實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法及其應(yīng)用，方法包括以下步驟：S1：在待測(cè)基因的編碼區(qū)的任意區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR引物作為對(duì)照引物；S2：對(duì)待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行定位：?jiǎn)?dòng)子區(qū)自起始密碼子起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第一引物，第一引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并向上游步移預(yù)定距離；S3：對(duì)待測(cè)基因的PolyA位點(diǎn)進(jìn)行定位：自終止密碼子起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第二引物，第二引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并向下游步移預(yù)定距離；S4：對(duì)對(duì)照引物、第一引物和第二引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析，確定待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。
【專利說明】實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PoIyA位點(diǎn)的 方法及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及基因轉(zhuǎn)錄【技術(shù)領(lǐng)域】，更具體地，涉及一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因 轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法及其應(yīng)用。

【背景技術(shù)】
[0002] 真核生物的DNA轉(zhuǎn)錄發(fā)生在細(xì)胞核中，是遺傳信息由DNA轉(zhuǎn)換到RNA的過程，包括 啟動(dòng)、延伸和終止階段。在起始階段，RNA聚合酶在 〇亞基引導(dǎo)下識(shí)別并結(jié)合到啟動(dòng)子上， 形成由酶、DNA和核苷三磷酸（NTP)構(gòu)成的三元起始復(fù)合物。在延伸階段，核心酶沿著DNA 分子向前移動(dòng)，隨著堿基的加入，新生的RNA鏈不斷生長(zhǎng)。在轉(zhuǎn)錄終止階段，RNA聚合酶在 Nus A因子幫助下識(shí)別轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，停止轉(zhuǎn)錄，RNA鏈離開模板。此時(shí)生成的mRNA稱為前 體mRNA，須經(jīng)過一系列轉(zhuǎn)錄后加工過程并轉(zhuǎn)移到細(xì)胞質(zhì)中才能表現(xiàn)出翻譯功能。mRNA的加 工過程主要包括加帽（5'端形成特殊的帽子結(jié)構(gòu)），加尾（3'端切斷并加上多聚腺甘酸尾 巴）、剪接（去除內(nèi)含子并拼接外顯子）和甲基化（鏈內(nèi)核苷酸甲基化）。真核生物的mRNA 都有5'帽子結(jié)構(gòu)，即在轉(zhuǎn)錄起始后不久在5'端三磷酸脫去一個(gè)磷酸，然后與GTP反應(yīng)生成 5'，5'_三磷酸相連的鍵，并釋放出焦磷酸，最后以S-腺甘蛋氨酸（SAM)進(jìn)行甲基化產(chǎn)生帽 子結(jié)構(gòu)。5'帽子有助于mRNA穿過核膜，保護(hù)5'端不被降解以及翻譯起始階段時(shí)供eIF4E 識(shí)別等作用；5'非翻譯區(qū)（5' Untranslated region, 5' UTR)在AUG附近含有核糖體結(jié)合 位點(diǎn)，核糖體在此組裝。真核生物的前體mRNA通常還含有終止密碼子下游0. l-9kb長(zhǎng)的序 列，核酸內(nèi)切酶在PolyA位點(diǎn)上切除多余序列，并在PolyA聚合酶的作用下添加20-200個(gè) 腺甘酸殘基，形成多聚腺甘酸的尾巴結(jié)構(gòu)。多聚腺甘酸的尾巴具有增強(qiáng)mRNA的穩(wěn)定性、控 制mRNA的亞細(xì)胞定位和指導(dǎo)特定氨基酸的編碼等作用。完整的基因轉(zhuǎn)錄本包括5'UTR、編 碼區(qū)和3' UTR。
[0003] 全基因組測(cè)序提供了大量的DNA序列，要從中將遺傳信息解讀出來首先要識(shí)別基 因，特別是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控信息。通常情況下，先利用軟件如GRAIL、FGENEH、WebGene、GENSCAN 對(duì)全基因進(jìn)行掃描，然后再用RACE(Rapid Amplification of cDNA Ends，RACE)技術(shù)克隆基 因的非翻譯區(qū)，從而確定轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。
[0004] CL0NTECH開發(fā)的5' -Full RACE kit (貨號(hào)：D315)基于去帽子原理克隆cDNA 5' 末端的完整序列，3'_Full RACE Core Set with PrimerScript RTase (貨號(hào)：D314)使用改 良的PrimeScript反轉(zhuǎn)錄酶克隆cDNA 3'末端的完整序列。其原理是將目的基因的5'非翻 譯區(qū)的5'端和3'非翻譯區(qū)的3'端連上接頭，在接頭的不同部位設(shè)計(jì)一條外側(cè)引物和一條 內(nèi)側(cè)引物（公司提供），再在基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)對(duì)應(yīng)的外側(cè)和內(nèi)側(cè)引物（用戶自備），利用套 式PCR克隆cDNA的5'非翻譯區(qū)和3'非翻譯區(qū)。