用于非酶切非色譜純化方法原核表達融合蛋白Prx的類彈性蛋白多肽ELP的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種用于非酶切非色譜純化方法原核表達融合蛋白Prx的類彈性蛋白多肽ELP，屬基因工程領(lǐng)域。本發(fā)明改變類彈性蛋白五肽單元中第四個氨基酸的種類提高其彈性功能，從而使減小ELP長度成為可能。使ELP五肽單元中第四個堿基含K、V和F的比例為1:6:3。內(nèi)含肽方面，本發(fā)明采用高效內(nèi)含肽gp41-1，該內(nèi)含肽的C端和N端分開表達，并且對其內(nèi)部基因進行了突變。所述的類彈性蛋白多肽ELP為ELP-IN和前體蛋白ELP-IC-PrxI。利用類彈性蛋白的彈性功能進行非色譜純化蛋白PrxI，無需使用色譜柱分離，一定溫度下孵育，目的蛋白就會沉淀，而且沉淀還可以重新溶解于緩沖溶液中，能使蛋白純化更加高效快捷。
【專利說明】用于非酶切非色譜純化方法原核表達融合蛋白Prx的類彈 性蛋白多肽ELP

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種類彈性蛋白多肽ELP，尤其涉及一種用于非酶切非色譜純化方法 原核表達融合蛋白Prx的類彈性蛋白多肽ELP，屬基因工程領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 非酶切非色譜純化技術(shù)是一種用基因工程的方法分離純化融合蛋白的方法。傳統(tǒng) 的蛋白純化依賴于色譜純化，該方法所用儀器價格昂貴，使蛋白生產(chǎn)成本高；含有融合蛋白 的目的蛋白在純化后需要工具酶（如腸激酶）切除標(biāo)簽，該酶生產(chǎn)成本高，特異性差。內(nèi)含 肽介導(dǎo)的自切使得無需加入工具酶，蛋白在一定條件下誘導(dǎo)即可從前體蛋白上游離出來； 利用類彈性蛋白的彈性功能進行非色譜純化蛋白，無需使用色譜柱分離，一定溫度下孵育， 目的蛋白就會沉淀，而且沉淀還可以重新溶解于冰冷的緩沖溶液中，這使蛋白純化更加高 效快捷、經(jīng)濟、操作簡單。因此，類彈性蛋白多肽及內(nèi)含肽的篩選對非酶切非色譜純化技術(shù) 尤為重要。
[0003] 類彈性蛋白多肽ELP是一種人造基因工程蛋白質(zhì)聚合物，它不僅具有彈性功能， 還對環(huán)境溫度非常敏感。它的這些特殊性質(zhì)使其在蛋白純化與質(zhì)粒DNA分離中應(yīng)用廣泛。 其分子量大小從4-60kDa不等。早在10多年前，人們就開始將ELP標(biāo)簽應(yīng)用于蛋白的非 色譜純化，30°C、一定鹽濃度條件下，ELP會發(fā)生聚集，形成不溶的沉淀，將該沉淀通過離心 的方法分離出來。[ffuWYetal,Recombinantproteinpurificationbyself-cleaving aggregationtag.NatProtoc2006;1:2257-2262]。環(huán)境溫度、蛋白濃度、鹽的種類、或者 是ELP的長度會影響ELP這種多肽的沉淀。[FongBAetal,OptimizationofELP-intein mediatedproteinpurificationbysaltsubstitution.ProteinExprPurif2009 ； 66:198-202]。
[0004] 內(nèi)含肽inteins，是internalprotein的縮寫，最初是在1990年由Hirata等人 發(fā)現(xiàn)的，因其特點與內(nèi)含子很像，故稱其內(nèi)含肽。[HirataRetal，Molecularstructure ofagene,VMA1,encodingthecatalyticsubunitofH(+)-translocatingadenosine triphosphatasefromvacuolarmembranesofSaccharomycescerevisiae.JBiol Chem. 1990 ;265:6726-C6733]。