分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種犬p27單克隆抗體的制備及其應(yīng)用。本發(fā)明提供了一種保藏號(hào)為CGMCCNO.9457的小鼠雜交瘤細(xì)胞3G8，還提供了由保藏號(hào)為CGMCCNO.9457的小鼠雜交瘤細(xì)胞3G8產(chǎn)生的單克隆抗體。本發(fā)明所述的雜交瘤細(xì)胞3G8分泌的單克隆抗體具有良好反應(yīng)活性，可應(yīng)用于犬乳腺腫瘤組織中p27蛋白的檢測(cè)，解決了目前的檢測(cè)難題，為其在犬乳腺腫瘤以及其他疾病的深入研究奠定基礎(chǔ)，為臨床上相應(yīng)的治療及預(yù)后提供了有效手段。
CGMCCNo.9457
2014.07.15
【專利說明】分泌犬027單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種分泌犬？27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株及其應(yīng)用，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]￠27蛋白作為細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(161)611(16111: 1^111886
0(18),通過與各種細(xì)胞周期素-細(xì)胞周期素依賴性激酶(0701111-⑶10復(fù)合物作用發(fā)揮廣譜的抑制0)1(的活性，調(diào)控細(xì)胞周期的進(jìn)程，具有誘導(dǎo)細(xì)胞分化、促進(jìn)凋亡、調(diào)節(jié)腫瘤耐藥性等功能，其活性的改變與細(xì)胞凋亡的發(fā)生存在明顯相關(guān)性。前期的研究結(jié)果表明，惡性腫瘤中？27表達(dá)量顯著降低，證明1)27蛋白與腫瘤的發(fā)生與轉(zhuǎn)移存在明顯的相關(guān)性，它也被認(rèn)為是具有潛在價(jià)值的獨(dú)立預(yù)后因子。進(jìn)一步對(duì)？27蛋白生物學(xué)功能的機(jī)制研究成為當(dāng)前熱點(diǎn)。
[0003]人類乳腺腫瘤以及其他的腫瘤細(xì)胞系過表達(dá)？27不僅誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和 ⑶1(的活性降低，還能有效的促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)生。犬乳腺腫瘤是獸醫(yī)臨床上常見的疾病，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，對(duì)犬的健康構(gòu)成嚴(yán)重危害，尋求犬乳腺腫瘤診斷及預(yù)防的關(guān)鍵靶點(diǎn)是當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。因生活及飲食習(xí)慣更和人類接近，相比于鼠，犬是更為理想的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型，對(duì)于犬腫瘤的研究不僅對(duì)獸醫(yī)臨床有重要價(jià)值，對(duì)于人醫(yī)腫瘤臨床的研究也同樣具有重要意義。市面上銷售的針對(duì)？27蛋白的抗體均為針對(duì)人源或者鼠源，沒有針對(duì)犬源的，所以本發(fā)明制備犬27單克隆抗體，使人們能開展？27與犬乳腺腫瘤的相關(guān)研究具有重要意義。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0004]本發(fā)明的目的是提供一種分泌犬？27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，該細(xì)胞株分泌的犬？27單克隆抗體能夠應(yīng)用于犬乳腺腫瘤病理組織樣品中1)27蛋白的檢測(cè)。
[0005]本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0006]本發(fā)明所提供的雜交瘤細(xì)胞株為能夠分泌犬]327單克隆抗體，該雜交瘤細(xì)胞株已于2014年7月15日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱06100 ”，保藏號(hào)為9457。地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)，中國(guó)科學(xué)院微生物研究所，郵政編碼:100101。該雜交瘤細(xì)胞株的建立是利用原核表達(dá)技術(shù)，表達(dá)犬？27蛋白為抗原，免疫8八18八小鼠，利用淋巴胞雜交瘤技術(shù)建立的特異單克隆抗體雜交瘤細(xì)胞庫獲得的。用該雜交瘤細(xì)胞制備的單克隆抗體，經(jīng)免疫組織化學(xué)染色證明，此單克隆抗體能有效的結(jié)合犬細(xì)胞內(nèi)？27蛋白。間接實(shí)驗(yàn)表明:雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液上清效價(jià)1:: 6400。本發(fā)明的特點(diǎn)如下:
