一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。本發(fā)明通過pH指示劑結(jié)合高通量篩選，能夠從大量菌株中篩選獲得有機(jī)酸產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株，簡(jiǎn)化了整個(gè)篩選過程和提高了篩選效率。本發(fā)明還將pH指示劑結(jié)合的高通量篩選與常規(guī)育種方法相結(jié)合，獲得了一株α-酮戊二酸的高產(chǎn)菌株，相較于原始菌，該菌株的產(chǎn)量在搖瓶上提高了51.8％，在3L發(fā)酵罐上提高了45.4％。
【專利說明】一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，屬于微生物【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002] α-酮戊二酸（a-KG)是三羧酸循環(huán)中一個(gè)關(guān)鍵的中間代謝產(chǎn)物，是氨基酸和蛋 白質(zhì)代謝過程中主要的前提物質(zhì)，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)和化妝品等領(lǐng)域。但低生 產(chǎn)效率這一缺陷嚴(yán)重地限制了發(fā)酵法生產(chǎn)α-酮戊二酸在工業(yè)上的發(fā)展和應(yīng)用，因此，對(duì) α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的篩選迫在眉睫。
[0003]目前，有機(jī)酸的檢測(cè)一般使用氣相色譜法或者HPLC法，用此方法來篩選菌株存在 繁瑣、效率低等缺點(diǎn)。還沒有關(guān)于高通量篩選α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株方面的相關(guān)報(bào)道。
[0004] 本發(fā)明通過利用有機(jī)酸生產(chǎn)過程中pH變化這一特性，結(jié)合pH指示劑和高通量技 術(shù)建立了高效、快速篩選有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的方法。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明提供一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，是先將待篩選菌株于含有變 色范圍包含了pH2. 6?5. 2中的任一pH值的pH指示劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，選取變色圈 較大的菌株于高通量孔板中發(fā)酵后，再加入變色范圍包含了pH1. 4?3. 2中的任一pH值 的PH指示劑進(jìn)行復(fù)篩，選取變色較大的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。
[0006] 所述方法，是先用含有溴甲酚綠或百里酚藍(lán)或剛果紅的培養(yǎng)基對(duì)待篩選菌株進(jìn)行 初篩，挑選變色圈較大的菌落，于高通量孔板中發(fā)酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶紅或橙 黃IVpH指示劑，進(jìn)行復(fù)篩，選取變色較大的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。
[0007] 所述有機(jī)酸可以是以下任意一種：檸檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、蘋果酸、 α-酮戊二酸、苯丙酮酸、a_酮異己酸、延胡索酸、脂肪酸、草酰乙酸。
[0008] 所述有機(jī)酸在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中是α-酮戊二酸。
[0009]所述溴甲酚綠或百里酚藍(lán)或剛果紅，在培養(yǎng)基中的添加量為常規(guī)添加量。
[0010]所述溴甲酚綠指示劑的配制方法：溴甲酚綠〇.lg，加0.05mol/L氫氧化鈉溶液 2. 8ml使溶解，再加水稀釋至200ml，變色范圍pH3. 6?5. 2。