大量的基因組測序結(jié)果表明內(nèi)含肽不僅存在于噬菌體和病 毒中，還廣泛存在于古生菌、細(xì)菌和真核生物中。2009年末，inBase共收集了多達450種內(nèi) 含膚。[PerlerFBInBase:theInteinDatabase.NuclAcidsRes. 2002;30:383-384]。 內(nèi)含肽大致分兩類，大內(nèi)含肽和小內(nèi)含肽，它們的區(qū)別在于大內(nèi)含肽中含有歸為內(nèi)切酶結(jié) 構(gòu)域，而小內(nèi)含肽沒有。自切效率較高的mini內(nèi)含肽是將大內(nèi)含肽中的內(nèi)切酶結(jié)構(gòu)域 去除后得到的，該區(qū)域?qū)τ诘鞍椎牧呀鉀]有影響。[ChongSetal，Proteinsplicing oftheSaccharomycescerevisiaeVMAinteinwithouttheendonucleasemotifs. JBiolChem. 1997 ；272:15587-155890DerbyshireVtetal,Geneticdefinitionofa protein-splicingdomain:functionalmini-inteinssupportstructurepredictions andamodelforinteinevolution.ProcNatlAcadSciUSA1997 ;94:11466-11471]〇 通常，細(xì)胞內(nèi)首先形成一個前體蛋白，在其成熟過程中，內(nèi)含肽會通過裂解反應(yīng)從其C端斷 開，然后從其N端斷開，C端和N端的部分又稱為外顯肽，這兩部分會通過分子內(nèi)反應(yīng)形成共 價鍵°[PerlerFBetal,Proteinsplicingelements:inteinsandexteins-adefinition oftermsandrecommendednomenclature.NuclAcidsRes. 1994 ;22:1125-1127]〇
[0005] 內(nèi)含肽在生物【技術(shù)領(lǐng)域】是一種非常有價值的工具，利用內(nèi)含肽的天然的裂解活性 連接蛋白或者多肽，稱之為內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白剪接。內(nèi)含肽還可以用于蛋白環(huán)化、毒性蛋 白的可控表達、非典型氨基酸的連接等，基礎(chǔ)研究中還被用于監(jiān)測體內(nèi)蛋白之間的相互作 用。[ChongS,Harnessinginteinsforproteinpurificationandcharacterization. In:BelfortM,DerbyshireV,StoddardBL,WoodDff(eds)Homingendonucleasesand inteins,vol16.Springer,BerlinHeidelbergNewYork,pp2005 ;273_292:Ozawa Tetal,Inteinsforsplit-proteinreconstitutionsandtheirapplications. In:BelfortM,DerbyshireV,StoddardBL,WoodDff(eds)Homingendonucleasesand inteins,vol. 16.Springer,BerlinHeidelbergNewYork,pp. 2005 ;307_323]〇
