一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的lamp引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、試劑盒及方法，是通過(guò)肺炎克雷伯氏菌tyrB基因序列設(shè)計(jì)LAMP引物，建立適用于臨床樣品檢測(cè)、特異性強(qiáng)、靈敏度高的鼠肺炎克雷伯氏菌可視化檢測(cè)方法；可通過(guò)觀測(cè)綠色熒光的有無(wú)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低檢測(cè)限為5.6拷貝數(shù)/反應(yīng)。本發(fā)明設(shè)計(jì)和篩選的4條引物對(duì)靶序列的特異序列區(qū)的識(shí)別，保證了LAMP擴(kuò)增的高度特異性，適合基層現(xiàn)場(chǎng)應(yīng)用。
【專利說(shuō)明】-種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)微生物檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP 引物及檢測(cè)方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 肺炎克雷伯氏菌為革蘭氏陰性、不運(yùn)動(dòng)型、有莢膜、乳酸發(fā)酵、兼性厭氧的桿狀細(xì) 菌。肺炎克雷伯氏菌通常寄居在大小鼠和其他動(dòng)物的腸道。作為機(jī)會(huì)致病菌，肺炎克雷伯 氏菌一旦進(jìn)入呼吸道，即可感染大小鼠，造成嚴(yán)重肺部損傷，并且該菌在耐抗生素裸鼠中有 取代其他細(xì)菌的更強(qiáng)的生長(zhǎng)趨勢(shì)，為實(shí)驗(yàn)用嚙齒動(dòng)物的常見(jiàn)健康監(jiān)控指標(biāo)之一。
[0003]目前常用的肺炎克雷伯氏菌檢測(cè)方法包括使用監(jiān)測(cè)拭子直接鋪板法及顯色培養(yǎng) 基法和常規(guī)PCR法/熒光定量PCR法，均可以有效地檢測(cè)。但細(xì)菌培養(yǎng)法較其他方法存在 難以標(biāo)準(zhǔn)化、耗時(shí)長(zhǎng)，培養(yǎng)基、操作步驟或培養(yǎng)條件在不同實(shí)驗(yàn)室差別較大等缺點(diǎn)，故結(jié)果 可能不一致或出現(xiàn)假陰/陽(yáng)性。常規(guī)PCR法和熒光定量PCR法，需經(jīng)過(guò)變性、退火、延伸，力口 上DNA提取整個(gè)過(guò)程大概需要2?4個(gè)小時(shí)才能出結(jié)果，并且需要精密昂貴的儀器和試劑， 對(duì)基層開(kāi)展快速簡(jiǎn)便的分子診斷不利。
[0004]Notomi等人于2000年發(fā)明環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增（LAMP)技術(shù)，經(jīng)過(guò)逐步改進(jìn)，該技術(shù)借 助6條特異性引物和一種具有鏈置換特性的DNA聚合酶，可在等溫條件下快速、高特異和靈 敏的擴(kuò)增靶序列。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明的目的在于提供一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物、試劑盒及方法。
[0006] 為達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：
[0007] -種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，包括以下2對(duì)引物：外引物F3和B3以 及內(nèi)引物FIP和BIP;FIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID.N0. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.N0. 4所 /_J、i〇
[0008] -種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP試劑盒，該試劑盒包括40iimol.I/1的 FIP1. 0iiL，40iimol.I71 的BIP1. 0iiL，10iimol.I/1 的F30. 5iiL以及 10iimol.I71 的 B30. 5iiL;F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)IP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 1所 示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 3所示，B3的核 苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示。
[0009] 所述試劑盒還包括2X反應(yīng)緩沖液12. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶1iiL，25mMdNTP 1.5iiL以及熒光染料liiL。
[0010] 所述熒光染料為質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 5%的鈣黃綠素水溶液。
[0011] 一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，包括以下步驟：