但是任何克隆技術(shù)都不能從根本上解決特 異性差和擴(kuò)增效率低下的問題。盡管RACE試劑盒采用兩輪PCR擴(kuò)增以提高目的片段的特 異性，但是由于每對(duì)引物中要有一條引物與接頭配對(duì)，導(dǎo)致實(shí)際只有用戶自備的兩條與編 碼區(qū)配對(duì)的引物參與篩選，僅相當(dāng)于一次普通PCR，因此不可避免地出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。未 知基因的非翻譯區(qū)長(zhǎng)度很難利用軟件準(zhǔn)確預(yù)測(cè)，更加大了克隆的難度，如果能夠確認(rèn)目的 片段的長(zhǎng)度，就可以通過改變PCR反應(yīng)條件來提高特異性，例如改變引物退火溫度、延伸時(shí) 間和控制模板的量等。擴(kuò)增效率低下是目前所有PCR擴(kuò)增都面臨問題，片段越長(zhǎng)，擴(kuò)增效率 越低。同一物種中非翻譯區(qū)長(zhǎng)度變化很大，從十幾個(gè)堿基到數(shù)千個(gè)堿基不等，例如Mignone 等人（2002)分析了 5464個(gè)無脊椎動(dòng)物5'UTR，最長(zhǎng)的為4498bp ;3736個(gè)3'UTR，最長(zhǎng)的為 9142bp。在理想狀態(tài)下，5'-FullRACEkit(貨號(hào)：D315)最長(zhǎng)也僅能得到3.2kb的PCR擴(kuò) 增產(chǎn)物（見D315技術(shù)手冊(cè)）；而實(shí)際情況下，500bp以上的片段擴(kuò)增效率明顯下降，克隆難 度增加。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明旨在至少在一定程度上解決上述技術(shù)問題之一。為此，本發(fā)明的一個(gè)目的 在于提出一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法，該方法使用 范圍寬，靈敏度和精確度高。
[0006] 本發(fā)明還提出一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和Po I yA位點(diǎn)的方法 在檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0007] 根據(jù)本發(fā)明第一方面實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA 位點(diǎn)的方法，包括以下步驟：Sl :在待測(cè)基因的編碼區(qū)的任意區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR引 物作為對(duì)照引物；S2 :對(duì)所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行定位：?jiǎn)?dòng)子區(qū)自起始密碼子 起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第一引物，所述第一引物的擴(kuò)增片段大小為第二 預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并向上游步移預(yù)定距離；S3 :對(duì)所述待測(cè)基因的PolyA位點(diǎn)進(jìn)行定位： 自終止密碼子起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第二引物，所述第二引物的擴(kuò)增片 段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并向下游步移預(yù)定距離；S4 :對(duì)所述對(duì)照引物、第一引物 和第二引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析，確定所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 和PolyA位點(diǎn)。
[0008] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PoIyA位點(diǎn)的方 法，用qRT-PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)基因不同區(qū)段的表達(dá)豐度，對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PloyA位點(diǎn)進(jìn)行 精確定位，解決目的基因非翻譯區(qū)長(zhǎng)度不確定性問題，使RACE克隆過程中的引物設(shè)計(jì)擺脫 對(duì)編碼區(qū)的依賴，將設(shè)計(jì)位點(diǎn)前移到起始位點(diǎn)和PloyA位點(diǎn)附近，只需擴(kuò)增500bp以內(nèi)的小 片段，就可以克隆出非翻譯區(qū)，該方法使用范圍寬泛，并且定位的靈敏度和準(zhǔn)確度高。
[0009] 另外，根據(jù)本發(fā)明上述實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和 PolyA位點(diǎn)的方法，還可以具有如下附加的技術(shù)特征：
[0010] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一預(yù)定個(gè)數(shù)為180-220,所述第二預(yù)定個(gè)數(shù)為 50-250,所述預(yù)定距離為1000-8000個(gè)堿基對(duì)。
[0011] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的長(zhǎng)度均為18-25 個(gè)堿基對(duì)。
[0012] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度為 60-65 °C，GC 含量為 40-60 %。
[0013] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度差小 于等于2°C。