[0006] 傳統(tǒng)的蛋白親和純化標(biāo)簽在DNA水平上與目的蛋白基因相融合，但蛋白純化后需 要通過特殊的內(nèi)切蛋白酶將標(biāo)簽切除，而該過程中用到的工具酶價格昂貴，且工具酶特異 性較差，還會影響目的蛋白的活性。因此，內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白分離成為了替代以親和標(biāo)簽為 基礎(chǔ)的蛋白純化技術(shù)的很好的工具。天然的內(nèi)含肽是C端和N端都會發(fā)生裂解，工程用內(nèi) 含肽則使剪接點處的保守殘基發(fā)生突變，這就使得裂解只發(fā)生在內(nèi)含肽和目的蛋白的連接 處。[ChongSetal,Single-columnpurificationoffreerecombinantproteinsusing aself-cleavableaffinitytagderivedfromaproteinsplicingelement.Gene. 1997 ； 192:271-281]。內(nèi)含肽介導(dǎo)的蛋白純化系統(tǒng)最先是由NewEnglandBiolabs公司開發(fā)為商 品，它們使用的是SeeVMA1 內(nèi)含膚。[ChongSetal,Single-columnpurificationoffree recombinantproteinsusingaself-cleavableaffinitytagderivedfromaprotein splicingelement.Gene. 1997 ； 192:271-281]〇
[0007] 內(nèi)含肽自我剪接功能與類彈性蛋白的彈性功能首次結(jié)合是在2006年。[WuWY etal,Recombinantproteinpurificationbyself-cleavingaggregationtag.Nat Protoc. 2006 ;l:2257-2262]。之后人們發(fā)現(xiàn)這種方法在小分子抗菌肽的生產(chǎn)中，不僅成 本低，而且非常方便。[ShenYetal,ExpressionandpurificationofmoricinCM4and humanbetadefensins4inEscherichiacoliusinganewtechnology.MicrobiolResin press. 2010]。由于ELP的彈性功能受到其肽鏈長度的影響，肽鏈越長所需鹽濃度越小、溫 度越低、蛋白濃度越小，同時所表達的蛋白摩爾數(shù)也會減少，目前所使用的ELP較長，蛋白 表達量較少。而目前使用的內(nèi)含肽在表達過程中或在蛋白的提取過程中容易發(fā)生前體蛋白 的自切，造成損失，并且純化后的蛋白自切需要較長時間（12h以上），從而較大程度上影響 目的蛋白的活性，而且這些內(nèi)含肽大多依賴于DTT這類價格昂貴的強還原劑促發(fā)反應(yīng)。在 非酶切非色譜純化技術(shù)中需尋找突變的類彈性蛋白多肽ELP和內(nèi)含肽。
[0008] Prx(peroxiredoxin)是一類新定義的抗氧化物，Prxl是該家族成員之一，對于 清除體內(nèi)活性氧起著重要作用，Prx1屬于2CysPrx，在H202作用下，其N端第51位半 胱氨酸（Cys51SH)被選擇性地氧化為Cys51S0H，同時H202被還原為水而被清除。[KM H，etal.Roleofperoxiredoxinsinregulatingintracellularhydrogenperoxide andhydrogenperoxide-inducedapoptosisinthyroidcells.JBiolChem，2000,27 5 (24):18266-18270:Chuan-XuLiuetal，AdenanthintargetsperoxiredoxinIand IItoinducedifferentiationofleukemiccellsdifferentiationofleukemic cells. 2012 ;8(5) :486-93]。藥物可以通過抑制PrxI活性而阻礙其對活性氧的清除，進而 誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。目前，Prxl現(xiàn)已成為篩選抗腫瘤藥物的重要靶點，因此，原核表達Prxl，對 建立篩藥平臺，篩選抗腫瘤藥物具有重要意義，目前未見原核表達PrxI的非酶切非色譜純 化方法的相關(guān)報道。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0009] 針對ELP較長而影響蛋白的產(chǎn)量，本發(fā)明的目的在于提供一種肽鏈長度短，蛋白 表達量高的類彈性蛋白多肽ELP，實現(xiàn)原核表達PrxI的非酶切非色譜純化。