[0011] 所述溴甲酚綠，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是直接在培養(yǎng)基中加入終濃度在 0. 2-0. 5g/L的固體溴甲酚綠。在高產(chǎn)有機(jī)酸菌株的培養(yǎng)基中，溴甲酚綠變色明顯，而且對(duì)細(xì) 胞沒有毒害作用。
[0012] 所述初篩，可以是將菌株點(diǎn)種、涂布或者劃線在平板上。
[0013]所述高通量孔板可以是96深孔板、96淺孔板、48深孔板、24深孔板、12深孔板等 任意一種具有高通量篩選作用的培養(yǎng)器皿。
[0014] 所述喹哪啶紅pH指示劑的配制方法：取喹哪啶紅0. lg，加甲醇IOOml使溶解，即 得。變色范圍pHl. 4?3. 2 (無色一紅）。
[0015] 所述加入喹哪啶紅pH指示劑的量，為上清體積1/25至1/100。
[0016] 所述加入橙黃IVpH指示劑的量,為上清體積1/50至1/200。
[0017] 所述加入喹哪啶紅或橙黃IVpH指示劑后，反應(yīng)5 - 60min。
[0018] 所述加入喹哪啶紅pH指示劑的量，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為上清體積的 1/50。
[0019] 所述加入橙黃IVPH指示劑的量，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，為上清體積的 1/200。
[0020] 所述上清，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是將發(fā)酵液離心后獲得的。
[0021] 所述復(fù)篩，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式，還可以是加入喹哪啶紅pH指示劑后，測(cè)定 OD52tl，數(shù)值相對(duì)較小的即為復(fù)篩得到的菌株。
[0022] 所述復(fù)篩，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式，還可以是加入橙黃IVpH指示劑后，測(cè)定 OD52tl，數(shù)值相對(duì)較大的即為復(fù)篩得到的菌株。
[0023] 本發(fā)明還提供一種利用所述高通量篩選方法來篩選α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的方 法，是先將待篩選菌株于含有溴甲酚綠的培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，挑取變色圈較大的菌落，再于 高通量孔板中發(fā)酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶紅pH指示劑，選取變色較大的菌株為復(fù) 篩得到的菌株，對(duì)復(fù)篩得到菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，即得到α-酮戊二酸相對(duì)高產(chǎn)菌株。
[0024] 所述菌株是任意一種：能生產(chǎn)有機(jī)酸的菌株。
[0025] 所述高產(chǎn)菌株，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是在發(fā)酵過程中能使發(fā)酵液的pH能 夠達(dá)到3. 6以下的菌株。
[0026] 所述菌株，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是解脂亞洛酵母Yarrowialipolytica。
[0027] 所述菌株，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是YarrowialipolyticaCCTCCNO: M207143及其經(jīng)ARTP誘變后得到的菌株。
[0028] 所述復(fù)篩，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式，還可以是加入喹哪啶紅pH指示劑后，測(cè)定 OD52tl，數(shù)值相對(duì)較小的即為復(fù)篩得到的菌株。