[0012] 1)提取待檢測(cè)對(duì)象（例如大鼠、小鼠）的DNA;
[0013] 2)將以下組份進(jìn)行混合，構(gòu)建包括2對(duì)引物F3和B3以及FIP和BIP的25iiLLAMP 反應(yīng)體系：
[0014] 2\反應(yīng)緩沖液12.51^，4011111〇1.171的卩1?1.0111，4011111〇1.17 1的81?1.0111， 10iimol.I71 的F30. 5iiL，10iimol.I71 的B30. 5iiL，8U/iiLBst聚合酶 1iiL，25mMdNTP 1. 5yL，待檢測(cè)對(duì)象的DNA2yL，熒光染料1yL，超純水補(bǔ)足至25yL;FIP的核苷酸序列 如SEQ.ID.NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID.NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ.ID.NO. 4所示；
[0015] 3)將LAMP反應(yīng)體系在63°C加熱40min，然后在85°C加熱5min，反應(yīng)完成；
[0016] 4)待反應(yīng)完成后通過(guò)以下方式進(jìn)行結(jié)果的判定：
[0017] 反應(yīng)完成后觀察LAMP反應(yīng)體系是否有顏色的變化，若LAMP反應(yīng)體系顏色發(fā)生變 化則為陽(yáng)性反應(yīng)，表明在待檢測(cè)對(duì)象中檢測(cè)到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反應(yīng)體系顏色未發(fā) 生變化則為陰性反應(yīng)，表明在待檢測(cè)對(duì)象中未檢測(cè)到肺炎克雷伯氏菌。
[0018] 所述待檢測(cè)對(duì)象的DNA的提取方法為：
[0019] 將待檢測(cè)對(duì)象的血液、組織液或化膿液接種于肉湯培養(yǎng)基中，然后在37°C條件下 培養(yǎng)24h得菌液，取菌液離心，將離心得到的上清用DNA試劑盒提取DNA。
[0020] 在檢測(cè)時(shí)還分別設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以肺炎克雷伯氏菌基因組DNA為陽(yáng)性 對(duì)照，以超純水為陰性對(duì)照；在進(jìn)行結(jié)果的判定時(shí)，還與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比較，若待檢 測(cè)對(duì)象所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系以及陽(yáng)性對(duì)照所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系均呈綠色，則判定待 檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性反應(yīng)，若待檢測(cè)對(duì)象所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系以及陰性對(duì)照所 對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系均呈橘黃色，則判定待檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)結(jié)果為陰性反應(yīng)。
[0021] 與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益的技術(shù)效果：
[0022] 本發(fā)明采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作為檢測(cè)目標(biāo)并合成LAMP引物，實(shí)現(xiàn)了對(duì) 肺炎克雷伯氏菌簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)；該基因經(jīng)NCBI BLAST搜索后，在肺炎克雷伯氏菌 種屬間變異率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，與其他種屬細(xì)菌的同源性非常低，因 此可以作為通用性基因檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌。
[0023] 本發(fā)明提供的檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特異性強(qiáng)：所檢測(cè)的陰性對(duì) 照和大小鼠基因組均無(wú)陽(yáng)性結(jié)果。
[0024] 本發(fā)明提供的檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其檢測(cè)靈敏度高：常規(guī)PCR檢 測(cè)方法靈敏度為l〇〇pg/reaction(100copy number/reaction)數(shù)量級(jí)，采用本發(fā)明檢測(cè)方 法，檢測(cè)下限為13. 5fg/反應(yīng)（5. 6拷貝數(shù)/反應(yīng)）