[0010] 為實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明改變類彈性蛋白五肽單元中第四個氨基酸的種類提高 其彈性功能，從而使減小ELP長度成為可能。使ELP五肽單元中第四個堿基含K、V和F的 比例為1:6:3,增加疏水性氨基酸纈氨酸的比例。內(nèi)含肽方面，本發(fā)明采用了非常高效的一 種內(nèi)含肽gp41_l，該內(nèi)含肽的C端和N端分開表達，并且對其內(nèi)部基因進行了突變，在不影 響其剪接活性的前體條件下增加表達量。
[0011] 具體技術(shù)方案如下：所述的類彈性蛋白多肽ELP為ELP-IN或前體蛋白 ELP-IC-PrxI，ELP-IN是類彈性蛋白與N端內(nèi)含肽的組合，ELP-IC是類彈性蛋白與C端內(nèi)含 肽的組合。
[0012] ￡1^-預(yù)的0嫩序列為5￡〇10勵:3，氨基酸序列為5￡〇10勵:4。
[0013] ELP-IC的DNA序列為SEQIDN0:1，氨基酸序列為SEQIDN0:2。
[0014] 由以上所述的類彈性蛋白多肽ELP組成一對融合蛋白，分別含有SEQIDNO: 2和 SEQIDN0:4中所示的氨基酸序列。
[0015] 所述N端內(nèi)含肽DNA序列為SEQIDNO: 5。所述C端內(nèi)含肽DNA序列為SEQID N0:6。
[0016] 含有本發(fā)明上述一對融合蛋白DNA分子的載體為pET30a-ELP-IC-PrxI和 pET28a-ELP-IN。
[0017] 含有本發(fā)明上述兩種載體的宿主細(xì)胞為大腸桿菌重組菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和 BL21(DE3)/ELP-IC-PrxI。
[0018] 上述一對融合蛋白可用于蛋白的非色譜純化。包括以下步驟：將本發(fā)明所述的一 對融合蛋白按一定比例（1:1質(zhì)量比）混合，加反應(yīng)液RB(ReactionBuffer),適宜條件下誘 導(dǎo)自切，然后分離自切下的目的蛋白Prxl。
[0019] 本發(fā)明創(chuàng)新點在于：改變類彈性蛋白ELP五肽單元中第四個氨基酸的種類，提高 了其彈性功能，從而使ELP長度減小成為可能。使ELP五肽單元中第四個堿基含K、V和F 的比例為1:6:3,增加了疏水性氨基酸纈氨酸的比例。另外，本發(fā)明采用了非常高效的一種 內(nèi)含肽gp41_l，該內(nèi)含肽的C端和N端分開表達，內(nèi)含肽介導(dǎo)的自切使得無需加入工具酶， 蛋白在一定條件下誘導(dǎo)即可使目標(biāo)蛋白從前體蛋白上游離出來，既減小了因自切時間過長 對目的蛋白活性造成的影響，又避免了蛋白在表達和提取過程中發(fā)生剪接。利用類彈性蛋 白的彈性功能進行非色譜純化PrxI蛋白，無需使用色譜柱分離，一定溫度下孵育，目的蛋 白就會沉淀，而且沉淀還可以重新溶解于冰冷的緩沖溶液中，這使蛋白純化更加高效快捷、 經(jīng)濟、操作簡單，具有很好的應(yīng)用前景。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 圖1是本發(fā)明制備方法的流程示意圖。