[0029] 所述加入喹哪啶紅pH指示劑的體積為上清體積的1/50,上清中α-酮戊二酸 的量為〇. 6g/L-4. 8g/L時(shí)，反應(yīng)30min后，OD52tl與α-酮戊二酸量存在線性方程：Y= 0.02842Χ+0. 2039。
[0030] 所述復(fù)篩，本領(lǐng)域技術(shù)人員，可以通過調(diào)整發(fā)酵時(shí)間、稀釋或者濃縮發(fā)酵液等方 法，使上清中α-酮戊二酸的量在某一合適范圍，以適于用喹哪啶紅PH指示劑進(jìn)行篩選。
[0031] 所述α-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的篩選方法，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，具體是：將 多株Yarrowialipolytica于含有溴甲酚綠指示劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，選取變色圈相對(duì) 較大的菌株為初篩得到的菌株，再于高通量孔板中進(jìn)行發(fā)酵，發(fā)酵液離心后，取上清加入體 積為上清1/50的喹哪啶紅pH指示劑反應(yīng)30min，測(cè)定OD52tl，選取OD52tl相對(duì)較小的菌株作為 復(fù)篩得到的菌株，再于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)后進(jìn)行驗(yàn)證。
[0032] 所述高通量深孔板中進(jìn)行發(fā)酵，在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是指在發(fā)酵培養(yǎng)基， 于 28°C，900rpm下，發(fā)酵 96h。
[0033] 所述驗(yàn)證，是指采用高效液相色譜測(cè)定菌株發(fā)酵后α-酮戊二酸產(chǎn)量，以確定復(fù) 篩菌株是相對(duì)高產(chǎn)菌株。
[0034]本發(fā)明建立了一種新型篩選方法，結(jié)合了pH指示劑的高通量篩選的方法，極大 地簡(jiǎn)化了整個(gè)篩選過程。本發(fā)明方法能夠快速地從大量菌株中篩選獲得高產(chǎn)有機(jī)酸的菌 株。本發(fā)明還可以與其他育種方法（比如說誘變育種、代謝育種技術(shù)、代謝工程改造等）結(jié) 合起來，從大量菌株中篩選目標(biāo)菌株。此外，本發(fā)明還結(jié)合了恒溫常壓等離子體誘變技術(shù) (ARTP)、pH指示劑和高通量篩選技術(shù)，提高α-酮戊二酸的產(chǎn)量和降低副產(chǎn)物丙酮酸的產(chǎn) 量，本發(fā)明經(jīng)過多批次的誘變?cè)俸Y選，得到了一株α-酮戊二酸的高產(chǎn)菌株，同時(shí)相應(yīng)地降 低了發(fā)酵副產(chǎn)物丙酮酸的產(chǎn)量和提高整個(gè)發(fā)酵過程的生產(chǎn)效率。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0035] 圖I:0D520與有機(jī)酸產(chǎn)量的線性關(guān)系；A為喹哪啶紅1/25 ;Β為喹哪啶紅1/50;C 為喹哪啶紅1/100 ;D為橙黃IV1/50 ;E為橙黃IV1/100 ;F為橙黃IV1/200。

【具體實(shí)施方式】
[0036] 本發(fā)明的待篩選菌株，可以是分離自自然界的初篩產(chǎn)物，也可以是人工誘變或者 改造的產(chǎn)物。本發(fā)明同樣適用于從有機(jī)酸產(chǎn)值水平已經(jīng)較高或偏低的菌株中快速篩選有機(jī) 酸產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株，因?yàn)槭紫雀咄靠装逯杏袡C(jī)酸的產(chǎn)量較低，不會(huì)達(dá)到搖瓶或發(fā)酵 罐中一樣的高產(chǎn)值，另外，為獲取目標(biāo)產(chǎn)物為目的的孔板培養(yǎng)技術(shù)是本領(lǐng)域所熟知的，根據(jù) 感興趣的目標(biāo)菌種，相關(guān)的種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基、培養(yǎng)條件和時(shí)間等均可以參照現(xiàn)有技 術(shù)中的相關(guān)指導(dǎo)，予以采納或調(diào)整與改進(jìn)，這些調(diào)整與改進(jìn)都屬于本領(lǐng)域技術(shù)人員的常規(guī) 技能，比如說本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)菌種特性，通過調(diào)整發(fā)酵時(shí)間、稀釋或者濃縮發(fā)酵液 等方法，使有機(jī)酸含量積累在某一合適范圍，以適合本篩選方法進(jìn)行篩選。