[0025] 本發(fā)明提供的檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其檢測(cè)迅速、出結(jié)果方便：常 規(guī)PCR整個(gè)過(guò)程在2?4個(gè)小時(shí)才能出結(jié)果，熒光定量PCR也需要1?1.5個(gè)小時(shí)，本發(fā)明 提供的檢測(cè)方法在約50分鐘即可出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果。并且操作簡(jiǎn)便，對(duì)儀器要求低，僅需要普 通水浴鍋，并可以通過(guò)染料直接觀測(cè)結(jié)果，省去了電泳的步驟，可在基層檢測(cè)鼠肺炎克雷伯 氏菌的實(shí)踐中有廣泛的應(yīng)用前景，是一種為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部門簡(jiǎn)便、快捷、準(zhǔn)確的檢測(cè)鼠肺炎克 雷伯氏菌的方法，并且適合基層使用。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0026] 圖1為陽(yáng)性反應(yīng)和陰性反應(yīng)的顏色特異性示意圖；
[0027] 圖2為L(zhǎng)AMP特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果示意圖；
[0028] 圖3為梯度稀釋后的LAMP檢測(cè)結(jié)果示意圖；
[0029] 圖中：P0S表示陽(yáng)性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果，K.p表示待檢測(cè)對(duì)象（感染肺炎克雷伯 氏菌）的檢測(cè)結(jié)果，Kp表示肺炎克雷伯氏菌基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果，Sa表示金黃色葡 萄球菌基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果，H 20表示陰性對(duì)照的檢測(cè)結(jié)果，P. a表示綠膿桿菌基因組 DNA的檢測(cè)結(jié)果，Rat表示大鼠基因組DNA的檢測(cè)結(jié)果，Mouse表示小鼠基因組DNA的檢 測(cè)結(jié)果，a表不5. 6X 106copies/li L的檢測(cè)結(jié)果，b表不5. 6X 105copies/li L的檢測(cè)結(jié) 果，c表不5. 6X 104copies/li L的檢測(cè)結(jié)果，d表不5. 6X 103copies/li L的檢測(cè)結(jié)果，e 表示5. 6X 102copies/ ii L的檢測(cè)結(jié)果，f表示5. 6X lOcopies/ ii L的檢測(cè)結(jié)果，g表示 5. 6copies/ii L的檢測(cè)結(jié)果，h表不5. 6X KTicopies/ii L的檢測(cè)結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
[0030] 下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明做詳細(xì)說(shuō)明，所述是對(duì)本發(fā)明的解釋而不是限 定。
[0031] 本發(fā)明公開(kāi)了一種檢測(cè)實(shí)驗(yàn)用鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，該檢測(cè)方法基于 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增來(lái)進(jìn)行的。
[0032] 本發(fā)明針對(duì)肺炎克雷伯氏菌tyrB基因（基因登錄號(hào)AF074934)，設(shè)計(jì)了包括外引 物、內(nèi)引物的特異性引物。只需在建立的LAMP反應(yīng)體系加入樣品即可通過(guò)觀測(cè)綠色熒光的 有無(wú)快速準(zhǔn)確的檢測(cè)出肺炎克雷伯氏菌的存在，最低檢測(cè)限為5. 6拷貝數(shù)/反應(yīng)，為快速檢 測(cè)大小鼠肺炎克雷伯氏菌提供了一個(gè)適合基層的便捷方法。
[0033] 1、引物設(shè)計(jì)與合成：
[0034] 考慮到檢測(cè)的特異性和準(zhǔn)確性，采用肺炎克雷伯氏菌tyrB基因作為檢測(cè)目標(biāo)并 合成LAMP引物，這是由于tyrB基因經(jīng)NCBI BLAST搜索后，在肺炎克雷伯氏菌種屬間變異 率低且兼顧不同血清型之間的保守序列，與其他種屬細(xì)菌的同源性非常低，因此可以作為 通用性基因檢測(cè)肺炎克雷伯氏菌。
[0035] 采用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Explorer 4. 0,針對(duì)肺炎克雷伯氏菌tyrB基因的保守 區(qū)設(shè)計(jì)了 4條LAMP引物，包括正向/反向內(nèi)引物FIP/BIP，正向/反向外引物F3/B3，所述 引物與tyrB(基因登錄號(hào)：AF074934)基因150?333位的核酸序列的一部分或其互補(bǔ)鏈 互補(bǔ)。具體的引物序列見(jiàn)表1。
[0036] 表1 LAMP方法檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌用引物序列
[0037]

【權(quán)利要求】
1. 一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP引物，其特征在于：包括以下2對(duì)引物：外引物 F3和B3以及內(nèi)引物FIP和BIP ;FIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4 所示。