[0021] 圖2是表達載體的電泳圖。其中各泳道如下：M. 100bpDNALadder標(biāo)準(zhǔn)品； 1.pET28b-ELP-IN質(zhì)粒；2.pET28b-ELP-IN質(zhì)粒NcoI單酶切；3.pET28b-ELP-IN質(zhì)粒 Hindlll單酶切；4.pET28b-ELP-IN質(zhì)粒NcoI/Hindlll雙酶切；5.pET30a-ELP-IC-PrxI質(zhì) 粒；6.pET30a-ELP-IC-PrxI質(zhì)粒HindIII單酶切；7.pET30a-ELP-IC-PrxI質(zhì)粒Ndel單酶 切；8.pET30a-ELP-IC_PrxI質(zhì)粒Ndel/Hindlll雙酶切；9.pGEMT_easy_PrxI質(zhì)粒Hindlll/ BamHI雙酶切。
[0022] 圖3是ELP-IN和ELP-IC-PrxI兩種融合蛋白誘導(dǎo)表達的SDS-PAGE電泳圖。其 中各泳道如下：1.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；2.誘導(dǎo)組；3.對照組。
[0023] 圖4是使用ITC的方法純化啟動蛋白ELP-IN后的SDS-PAGE電泳圖。其中各泳道 如下：1.總蛋白；2.第一循環(huán)離心后上清；3.第一循重新溶解的蛋白；4.第二循環(huán)離心后 上清；5.第二循重新溶解的蛋白；M.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。
[0024] 圖5是不同鹽濃度下，利用ITC方法純化蛋白，所獲得的蛋白產(chǎn)率。橫坐標(biāo)為 (NH4)2S04濃度，縱坐標(biāo)為蛋白產(chǎn)率（產(chǎn)率=純化后所得目的蛋白量/總蛋白中目的蛋白量）
[0025] 圖6是利用ITC的方法一步純化啟動蛋白與前體蛋白共同沉淀，并用不同的溶劑 重新溶解。PBS溶解：a.沉淀后不溶物；b.離心后上清；c.低鹽溶液溶解重新溶解的蛋白。 d.沉淀后不溶物；e.離心后上清；f.重新溶解的蛋白；g.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白。
[0026] 圖7是純化后的蛋白按照1:1的摩爾比例混合，自切百分率在不同溫度條件下隨 時長增加而變化的曲線。橫坐標(biāo)為時間，縱坐標(biāo)為自切百分率。
[0027] 圖8是最適條件下內(nèi)含肽自切百分率隨時長增加而變化的曲線。橫坐標(biāo)為時間， 縱坐標(biāo)為自切百分率。
[0028] 圖9為蛋白自切后經(jīng)可逆相變循環(huán)純化，獲得目的蛋白PrxI和ELP-IN與ELP-IC 的混合物。其中各泳道如下：M.標(biāo)準(zhǔn)分子量蛋白；1-3.PrxI;4, 5.ELP-IN與ELP-IC的混 合物。
[0029] 圖10是PrxI活性檢測曲線。

【具體實施方式】
[0030] 為對本發(fā)明進行更好地說明，結(jié)合附圖，詳細(xì)說明如下：
[0031] 定義：
[0032] 如本文所用，術(shù)語'C端內(nèi)含肽'是指在原內(nèi)含肽gp41_l中靠近C端的內(nèi)含肽， 該種內(nèi)含肽的N端被突變而喪失了這種功能。與其像類似，'N端內(nèi)含肽'是指在原內(nèi)含肽 gp41_l中靠近N端的內(nèi)含肽片段。
[0033] 如本文所用，術(shù)語'可逆相變循環(huán)'縮寫為ITC，是指在特定條件下蛋白由可溶性物 質(zhì)變?yōu)椴蝗苄怨腆w，特定條件下還可以再次溶解。
[0034] 在本發(fā)明中，術(shù)語'自切'和'自我剪接'都是指內(nèi)含肽分子內(nèi)酯交換元件發(fā)生的 分子內(nèi)的共價鍵的斷裂與結(jié)合。
[0035] 如本文所用，術(shù)語'前體蛋白'是指目的蛋白的蛋白前體（ELP-IC-Prx I)，該蛋白 發(fā)生剪接后獲得目的蛋白Prx I。
[0036] 在本發(fā)明中，術(shù)語'啟動蛋白'是用于與前體蛋白結(jié)合后使蛋白具備完整的內(nèi)含肽 分子內(nèi)酯交換元件，而前體蛋白在此之前不會發(fā)生自切。
[0037] 實施例1
[0038] 結(jié)合附圖1說明制備方法。
