù)轉(zhuǎn)染試驗(yàn)說(shuō)明，分別將10 μ L脂質(zhì)體和4 μ g質(zhì)粒室溫孵育在250 μ L低血清、無(wú)抗生素培養(yǎng)基中5 min，然后將二者混合，室溫孵育20 min，加入到以上細(xì)胞培養(yǎng)基中，輕輕晃動(dòng)混勻培養(yǎng)基。
[0034](4)轉(zhuǎn)染6 h后移除原培養(yǎng)基，利用PBS漂洗細(xì)胞3次，更換新鮮生長(zhǎng)培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24?36 ho
[0035](5)利用熒光顯微鏡檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá)量及亞細(xì)胞定位結(jié)果表明:將SMSCs培養(yǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿底80%?90%時(shí)進(jìn)行瞬時(shí)轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染24 h后熒光顯微鏡檢測(cè)到綠色熒光，表明重組載體成功的在SMSCs中表達(dá)。AdipoQ轉(zhuǎn)染組與pEGFP-Nl空白對(duì)照組熒光比較發(fā)現(xiàn)，AdipoQ轉(zhuǎn)染組綠色熒光只在細(xì)胞質(zhì)中表達(dá)，在細(xì)胞核中未檢測(cè)到。
[0036]2.AdipoQ對(duì)脂肪代謝相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控
收集對(duì)照組、轉(zhuǎn)染組細(xì)胞各3孔，提取總RNA，檢測(cè)合格后反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。利用qPCR檢測(cè)AdipoRl、AdipoR2和脂肪酸合成及成脂分化相關(guān)基因ACT、FAS, C/EBP a、SREBP-1和PPARy的相對(duì)表達(dá)量，同樣利用2一的方法分析各個(gè)基因的相對(duì)表達(dá)量。
[0037]qPCR檢測(cè)SMSCs中過(guò)表達(dá)AdipoQ基因后脂肪酸合成及成脂分化相關(guān)基因表達(dá)量有顯著性變化(試驗(yàn)樣品重復(fù)數(shù)為3)，AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因表達(dá)量顯著升高，分別升高1.85、4.55、4.88和4.25倍，如圖2 ;而AdipoRl、C/ΕΒΡ α和PPAR Y的表達(dá)量無(wú)明顯變化，表明AdipoQ基因能上調(diào)AdipoR2、ACC、FAS和SREBP-1基因的表達(dá)，如圖2。
【權(quán)利要求】
1.一種克隆山羊脂聯(lián)素基因編碼區(qū)序列的方法，它的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:I所述。
2.山羊脂聯(lián)素基因真核重組質(zhì)粒，其特征在于由序列表中SEQID NO:1所述的山羊脂聯(lián)素基因的核苷酸序列和pEGFP-Nl載體構(gòu)建而成，其中利用帶有保護(hù)性堿基、末端分別帶有Hind III和BamH I限制性內(nèi)切酶酶切位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR反應(yīng)的正、反向引物DNA序列如下所示: 正向引物(Fl): 5- CCAAGCTTATGCTGCTGCTGGGAGCTCT -3 ； 反向引物(R1 ):5- CGGGATCCCATTCGATGTTATGGTAGAGAA -3。
3.制備如權(quán)利要求2所述的真核重組質(zhì)粒的方法，按照以下步驟: (1)以山羊脂肪組織的cDNA為模板，PCR擴(kuò)增山羊脂聯(lián)素基因的編碼區(qū)； (2)用HindIII和BamH I限制性內(nèi)切酶分別對(duì)純化后的山羊脂聯(lián)素基因的編碼區(qū)和pEGFP-Nl質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，用連接酶T4 DNA Ligase進(jìn)行酶連接，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5 α，涂布加有Kan抗生素的平板，篩選陽(yáng)性克隆。
4.依據(jù)權(quán)利3所述方法獲得的山羊脂聯(lián)素基因真核表達(dá)載體，在山羊脂聯(lián)素蛋白亞細(xì)胞定位以及研究山羊脂肪沉積過(guò)程中作用的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/85GK104388435SQ201410581934
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】王林杰, 張紅平, 薛科, 李利, 仲濤, 王艷 申請(qǐng)人:四川農(nóng)業(yè)大學(xué)