2. -種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP試劑盒，其特征在于：該試劑盒包括 40 ii mol ? I71 的 FIP 1. 0 ii L，40 ii mol ? I71 的 BIP 1. 0 y L，10 y mol ? I71 的 F3 0? 5 y L 以 及l(fā)Oiimol ? I71的B3 0. 5iiL ;F3和B3為外引物，F(xiàn)IP和BIP為內(nèi)引物，F(xiàn)IP的核苷酸序 列如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示。
3. 如權(quán)利要求2所述一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP試劑盒，其特征在于：所述試 劑盒還包括2 X反應(yīng)緩沖液12. 5 ii L，8U/ ii L Bst聚合酶1 ii L，25mM dNTP 1. 5 ii L以及熒 光染料1 y L。
4. 如權(quán)利要求3所述一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP試劑盒，其特征在于：所述熒 光染料為質(zhì)量分?jǐn)?shù)〇. 5%的鈣黃綠素水溶液。
5. -種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：包括以下步驟： 1) 提取待檢測(cè)對(duì)象的DNA ; 2) 將以下組份進(jìn)行混合，構(gòu)建包括2對(duì)引物F3和B3以及FIP和BIP的25 ii L LAMP反 應(yīng)體系： 2 X 反應(yīng)緩沖液 12.5 iiL，的 FIP 1.0 iiL，的 BIP 1.0 iiL， 10 ii mol ? I71 的 F3 0? 5 ii L，10 ii mol ? I71 的 B3 0? 5 ii L，8U/ ii L Bst 聚合酶 1 ii L，25mMdNTP 1. 5 y L，待檢測(cè)對(duì)象的DNA 2 y L，熒光染料1 y L，超純水補(bǔ)足至25 y L ;FIP的核苷酸序列 如SEQ. ID. NO. 1所示，BIP的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 2所示，F(xiàn)3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 3所示，B3的核苷酸序列如SEQ. ID. NO. 4所示； 3) 將LAMP反應(yīng)體系在63°C加熱40min，然后在85°C加熱5min，反應(yīng)完成； 4) 待反應(yīng)完成后通過(guò)以下方式進(jìn)行結(jié)果的判定： 反應(yīng)完成后觀察LAMP反應(yīng)體系是否有顏色的變化，若LAMP反應(yīng)體系顏色發(fā)生變化則 為陽(yáng)性反應(yīng)，表明在待檢測(cè)對(duì)象中檢測(cè)到肺炎克雷伯氏菌；若LAMP反應(yīng)體系顏色未發(fā)生變 化則為陰性反應(yīng)，表明在待檢測(cè)對(duì)象中未檢測(cè)到肺炎克雷伯氏菌。
6. 如權(quán)利要求5所述一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：所述待檢 測(cè)對(duì)象的DNA的提取方法為： 將待檢測(cè)對(duì)象的血液、組織液或化膿液接種于肉湯培養(yǎng)基中，然后在37°C條件下培養(yǎng) 24h得菌液，取菌液離心，將離心得到的上清用DNA試劑盒提取DNA。
7. 如權(quán)利要求5所述一種檢測(cè)鼠肺炎克雷伯氏菌的LAMP方法，其特征在于：在檢測(cè) 時(shí)還分別設(shè)立陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照，以肺炎克雷伯氏菌基因組DNA為陽(yáng)性對(duì)照，以超純水 為陰性對(duì)照；在進(jìn)行結(jié)果的判定時(shí)，還與陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照比較，若待檢測(cè)對(duì)象所對(duì)應(yīng)的 LAMP反應(yīng)體系以及陽(yáng)性對(duì)照所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系均呈綠色，則判定待檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè) 結(jié)果為陽(yáng)性反應(yīng)，若待檢測(cè)對(duì)象所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng)體系以及陰性對(duì)照所對(duì)應(yīng)的LAMP反應(yīng) 體系均呈橘黃色，則判定待檢測(cè)對(duì)象的檢測(cè)結(jié)果為陰性反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12R1/22GK104328174SQ201410583258
【公開(kāi)日】2015年2月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】師長(zhǎng)宏, 路凡, 陳新雨, 張海, 趙勇, 白冰, 張彩勤 申請(qǐng)人:中國(guó)人民解放軍第四軍醫(yī)大學(xué)