本發(fā)明方法適用 于各種產(chǎn)有機(jī)酸的菌株，尤其是產(chǎn)α-酮戊二酸的菌株。
[0037] 細(xì)胞干重的測(cè)定：
[0038] 吸取一定量的菌懸液于IOmL容量瓶中，加入2mL鹽酸溶解懸液中的碳酸鈣，加去 離子水定容到10mL，搖勻，用UV7500型可見光分光光度計(jì)，于570nm處測(cè)定OD值，用細(xì)胞 干重標(biāo)準(zhǔn)曲線得出細(xì)胞干重。
[0039] α-酮戊二酸、丙酮酸和甘油的測(cè)定：高效液相色譜（HPLC)
[0040] 儀器：Agilent1260高效液相色譜儀（配紫外可見檢測(cè)器、示差折光檢測(cè)器和工 作站），色譜條件：
[0041] 色譜柱：AminexHPX-87Hionexchangecolumn
[0042] 流動(dòng)相：5mMH2SO4
[0043] 流速：0· 5mL/min
[0044] 柱溫：40。。
[0045] 進(jìn)樣量：10μL
[0046] 紫外檢測(cè)器波長：210nm(檢測(cè)α-酮戊二酸和丙酮酸）
[0047] 示差折光檢測(cè)器：檢測(cè)甘油
[0048] 樣品制備：ImL發(fā)酵液在12,OOOrpm下離心5min，取上清液放入I. 5mL離心管中測(cè) α-酮戊二酸、丙酮酸和甘油的含量。取100μL上清液于5mL容量瓶中，超純水定容到刻度 線，經(jīng)0. 22μL濾膜過濾，濾液供高效液相色譜分析。
[0049] 致死率的計(jì)算：
[0050] 致死率=?X100% A
[0051] 其中A表示空白對(duì)照平板上的菌落形成單位個(gè)數(shù)，S表示經(jīng)過誘變處理后平板上 的菌落形成單位個(gè)數(shù)。
[0052] 所需培養(yǎng)基：
[0053] 種子培養(yǎng)基（g/L)
[0054] 葡萄糖20g，大豆蛋白10g，磷酸二氫鉀l.Og，七水硫酸鎂0.5g，固體培養(yǎng)基添加 20g瓊脂。115°C滅菌 15min。
[0055] 初篩培養(yǎng)基（g/L)
[0056] 葡萄糖20g，大豆蛋白IOg,磷酸二氫鉀I. 0g，七水硫酸鎂0. 5g，溴甲酚綠0. 5g，卡 那霉素l.Og，瓊脂20g。115°C滅菌15min。
[0057] 發(fā)酵培養(yǎng)基（即復(fù)篩和驗(yàn)證培養(yǎng)基）（g/L)
[0058] 甘油100g，硫酸銨3g，磷酸二氫鉀3g，七水硫酸鎂I. 2g，氯化鈉0. 5g，磷酸氫二鉀 〇.lg，鹽酸硫胺6Xl(T7g(過濾除菌），碳酸I1^lOg(單獨(dú)滅菌）。115°C滅菌15min。驗(yàn)證培 養(yǎng)基中加入l〇g/L碳酸鈣。
[0059] 實(shí)施例I :ARTP誘變
[0060] 將保藏在甘油管中的YarrowialipolyticaCCTCCNO:M207143菌種涂布在茄形 瓶斜面上活化24h后，挑取一環(huán)菌體接入種子培養(yǎng)基中（500mL搖瓶裝50mL)，200r/min、 28°C培養(yǎng)17-18h，取ImL菌懸液于I. 5mL無菌離心管中，4500r離心10min，生理鹽水洗滌2 次后，再用生理鹽水適量稀釋制成菌體濃度在IO6?IO7之間的菌懸液，將稀釋的菌懸液均 勻涂布于無菌的載片表面，將載片置于載臺(tái)上，用ARTP誘變育種系統(tǒng)處理，在入射功率為 100W、氦氣流量為10SLM條件下，分別照射1〇8、2〇8、3〇8、4〇8、5〇8、6〇8、9〇8、12〇8，樣品處理 完畢，用無菌鑷子將載片放至裝有Iml生理鹽水的EP管中，振蕩lmin，把附著在菌物載片 上的微生物洗脫到液體中，形成新的菌懸液，對(duì)照組中直接取IOul菌液至Iml生理鹽水中。 將所有的新的菌懸液稀釋至10' 10'KT3三個(gè)梯度，分別取100μLKT1、10'KT3梯度的菌 懸液涂布固體平板上，每組做3組平行。28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后，計(jì)數(shù)每塊平板上的 菌落形成單位個(gè)數(shù)，再分別計(jì)算出每個(gè)處理時(shí)間的致死率，進(jìn)而得到在入射功率為100W，氦 氣流量為10SLM條件下的致死曲線，Laroussi等早期的研究表明致死率在90%以上的突變 效果最好，因此，30s作為最佳的誘變處理時(shí)間。