[0014] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度相等。
[0015] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第一引物的模板 量相同，所述PolyA位點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第二引物的模板量相同。
[0016] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述對(duì)照引物和第一引物的擴(kuò)增反應(yīng)在同一批次進(jìn) 行；對(duì)照引物和第二引物的擴(kuò)增反應(yīng)在同一批次進(jìn)行。
[0017] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析時(shí)，產(chǎn)物變性數(shù)據(jù)為：從 72°C 到 95°C，每 5s 升溫 0· 2°C。
[0018] 根據(jù)本發(fā)明第二方面實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA 位點(diǎn)的方法在檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
[0019] 本發(fā)明的附加方面和優(yōu)點(diǎn)將在下面的描述中部分給出，部分將從下面的描述中變 得明顯，或通過本發(fā)明的實(shí)踐了解到。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0020] 本發(fā)明的上述和/或附加的方面和優(yōu)點(diǎn)從結(jié)合下面附圖對(duì)實(shí)施例的描述中將變 得明顯和容易理解，其中 ：
[0021] 圖1是根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位 點(diǎn)的方法的流程圖；
[0022] 圖2是本發(fā)明一個(gè)實(shí)施例中qRT-PCR引物的位置圖，其中，P1-P6分別表示引物對(duì) 所對(duì)應(yīng)的位置，Pl引物為對(duì)照引物，位于編碼區(qū)內(nèi)，P2-P6引物為定位引物，其中P2引物的 反向引物位于編碼區(qū)，正向引物位于啟動(dòng)子區(qū)，P3-P6位于啟動(dòng)子區(qū)，ATG表示翻譯起始密 碼子；
[0023] 圖3a是圖2中實(shí)施例的不同qRT-PCR引物的起峰圖譜，圖3b是圖2中實(shí)施例的 不同qRT-PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線；
[0024] 圖4是Axl的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位圖；
[0025] 圖5是本發(fā)明另一個(gè)實(shí)施例中qRT-PCR引物的位置圖，其中，P1-P5分別表示引物 對(duì)所對(duì)應(yīng)的位置，Pl引物為對(duì)照引物，位于編碼區(qū)內(nèi)，P2-P5引物為定位引物，其中P2引物 的正向引物位于編碼區(qū)內(nèi)，反向引物位于3'非翻譯區(qū)，其余引物均位于3'非翻譯區(qū)，ATG表 示翻譯起始密碼子，TGA表示終止密碼子；
[0026] 圖6a是圖5中實(shí)施例的不同qRT-PCR引物的起峰圖譜，圖6b是圖5中實(shí)施例的 不同qRT-PCR引物的擴(kuò)增產(chǎn)物的熔解曲線；
[0027] 圖7是Axl的PolyA位點(diǎn)定位圖。

【具體實(shí)施方式】
[0028] 下面詳細(xì)描述本發(fā)明的實(shí)施例，所述實(shí)施例的示例在附圖中示出，其中自始至終 相同或類似的標(biāo)號(hào)表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附 圖描述的實(shí)施例是示例性的，旨在用于解釋本發(fā)明，而不能理解為對(duì)本發(fā)明的限制。
[0029] 下面首先結(jié)合附圖具體描述根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn) 錄起始位點(diǎn)和Po I yA位點(diǎn)的方法。
[0030] 如圖1所示，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和 PolyA位點(diǎn)的方法包括以下步驟：
[0031] Sl :在待測(cè)基因的編碼區(qū)的任意區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR引物作為對(duì)照引物。
[0032] S2 :對(duì)所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行定位：?jiǎn)?dòng)子區(qū)自起始密碼子起，每隔 第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第一引物，所述第一引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù) 的堿基對(duì)，并向上游步移預(yù)定距離。
[0033] S3 :對(duì)所述待測(cè)基因的PolyA位點(diǎn)進(jìn)行定位：自終止密碼子起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù) 的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第二引物，所述第二引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并 向下游步移預(yù)定距離。
[0034] S4 :對(duì)所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分 析，確定所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。