[0039] 1、啟動蛋白、前體蛋白表達載體和宿主細(xì)胞的構(gòu)建
[0040] (a) ELP-IN、ELP-IC以及Prxl基因的合成
[0041] 由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成引物，通過PCR的方法獲得ELP-IN和 ELP-IC的DNA(SEQ ID NO: 1和SEQ ID N0:3)。引物序列如下：
[0042] ELP-IN：
[0043] 5,弓丨物：
[0044] 5, GGCCATGGCCGTGCCTGGTAAAGGAGTTCC3' (Nco I )
[0045] 3,弓丨物：
[0046] 5 ' GCGCAAGCTTATTCTTTCACATACAGGCACATGCC3'(Hind III)
[0047] ELP-IC：
[0048] 5,弓丨物：
[0049] 5' CCCATATGGTGCCTGGTAAAGGAG3'(Ndel)
[0050] 3,弓丨物：
[0051] 5, TTAAGGATCCGCTGTTATGGGTCAGAATATCGTT3, （BamH I )
[0052] 另外設(shè)計合成兩條引物用于PCR克隆Prx I的cDNA。引物序列如下：
[0053] 5,弓丨物：
[0054] 5? CGGGATCCATGTCTTCAGGAAATGCTAAAATTGG3'(Hind III)
[0055] 3,弓丨物：
[0056] 5' CCCAAGCTTTCACTTCTGCTTGGAGAAATAT3' (BamH I )
[0057] 5'引物包含PrxlN端基因序列并引入酶切位點BamH I ;3'引物含Prx I C 端基因序列、酶切位點Hind III和終止密碼子。用上述引物以實驗室現(xiàn)有的Prxl表達載 體為模板進行PCR，獲得Prxl全基因序列。然后用promega公司的克隆試劑盒將Prxl、 ELP-IN和ELP-IC PCR產(chǎn)物克隆到pGEMT-easy載體上，轉(zhuǎn)化得到的pGEMT-easy-ELP-IN、 pGEMT_easy-ELP-IC、pGEMT_easy-PrxI重組載體至E. coli DH5a中進行測序。測序結(jié)果 表明，克隆得到的三個基因片段與它們的序列一致。
[0058] (b)表達載體pET28b-ELP-IN、pET30a-ELP-IC-PrxI的制備pGEMT-easy-ELP-IN 載體、pGEMT-easy-ELP-IC載體、pGEMT-easy-PrxI載體分別經(jīng)過Nco I和Hind III、Nde I 和8已111^111111和胞(1111酶切。酶切后的￡1^-預(yù)克隆到經(jīng)過相同酶切的口￡丁2813(+)載體 (購自invitrogen公司）中，然后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a ;酶切后的ELP-IC和Prxl則克隆到 經(jīng)過相同酶切的pET30a(+)載體（購自invitrogen公司）中，然后轉(zhuǎn)化至E.coli DH5a。 酶切鑒定圖譜見圖2。
[0059] (c)大腸桿菌重組菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) /ELP-IC-Prxl的構(gòu)建
[0060] 用化學(xué)轉(zhuǎn)化的方法分別將表達載體pET28b-ELP-IN和pET30a-ELP-IC-PrxI轉(zhuǎn) 化至E.coliBL21(DE3)中，篩選陽性克隆，得到分別表達ELP-IN和ELP-IC-Prxl融合蛋白 的工程菌，即大腸桿菌重組菌株BL21 (DE3)/ELP-IN和BL21 (DE3)/ELP-IC-Prxl。
[0061] 2、ELP-IN和ELP-IC-Prxl的表達