[0061] 實(shí)施例2:顯色劑的選擇
[0062] 根據(jù)α-酮戊二酸發(fā)酵過程中pH值的變化特點(diǎn)，選取了亮綠、喹哪啶紅、橙黃IV、 孔雀綠、百里酚藍(lán)、剛果紅、溴甲酚綠7種顯色劑作為預(yù)選顯色劑，又有48深孔板中的預(yù)實(shí) 驗(yàn)測(cè)出α-酮戊二酸和丙酮酸的產(chǎn)量均在2g/L以下，因此以發(fā)酵培養(yǎng)基為溶解液，加入 〇-酮戊二酸的量0.68/1-4.88/1的梯度濃度，溶解在20(^1^發(fā)酵培養(yǎng)基中，在加入梯度比 例的顯色劑（1/400,1/200,1/100,1/50,1/25)，常溫反應(yīng)30min，在各種顯色劑的最大可見 光吸收值時(shí)測(cè)定吸光值0D。結(jié)果表明溴甲酚綠指示劑在低的酸濃度下就有明顯的變色反 應(yīng)，且不存在殺菌和抑菌作用，可作為初篩平板上的顯色劑；喹哪啶紅加入比例為1/50時(shí) 存在很好的線性關(guān)系，OD52tl與α-酮戊二酸量存在的線性方程為：Y= -〇. 0306X+0. 214,喹 哪啶紅作為復(fù)篩顯色劑。
[0063] 實(shí)施例3:高產(chǎn)α-酮戊二酸菌株的篩選
[0064] 將ARTP誘變處理30s后的菌懸液稀釋成KT1、10_2兩個(gè)濃度梯度，分別吸取100μL 均勻涂布在預(yù)篩平板上，在200r/min、28°C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h，挑取菌落形態(tài)大變色圈 大的菌落轉(zhuǎn)移到96深孔板中的種子培養(yǎng)基中，900r/min，28°C高通量深孔板恒溫振蕩器中 培養(yǎng)48h，以10 %的接種量轉(zhuǎn)接到48深孔板中（裝ImL發(fā)酵培養(yǎng)基（接種后體積）），900r/ min，28°C發(fā)酵培養(yǎng)96h，將48深孔板3500r/min離心lOmin，取200μL上清液于96孔板中， 加入4μL喹哪啶紅pH指示劑反應(yīng)30min后，用酶標(biāo)儀測(cè)定520nm可見光下的吸光值0D52Q。 選擇OD52tl相對(duì)較少的菌株進(jìn)行復(fù)篩實(shí)驗(yàn)。將活化后的出發(fā)菌和初篩得到的誘變菌株分別 以10%的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中（500mL搖瓶裝50mL(接種后體積）），200r/min，28°C培 養(yǎng)168h。得到一株產(chǎn)α-酮戊二酸的量相比出發(fā)菌株提高了 51. 8%的菌株，幾次傳代培養(yǎng) 后產(chǎn)量仍然穩(wěn)定。
[0065] 此外，在篩選過程，同時(shí)選用HPLC對(duì)菌株產(chǎn)α-酮戊二酸量進(jìn)行了定量測(cè)定，發(fā) 現(xiàn)：初篩過程中變色圈大的菌株產(chǎn)酸能力強(qiáng)于變色圈相對(duì)較小的菌株，復(fù)篩過程中，變色較 小或者OD52tl較大的菌株，其α-酮戊二酸產(chǎn)量確實(shí)低于變色較大或者OD52tl較小的菌株，說 明該篩選方法可靠。
[0066] 實(shí)施例4 :高產(chǎn)α-酮戊二酸菌株的發(fā)酵生產(chǎn)驗(yàn)證