[0035] 由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位 點(diǎn)的方法，用qRT-PCR技術(shù)同時(shí)檢測(cè)基因不同區(qū)段的表達(dá)豐度，對(duì)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PloyA 位點(diǎn)進(jìn)行精確定位，解決目的基因非翻譯區(qū)長(zhǎng)度不確定性問題，使RACE克隆過程中的引物 設(shè)計(jì)擺脫對(duì)編碼區(qū)的依賴，將設(shè)計(jì)位點(diǎn)前移到起始位點(diǎn)和PloyA位點(diǎn)附近，只需擴(kuò)增500bp 以內(nèi)的小片段，就可以克隆出非翻譯區(qū)，該方法使用范圍寬泛，并且定位的靈敏度和準(zhǔn)確度 商。
[0036] 采用根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn) 的方法，能夠準(zhǔn)確定位基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。定位的精確性取決于定位引物 的密度，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)附近的定位引物密度越大，定位越精確。
[0037] 根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例，所述第一預(yù)定個(gè)數(shù)為180-220,所述第二預(yù)定個(gè)數(shù)為 50-250,所述預(yù)定距離為1000-8000個(gè)堿基對(duì)。
[0038] 其中，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的引物的設(shè)計(jì)可以利用Primer 5. 0軟件：具體地，所述 對(duì)照引物、第一引物和第二引物的長(zhǎng)度均為18-25個(gè)堿基對(duì)，進(jìn)一步地，所述對(duì)照引物、第 一引物和第二引物的退火溫度為60-65°C，GC含量為40-60%。
[0039] 相比于傳統(tǒng)的qRT-PCR，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起 始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法的反應(yīng)體系均使用等量的同一樣品做模板，即所述轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第一引物的模板量相同，所述PolyA位點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第二引物 的模板量相同。
[0040] 優(yōu)選地，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度差小于等于2°C。在本發(fā) 明的一些【具體實(shí)施方式】中，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度相等，即PCR反 應(yīng)均使用同一退火溫度。PCR反應(yīng)須在同一批次運(yùn)行，即所述對(duì)照引物和第一引物的擴(kuò)增反 應(yīng)在同一批次進(jìn)行；對(duì)照引物和第二引物的擴(kuò)增反應(yīng)在同一批次進(jìn)行。
[0041] 為了確保引物的擴(kuò)增特異性，還應(yīng)該進(jìn)行擴(kuò)增片段特異性分析，產(chǎn)物變性的具體 參數(shù)是：對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析時(shí)，產(chǎn)物變性數(shù)據(jù)是從72°c到95°C，每5s升溫0. 2°C。
[0042] 根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PoIyA位點(diǎn)的方 法的數(shù)據(jù)分析具體如下：
[0043] 1)產(chǎn)物特異性判斷：烙解曲線峰單一。
[0044] 2)轉(zhuǎn)錄區(qū)與非轉(zhuǎn)錄區(qū)的區(qū)別：在PCR擴(kuò)增圖譜中，轉(zhuǎn)錄區(qū)起峰（對(duì)照引物為陽性 對(duì)照），非轉(zhuǎn)錄區(qū)不起峰。
[0045] 3)轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)：被定位在起峰引物對(duì)的正向引物結(jié)合位點(diǎn)和相鄰不起峰引物 對(duì)的正向引物結(jié)合位點(diǎn)之間。
[0046] 4) Po I yA位點(diǎn)：被定位在起峰引物對(duì)的反向引物結(jié)合位點(diǎn)和相鄰不起峰引物對(duì)的 反向引物結(jié)合位點(diǎn)之間。
[0047] 由此，根據(jù)本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位 點(diǎn)的方法能夠準(zhǔn)確定位基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。
[0048] 下面結(jié)合具體實(shí)施例描述本發(fā)明實(shí)施例的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始 位點(diǎn)和Po I yA位點(diǎn)的方法。
[0049] 實(shí)施例一利用qRT-PCR精確定位小麥高分子量谷蛋白亞基基因 Axl的轉(zhuǎn)錄起始位 點(diǎn)
[0050] 1、總 RNA 提取
[0051] 以中優(yōu)9507小麥為材料，取開花后14天的未成熟種子5-6粒，加液氮研磨后用于 總RNA提取。
[0052] 1)將采集的小麥種子（約50mg)放入液氮預(yù)冷的研缽中，研成粉末，然后轉(zhuǎn)入預(yù) 冷的I. 5ml離心管中，加入0. 5ml提取液，震蕩4-6min ;再加入0. 5ml水飽和酚：氯仿：異 戊醇=49 :49 :2,潤(rùn)旋震蕩5min，4°C，13000rpm離心5min ;取0· 5ml上清至新管，加入Iml TRIzol充分混勻，冰上放置lOmin。