[0007]1.本發(fā)明使用的免疫原是從經(jīng)奶-？0？方法克隆的犬？27基因，利用原核表達(dá)技術(shù)制備的犬]327蛋白。
[0008]2.本發(fā)明所制備的單克隆抗體是針對(duì)犬種屬1)27蛋白，具有種屬特異性，免疫組化實(shí)驗(yàn)證明其有效的和犬腫瘤細(xì)胞中的p27蛋白結(jié)合，根據(jù)其結(jié)果可以對(duì)犬腫瘤患犬的診斷及治療提供指導(dǎo)意義。
[0009]本發(fā)明篩選得到I株小鼠雜交瘤細(xì)胞(mus musculus hybridoma) 3G8,已于2014年7月15日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)”，保藏號(hào)為CGMCCN0.9457。并對(duì)其進(jìn)行生物學(xué)鑒定，以期進(jìn)一步探討p27的蛋白水平與犬乳腺腫瘤發(fā)生、發(fā)展的內(nèi)在聯(lián)系。本發(fā)明中的單克隆抗體具有良好的特異性，為其在腫瘤以及其他疾病發(fā)生反應(yīng)中起到相應(yīng)的作用關(guān)系及其功能的深入研究提供依據(jù)和奠定基礎(chǔ)，為臨床上相應(yīng)的治療及預(yù)后提供了有效手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為犬p27基因片段RT-PCR擴(kuò)增結(jié)果
[0011]圖2為重組犬p27蛋白的SDS-PAGE及純化后的重組蛋白
[0012]圖3為雜交瘤細(xì)胞形態(tài)
[0013]圖4為雜交瘤細(xì)胞株染色體鑒定
[0014]圖5為Western blot分析單克隆抗體特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果
[0015]圖6為單克隆抗體的免疫組化分析結(jié)果

【具體實(shí)施方式】
[0016]實(shí)例1ρ27基因的克隆及測(cè)序
[0017]根據(jù)GenBank中canine p27的cDNA序列(ΝΜ_001002957)，利用引物設(shè)計(jì)軟件oligo 6.24設(shè)計(jì)了一組特異性引物，同時(shí)在正向引物中引入EcoR I酶切位點(diǎn)，反向引物中引入Sal I酶切位點(diǎn)。正向引物為5-CGGAATTCATGGCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3，反向引物為5-CGGTCGACTTACGTTTGACGTCTTCTGAGGC-3。利用上述弓I物PCR擴(kuò)增犬p27基因開放閱讀框內(nèi)位核苷酸，DNA純化試劑盒純化回收PCR產(chǎn)物，使其插入pET28 (a)載體，獲得pET28 (a) -p27重組質(zhì)粒。將該重組質(zhì)粒按常規(guī)方法轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞DH5ci，酶切法鑒定陽性克隆，陽性克隆送往測(cè)序公司測(cè)序。上述所采用的PCR擴(kuò)增，EcoR和Sal I雙酶切，DNA回收，連接于轉(zhuǎn)化等均為現(xiàn)有技術(shù)。
[0018]實(shí)例2免疫原的制備
[0019]分別將構(gòu)建的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)中，涂于Kan_抗性的固體LB平板上，37°C過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆接種于Kan-抗性的液體LB培養(yǎng)液中，37 (°C、250r/min搖床震蕩過夜培養(yǎng)。將過夜活化的陽性克隆按照1: 100的比例接種于Kan-抗性的液體LB培養(yǎng)液中，搖床37°C，250r/min震蕩培養(yǎng)至OD值達(dá)0.6左右時(shí)，加入ImM IPTG，置搖床中250r/min震蕩，37°C培養(yǎng)，之后9000rpm離心收集菌體，棄掉上清并用PBS洗三次。按照原培養(yǎng)液1/100的比例，用PBS重懸菌體沉淀并進(jìn)行超聲破碎，4°C下12000g離心30min后，收集上清液。按照Novagen說明書方法將上清通過N1-NTA樹脂進(jìn)行重組蛋白純化后_70°C保存。
[0020]實(shí)例3動(dòng)物免疫程序
[0021]將純化的His_p27蛋白按100 μ g/只的劑量與等量法國(guó)206VG白油佐劑混合，皮下途徑接種6周齡雌性BALB/c小鼠，兩周后肌肉途徑第二次免疫，再經(jīng)兩周腹腔途徑第三次免疫。兩周后斷尾采血，western blot檢測(cè)血清(I: 1000)效價(jià),對(duì)效價(jià)達(dá)到1: 1000以上的小鼠，經(jīng)腹腔內(nèi)注射加強(qiáng)免疫無佐劑等量抗原，3日后取小鼠脾細(xì)胞進(jìn)行融合。
[0022]實(shí)例4雜交瘤細(xì)胞株的建立
[0023]I飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備