[0067] 將實(shí)施例3得到的產(chǎn)量最大提高的菌株與出發(fā)菌株接種到種子培養(yǎng)基中（500mL 搖瓶裝5〇1^)，于20〇1'/11^11，281：培養(yǎng)17-1811條件下培養(yǎng)17-1811，以10%的接種量接入 到31^發(fā)酵罐中（裝1.51^(接種后體積）），60〇1'/ 1^11，281：，1.5^111條件下發(fā)酵16811。發(fā)酵 168h后，與出發(fā)菌株相比，α-酮戊二酸的產(chǎn)量是31. 46g/L，而出發(fā)菌株是21. 64g/L提高 了 45. 4%，丙酮酸的量是30. 45g/L，而出發(fā)菌株是39. 23g/L，降低了 22. 4%。
[0068] 實(shí)施例5:高產(chǎn)丙酮酸菌株的篩選
[0069]將Torulopsisglabrata CCTCC M202019能發(fā)酵生產(chǎn)丙酮酸。將Torulopsis glabrataWSH-Y進(jìn)行紫外誘變后，得到大量突變菌株。將突變菌株和出發(fā)菌株，點(diǎn)種于含有 〇. 2g/L的溴甲酚綠的平板上，剔除負(fù)突變菌株，然后挑出變色圈大的菌株在高通量孔板中 進(jìn)行復(fù)篩，72h發(fā)酵結(jié)束后，離心，在200 μ L上清液中加入3/100的喹哪啶紅，反應(yīng)lOmin， 在酶標(biāo)儀中520nm的波長下對(duì)其反應(yīng)液進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，得到0052(|較出發(fā)菌株低的12株 菌，將這12株菌搖瓶發(fā)酵72h，檢測(cè)丙酮酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這12株菌中，上述測(cè)定的OD52tl 越低的產(chǎn)丙酮酸能力越強(qiáng)。同時(shí)還得到一株丙酮酸產(chǎn)量為36.6g/L的菌株，相對(duì)對(duì)于出發(fā) 菌株32.4g/L提高了12.96%。應(yīng)用此方法，快速、準(zhǔn)確地從大量菌株中篩選得到了一株產(chǎn) 丙酮酸相對(duì)較高的菌株。
[0070] 實(shí)施例6 :顯色劑的選擇
[0071] 將剛果紅、溴甲酚綠和百里酚藍(lán)添加到含有不同濃度有機(jī)酸的培養(yǎng)基中，發(fā)現(xiàn)在 低的酸濃度下都能發(fā)生顏色反應(yīng)，都可作為初篩指示劑。如圖1所示，為溴甲酚綠和百里酚 藍(lán)色顯色解雇，結(jié)果顯示，溴甲酚綠的顏色由藍(lán)色變?yōu)辄S色，顏色變化最明顯，且溴甲酚綠 對(duì)細(xì)胞無毒害作用，用于初篩指示劑，效果最好。
[0072] 將與發(fā)酵上清液體積比為1/25、1/50、1/100的喹哪啶紅指示劑，以及1/50、 1/100U/200的橙黃IV指示劑，與發(fā)酵上清反應(yīng)30min后分別測(cè)定OD52tl。同時(shí)還測(cè)定了發(fā) 酵上清中的有機(jī)酸含量，為了表明實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性，每組分別做5個(gè)平行，結(jié)果發(fā)現(xiàn)OD值 與有機(jī)酸含有之間都存在一定的線性關(guān)系，如圖I(A，喹哪啶紅1/25 ;B，喹哪啶紅1/50 ;C， 喹哪啶紅1/100 ;D，橙黃IV1/50 ;E，橙黃IV1/100 ;F，橙黃IV1/200)所示，加入上清體積的 1/50的喹哪啶紅指示劑后，OD52tl與有機(jī)酸含量的線性關(guān)系最好，因此喹哪啶紅指示劑可以 作為本發(fā)明的優(yōu)選方式之一。
[0073] 實(shí)施例7 :高產(chǎn)有機(jī)酸菌株的篩選
[0074] 將從自然環(huán)境中篩選得到的52株酵母菌，涂布或點(diǎn)種于含有剛果紅的培養(yǎng)基中， 于30°C培養(yǎng)24h時(shí)間，挑選變色圈相對(duì)較大24株菌為初篩的到的菌株，于含有種子培養(yǎng)基 的24深孔板中發(fā)酵培養(yǎng)72h，取發(fā)酵液離心，在200μL上清液中加入1/200的橙黃IV指示 齊[J，反應(yīng)60min，在酶標(biāo)儀中520nm的波長下對(duì)其反應(yīng)液進(jìn)行吸光度的檢測(cè)，得到OD52tl相對(duì) 較高的6株菌，將這6株菌搖瓶發(fā)酵144h，檢測(cè)總有機(jī)酸含量。結(jié)果發(fā)現(xiàn)這6株菌中，上述 測(cè)定的OD52tl越低的產(chǎn)有機(jī)酸能力越強(qiáng)，并得到的一株有機(jī)酸產(chǎn)量為43. 6g/L的相對(duì)產(chǎn)量最 高的菌株。