[0053] 2)4°C，12000rpm離心IOmin,將上清液轉(zhuǎn)移到I. 5ml新的無 RNase離心管中；加入 0. 2ml氯仿，劇烈搖動(dòng)15s，室溫放置5min。
[0054] 3)4°C，12000rpm離心IOmin,將上層水相轉(zhuǎn)移到I. 5ml新的無 RNase離心管中。力口 入0· 5ml異丙醇，1/10體積3M NaAc (pH = 5. 2)顛倒混勻，-70°C放置30min。
[0055] 4) 4°C, 12000rpm 離心 10min。
[0056] 5)棄上清，加入 Iml 70% 乙醇；4°C，IOOOrpm 離心 5min。
[0057] 6)重復(fù)步驟（6) -次。
[0058] 7)棄去上清，室溫干燥5-10min，加入20 μ 1滅菌的DEPC H20溶解RNA，-70°C保 存?zhèn)溆谩?br> [0059] 提取液 IOml :
[0060]

【權(quán)利要求】
1. 一種實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方法，其特征在于，包 括以下步驟： 51 :在待測(cè)基因的編碼區(qū)的任意區(qū)段設(shè)計(jì)一對(duì)實(shí)時(shí)定量PCR引物作為對(duì)照引物； 52 :對(duì)所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)進(jìn)行定位：?jiǎn)?dòng)子區(qū)自起始密碼子起，每隔第一 預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第一引物，所述第一引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿 基對(duì)，并向上游步移預(yù)定距離； 53 :對(duì)所述待測(cè)基因的PolyA位點(diǎn)進(jìn)行定位：自終止密碼子起，每隔第一預(yù)定個(gè)數(shù)的堿 基對(duì)設(shè)計(jì)一對(duì)第二引物，所述第二引物的擴(kuò)增片段大小為第二預(yù)定個(gè)數(shù)的堿基對(duì)，并向下 游步移預(yù)定距離； 54 :對(duì)所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物進(jìn)行擴(kuò)增，并對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析， 確定所述待測(cè)基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方 法，其特征在于，所述第一預(yù)定個(gè)數(shù)為180-220,所述第二預(yù)定個(gè)數(shù)為50-250,所述預(yù)定距 離為1000-8000個(gè)堿基對(duì)。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方 法，其特征在于，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的長(zhǎng)度均為18-25個(gè)堿基對(duì)。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的 方法，其特征在于，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度為60-65°C，GC含量為 40-60%。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方 法，其特征在于，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度差小于等于2°C。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和Po lyA位點(diǎn)的方 法，其特征在于，所述對(duì)照引物、第一引物和第二引物的退火溫度相等。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和PolyA位點(diǎn)的方 法，其特征在于，所述轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第一引物的模板量相同，所述PolyA 位點(diǎn)定位的對(duì)照引物和第二引物的模板量相同。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和 PolyA位點(diǎn)的方法，其特征在于，所述對(duì)照引物和第一引物的擴(kuò)增反應(yīng)在同一批次進(jìn)行；對(duì) 照引物和第二引物的擴(kuò)增反應(yīng)在同一批次進(jìn)行。
9. 根據(jù)權(quán)利要求1-8中任一項(xiàng)所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)和 PolyA位點(diǎn)的方法，其特征在于，對(duì)擴(kuò)增片段進(jìn)行特異性分析時(shí)，產(chǎn)物變性數(shù)據(jù)為：從72°C 到 95°C，每 5s 升溫 0.2°C。
10. -種根據(jù)權(quán)利要求1-9中任一項(xiàng)所述的實(shí)時(shí)熒光定量PCR定位基因轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn) 和PolyA位點(diǎn)的方法在檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104404135SQ201410584393
【公開日】2015年3月11日 申請(qǐng)日期:2014年10月27日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月27日
【發(fā)明者】李小輝, 姜培紅, 晏月明 申請(qǐng)人:首都師范大學(xué)