[0024]I)細(xì)胞融合前一天進(jìn)行飼養(yǎng)層細(xì)胞的制備，取I只清潔級(jí)雌性BALB/c小鼠摘除眼球放血處死。于75%酒精中浸泡5min，以下操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。
[0025]2)將小鼠腹部向上放置于平皿中，用鑷子輕輕提起腹正中部皮膚，用眼科剪刀橫向剪一小切口，切勿剪破腹膜，撕開腹部皮膚，使腹膜充分暴露。用鑷子輕輕提起腹膜，用1mL無菌注射器吸取HAT完全培養(yǎng)液輕輕注入腹腔，注意切勿刺破臟器或腸道造成污染，輕輕按摩腹部?jī)蓚?cè)30秒左右，用注射器緩慢抽吸腹腔內(nèi)微黃色液體，重復(fù)以上操作I次。抽吸時(shí)注意避開腸系膜及脂肪組織，以免堵塞注射器。
[0026]3)將取出的腹腔細(xì)胞加入到50mLHAT培養(yǎng)液中，充分吹散混勻后，分裝于5塊96孔培養(yǎng)板中，100 μ L/孔。置于37°C、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0027]2骨髓瘤細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0028]I)融合前I?2d，擴(kuò)大培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞，使其處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，且生長(zhǎng)狀態(tài)良好。
[0029]2)融合當(dāng)天，棄去培養(yǎng)液，并用無血清DMEM輕輕沖洗兩次，用15mL DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液將細(xì)胞從瓶壁上輕輕吹下。取少量骨髓瘤細(xì)胞懸液，用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，準(zhǔn)備融合。
[0030]3免疫脾細(xì)胞的準(zhǔn)備
[0031]I)融合前，將加強(qiáng)免疫的小鼠眼球采血處死，制備陽性血清。浸泡于75%酒精5min后放于超凈工作臺(tái)。
[0032]2)將小鼠固定于鼠架上，無菌打開腹腔，分離結(jié)締組織取出脾臟，將脾臟放入盛有15mLDMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液的平皿中，用無菌注射器吸取培養(yǎng)液輕輕吹出脾細(xì)胞，反復(fù)操作3?4次。
[0033]3)將脾細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)入50mL離心管中，加DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液約至30mL，混勻。對(duì)細(xì)胞懸液用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，備用。
[0034]4脾細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合
[0035]DHAT培養(yǎng)液，DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液及ImL 50% PEG于37°C水浴中預(yù)熱，另備42°C預(yù)熱的滅菌水500mL。
[0036]2)上述準(zhǔn)備的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期SP2/0細(xì)胞與免疫小鼠脾細(xì)胞按1: 5，加入50mL離心管中，輕輕顛倒混勻。26°C，100rpm離心1min,棄上清，重復(fù)洗滌一次(非常關(guān)鍵)，灃意管中DMEM要徹底倒干凈。用手掌輕擊離心管底部，使底部細(xì)胞松散均勻呈糊狀。
[0037]3)融合過程在盛有42°C水的融合杯中進(jìn)行，將ImL 37°C預(yù)熱的PEG溶液逐滴加入到50mL離心管中，邊加邊緩慢轉(zhuǎn)動(dòng)離心管，并于Imin內(nèi)加完，靜置I?2min。
[0038]4)先慢后快地加入DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)液終止反應(yīng)，第Imin滴加ImL DMEM，第2min滴力口 lmLDMEM，第 3min 滴加 3mL DMEM，第 4min 滴加 1mL DMEM，第 5min 滴加 1mL DMEM0 靜置2min。輕輕顛倒2次,靜置7min。800rpm離心1min,棄去上清。用55mL HAT培養(yǎng)液輕輕重懸細(xì)胞，100 μ L/孔接種于已培養(yǎng)有飼養(yǎng)細(xì)胞的96孔培養(yǎng)板中，置37°C 5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
[0039]5) 5d后半量換液，8d后半量換液，待細(xì)胞長(zhǎng)至孔底面積1/4?1/3時(shí)取上清進(jìn)行篩選檢測(cè)并更換為HT培養(yǎng)液。
[0040]5雜交瘤細(xì)胞的篩選