[0075] 雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技 術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動(dòng)與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范 圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。
【權(quán)利要求】
1. 一種有機(jī)酸高產(chǎn)菌株的高通量篩選方法，是先將待篩選菌株于含有變色范圍包含了 pH2. 6?5. 2中的任一pH值的pH指示劑的培養(yǎng)基中進(jìn)行初篩，選取變色圈較大的菌株于高 通量孔板中發(fā)酵后，再加入變色范圍包含了 PH1. 4?3. 2的任一 pH值的pH指示劑進(jìn)行復(fù) 篩，選取變色較大的菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法是先用含有溴甲酚綠或百里酚 藍(lán)或剛果紅的培養(yǎng)基對(duì)待篩選菌株進(jìn)行初篩，挑選變色圈較大的菌落，于高通量孔板中發(fā) 酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶紅或橙黃IV pH指示劑進(jìn)行復(fù)篩，選取變色較大的菌株進(jìn) 行發(fā)酵驗(yàn)證。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)酸可以是以下任意一種：檸 檬酸、異檸檬酸、琥珀酸、丙酮酸、蘋果酸、a -酮戊二酸、苯丙酮酸、a-酮異己酸、延胡索酸、 脂肪酸、草酰乙酸。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述高產(chǎn)菌株是在發(fā)酵過程中能使發(fā)酵 液的pH能夠達(dá)到3. 6以下的菌株。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述有機(jī)酸是a-酮戊二酸。
6. 根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，所述喹哪啶紅或橙黃IV pH指示劑加入量 分別為上清體積的1/20至1/100或1/50至1/200 ;所述加入喹哪啶紅或橙黃IV pH指示劑 后，反應(yīng)5到60min。
7. -種篩選a-酮戊二酸高產(chǎn)菌株的方法，是先將菌株于含有溴甲酚綠的培養(yǎng)基中進(jìn) 行初篩，挑取變色圈較大的菌落，再于高通量深孔板中發(fā)酵后，取發(fā)酵液上清，加入喹哪啶 紅pH指示劑，選取變色較大的菌株為復(fù)篩得到的菌株，對(duì)復(fù)篩得到菌株進(jìn)行發(fā)酵驗(yàn)證，即 得到a-酮戊二酸相對(duì)高產(chǎn)菌株。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1或7所述的方法，其特征在于，所述菌株是分離自自然界的初篩產(chǎn)物 或人工誘變后菌株或者代謝改造后的菌株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述復(fù)篩是加入喹哪啶紅pH指示劑后，反 應(yīng)30min，測(cè)定OD52(l，數(shù)值相對(duì)較小的即為復(fù)篩得到的菌株。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其特征在于，所述加入喹哪啶紅pH指示劑的量為上清 體積的1/50。
【文檔編號(hào)】C12R1/645GK104357539SQ201410583352
【公開日】2015年2月18日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】周景文, 陳堅(jiān), 曾偉主, 李江華, 堵國成 申請(qǐng)人:江南大學(xué)