[0062] 分別從轉(zhuǎn)化平板上挑取陽性的大腸桿菌BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) / ELP-IC-Prxl于試管中，加入含終濃度為100iig/mlKana的LB培養(yǎng)基，37°C、200rpm條件下 培養(yǎng)至對數(shù)生長期（〇D值為0. 6-0. 9)。然后，加IPTG之終濃度ImM誘導(dǎo)表達10h。8000rpm 離心3min收集菌體，加PBS后將菌體吹勻，再次離心后加入等量PBS重懸，超聲破碎菌體， 8000rpm離心15min。取上清蛋白加LB(LoadingBuffer)于10CTC水浴中變性lOmin后上 SDS-PAGE電泳（積層膠5%，分離膠12% )，染色、脫色、掃描分析。
[0063] 由BioXM2. 6預(yù)測蛋白ELP-IN理論分子量為19. 4KD，ELP-IC-Prxl理論分子量為 36. 3KD。SDS-PAGE電泳結(jié)果表明：在15KD和25KD以及35KD和45KD之間有明顯的誘導(dǎo)表 達條帶，分子量大小與預(yù)期相符，融合蛋白表達量占菌體總蛋白50%左右，表達為可溶性蛋 白（圖3)。
[0064] 3、兩種蛋白的分離純化
[0065] (a)啟動蛋白的分離純化
[0066] 工程菌在發(fā)酵后收集菌體，冰浴條件下超聲波處理菌體懸浮液，處理后的菌液在 8000rmp、4°C條件下離心15min，蛋白ELP-IN主要在上清中。
[0067] 進行可逆相變循環(huán)純化蛋白：向上述獲得的上清蛋白中加入（NH4)2S04至終濃 度為0. 2M，室溫孵育10min后，離心6min。棄上清后加入冰冷的PBS(300mMNaCl，100mM NaH2P04)，將沉淀吹勻，離心6min，上清中為目的蛋白。如所得蛋白純度較低，可在此加 入（冊14)250 4進行第二個循環(huán)的純化，直至達到理想的純度。去除雜蛋白后所得目的蛋白 ELP-IN大小與理論值一致，純度高達95%以上（圖4)。
[0068] (b) (NH4)2S04濃度對蛋白純化產(chǎn)率的影響
[0069] 設(shè)定濃度梯度，加入蛋白溶液中（NH4)2S04至終濃度為0. 025M、0. 05M、0. 1M、0. 2M 和0. 4M，將重新溶解的蛋白上SDS-PAGE電泳，染色、脫色、掃描分析。結(jié)果表明：(NH4)2S04 終濃度為〇. 2M時，獲得最大產(chǎn)率（圖5)。
[0070] (c)前體蛋白ELP-IC-Prxl的純化
[0071] 前體蛋白提取方法同啟動蛋白，但是加入（見14)250 4至0. 2M時不能發(fā)生沉淀，且加 入過高濃度時蛋白會發(fā)生變性。因此使用ITC的方法不能單獨純化該蛋白，而共沉淀這一 方法很好的解決了這一問題。取一定量的含啟動蛋白的蛋白提取液于EP管中，加（NH4)2S04 至終濃度為〇. 2M，室溫孵育10min后加入含前體蛋白的蛋白提取液，再加入（NH4)2S04至終 濃度為〇. 2M，室溫孵育10min。然后完成ITC剩余部分。重新溶解的蛋白上SDS-PAGE電泳， 染色、脫色、掃描分析。結(jié)果表明：利用共沉淀的方法可以獲得較高純度的兩種蛋白的混合 液（圖6)。
[0072] 實施例2目的蛋白間接條件的摸索
[0073] (a)不同溫度條件下孵育4h
[0074] 純化后的蛋白按照1:1的比例在不同溫度（4°C、10°C、15°C、20°C、25°C)下孵育不 同時長（10min、20min、30min、lh、2h、4h)后，SDS-PAGE電泳檢測，繪制不同溫度條件下自切 百分比與時間的關(guān)系曲線（圖7)。25°C時蛋白自切較為完全，為減小溫度過高對目的蛋白 活性的影響，暫時使用25°C誘導(dǎo)自切。
[0075] 3〇pL反應(yīng)體系：7.5PLH20 7, 5PL 4XReactionbuffer 7, 5PLELP-L'- ?. 5PLKIP-1C-Prx1
[0076] lXReactionbuffer： (50mMTris,lOOmMNaCl, 5%Glycerol)
[0077] (b)25°C水浴誘導(dǎo)蛋白剪接