[0041]應(yīng)用間接ELISA方法檢測(cè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，篩選雜交瘤細(xì)胞克隆，將陽性克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，并及時(shí)進(jìn)行細(xì)胞凍存與克隆純化。
[0042]實(shí)例5單克隆抗體的鑒定
[0043]將雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清進(jìn)行系列稀釋，用間接ELISA法測(cè)定抗體效價(jià)。同時(shí)設(shè)定陰性、陽性對(duì)照。P/N比值大于2.1的MAb最大稀釋度為其ELISA效價(jià)。
[0044]應(yīng)用SBA Clonotyping? System/HRP 抗體亞類鑒定試劑盒(Southern B1tech 公司)鑒定單克隆抗體的亞類。具體方法:取已包被的間接ELISA板，以雜交瘤細(xì)胞上清為一抗，以 1: 2500 倍稀釋的 HRP 標(biāo)記的羊抗鼠 IgA, IgM, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、κ、λ 為二抗，TMB室溫避光顯色15min，讀取OD45tol。
[0045]雜交瘤細(xì)胞染色體數(shù)鑒定:
[0046]1.取105個(gè)/mL細(xì)胞，加秋水仙素(終濃度0.2 μ g/mL)，繼續(xù)培養(yǎng)4h ；
[0047]2.1000r/min離心5min,棄上清,加6?8mL 0.075mol/L KCl,立即用吸管將細(xì)胞團(tuán)吹散打勻，室溫下低滲處理25min ；
[0048]3.1000r/min離心5min,棄上清,沿管內(nèi)壁加6?8mL新鮮配制的3:1甲醇冰乙酸固定液，立即用吸管將細(xì)胞團(tuán)吹散打勻，靜置固定30min，1000r/min離心5min，棄上清，同法固定I次；
[0049]4.用新鮮配制的1:1甲醇冰乙酸固定液進(jìn)行第三次固定,20min后，1000r/min離心5min，棄上清，留0.2mL左右的細(xì)胞團(tuán)和上清液；
[0050]5.加適量(約5倍于細(xì)胞體積)的1:1甲醇冰乙酸固定液，制成細(xì)胞懸液。滴片，自然干燥，Giemsa染色,鏡檢并計(jì)數(shù)染色體數(shù)目。
[0051]將重組蛋白的SDS-PAGE、轉(zhuǎn)印、封閉等操作同2.2.5，以雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)液為一抗，羊抗鼠HRP-1gG(l: 2000)為二抗，DAB底物顯色液中顯色，觀察結(jié)果。
[0052]實(shí)例6單克隆抗體免疫組織化學(xué)染色鑒定
[0053]1、石蠟切片脫蠟至水。
[0054]2,3% H2O2室溫孵育5-10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。
[0055]3、蒸餾水沖洗，PBS浸泡5min X2 (如需抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行)。
[0056]4、微波抗原修復(fù):將切片浸入抗原修復(fù)液中，加熱煮沸5min后，放置5_10min ;重復(fù)1-2次。冷卻后PBS洗5minX3次
[0057]5、5%正常山羊血清(5% BSA)封閉，室溫孵育lOmin，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37°C孵育l_2h或4°C過夜。
[0058]6、PBS 沖洗，5minX3 次。
[0059]7、滴加適量的生物素標(biāo)記二抗工作液，37°C孵育10_30min。
[0060]8、PBS 沖洗，5minX3 次。
[0061]9、滴加適量的堿性磷酸酶或辣根酶標(biāo)記的鏈霉卵白素工作液，3 7 °C孵育10_30min。
[0062]10、PBS 沖洗，5minX 3 次。
[0063]11、顯色劑顯色3-15min，顯微鏡下控制染色(DAB或NBT/BCIP)
[0064]12、在自來水的充分沖洗后，蘇木精輕度復(fù)染，脫水，透明，封片。
[0065]13、觀察結(jié)果。
【權(quán)利要求】
1.一株分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為3G8，該雜交瘤細(xì)胞株已于2014年7月15日保藏于“中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(簡(jiǎn)稱CGMCC)”，保藏號(hào)為 CGMCCN0.9457。
2.一種如權(quán)利要求1所述的雜交瘤細(xì)胞株分泌的犬P27單克隆抗體。
3.—種如權(quán)利要求2所述的單克隆抗體在檢測(cè)犬乳腺腫瘤組織樣品中p27蛋白的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N5/20GK104328088SQ201410582165
【公開日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月15日
【發(fā)明者】劉云, 楊超, 包軍, 姚薇, 李超斯, 童津津, 李情 申請(qǐng)人:東北農(nóng)業(yè)大學(xué)