[0078]啟動蛋白與前體蛋白按1:1比例混合,25°C條件下誘導(dǎo)自切不同時長（lmin, 5min，10min，0. 5h，lh)。SDS-PAGE電泳檢測，0. 5h時蛋白自切完全，前體蛋白已幾乎消失， 繪制自切百分比與時間的關(guān)系（圖8)。
[0079] 實施例3目的蛋白的純化及活性檢測 [0080] (a)目的蛋白的純化
[0081] 純化后的蛋白按照實施例2體系在最適溫度25°C條件下誘導(dǎo)前體蛋白自切0. 5h， 然后用ITC的方法純化獲得目的蛋白Prxl(圖9)。
[0082] (b)PrxI的活性檢測
[0083] 參照 文獻AdenanthintargetsperoxiredoxinIandIItoinduce differentiationofleukemiccells中提到的PrxI活性檢測方法測定上述制備的 PrxI活性。用BioTekSynergy2多功能酶標(biāo)儀（MolecularDevices,USA)檢測不同時間 點的A340值，繪制A340值隨時間變化的曲線（圖10)。
[0084] 結(jié)果：樣品的活性與標(biāo)準(zhǔn)品的活性相當(dāng)，整個純化過程未對蛋白活性造成影響。這 表明，本發(fā)明方法可以用于蛋白產(chǎn)品的生產(chǎn)。
【權(quán)利要求】
1. 用于非酶切非色譜純化方法原核表達融合蛋白Prx的類彈性蛋白多肽ELP，其特征 在于， 所述的類彈性蛋白多肽ELP為ELP-IN或前體蛋白ELP-IC-PrxI，ELP-IN是類彈性蛋 白與N端內(nèi)含肽的組合，ELP-IC是類彈性蛋白與C端內(nèi)含肽的組合； ELP-IN的DNA序列為SEQ ID NO: 3,氨基酸序列為SEQ ID NO: 4 ; ELP-IC的DNA序列為SEQ ID NO: 1，氨基酸序列為SEQ ID NO: 2。
2. 與如權(quán)利要求1所述的類彈性蛋白多肽ELP組合的內(nèi)含肽，其特征在于，所述內(nèi)含肽 N端DNA序列為SEQ ID NO: 5,所述內(nèi)含肽C端DNA序列為SEQ ID N0:6。
3. 如權(quán)利要求1所述的類彈性蛋白多肽ELP組成的一對融合蛋白，其特征在于，分別含 有SEQ ID NO: 2和SEQ ID NO: 4中所示的氨基酸序列。
4. 如權(quán)利要求3所述的類彈性蛋白多肽ELP組成的一對融合蛋白DNA分子載體，其特 征在于,分子的載體為 pET30a-ELP-IC-PrxI 和 pET28a-ELP-IN。
5. 如權(quán)利要求4所述的類彈性蛋白多肽ELP組成的一對融合蛋白DNA分子載體的 宿主細(xì)胞，其特征在于，宿主細(xì)胞為大腸桿菌重組菌株BL21 (DE3) /ELP-IN和BL21 (DE3) / ELP-IC-PrxI〇
6. 如權(quán)利要求1所述的類彈性蛋白多肽在原核表達融合蛋白Prx中應(yīng)用，其特征在于， 采用非酶切非色譜純化方法原核表達融合蛋白Prxl，步驟如下： 純化后的蛋白ELP-IN和ELP-IC-PrxI按照質(zhì)量比1:1在如下體系中25°C孵育4h， 25°C條件下誘導(dǎo)自切0. 5h，然后用ITC的方法純化獲得目的蛋白Prxl ; 30ii L 反應(yīng)體系：7. L H20 7. 5 u L 4XReaction buffer 7. 5u L ELP-IN 7. 5u L ELP-IC-Prx I lXReaction buffer :50mM Tris，100mM NaCl，5% Glycerol。
【文檔編號】C12N15/63GK104387473SQ201410583428
【公開日】2015年3月4日 申請日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】劉宏民, 張貴星, 王西新, 章旭耀, 王龍珍, 王志茹, 袁君, 鄭一超, 趙文, 鄭甲信 申請人:鄭州大學(xué)