L-天冬氨酸氧化酶變體和使用所述變體生產(chǎn)喹啉酸或煙酸的方法
【專(zhuān)利摘要】為有效生產(chǎn)喹啉酸，本發(fā)明提供其中由煙酸或NAD導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)被解除的L-天冬氨酸氧化酶變體，和包括所述L-天冬氨酸氧化酶變體在內(nèi)的微生物?？赏ㄟ^(guò)培養(yǎng)包括L-天冬氨酸氧化酶變體在內(nèi)的微生物，有效生產(chǎn)喹啉酸。
KCCM 11434P
20130620
【專(zhuān)利說(shuō)明】L-天冬氨酸氧化酶變體和使用所述變體生產(chǎn)喹啉酸或煙 酸的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及L-天冬氨酸氧化酶變體，包括編碼所述L-天冬氨酸氧化酶變體的基 因的生產(chǎn)喹啉酸的微生物，和使用所述微生物高效生產(chǎn)喹啉酸或煙酸的方法。

【背景技術(shù)】
[0002] 煙酸是尼古丁的氧化物和復(fù)合維生素B的一員。它是一種水溶性維生素，也被稱(chēng) 為尼克酸，或維生素B3,并在動(dòng)物和植物中普遍存在。煙酸的缺乏可能會(huì)導(dǎo)致糙皮病或神經(jīng) 病變。通常，煙酸在體內(nèi)以煙酸酰胺輔酶的形式存在，即，煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD)或 煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP)，并參與氧化還原反應(yīng)。
[0003]喹啉酸（quinolinate)，其也被稱(chēng)為喹啉酸（quinolinic acid)，其由喹啉的氧化 產(chǎn)生。喹啉酸已知具有神經(jīng)毒性并導(dǎo)致多種神經(jīng)障礙。喹啉酸也被認(rèn)為是煙酸的前體。
[0004] 廣泛地適用于食品和藥品的煙酸可以通過(guò)化學(xué)合成法或生物學(xué)生產(chǎn)方法制備?；?學(xué)合成煙酸可能導(dǎo)致包括催化劑在內(nèi)的大量有毒廢料。因此，該廢料需要徹底的管理和高 額費(fèi)用進(jìn)行處理。此外，作為前體的嘧啶具有多種衍生物，且嘧啶的供應(yīng)和價(jià)格波動(dòng)導(dǎo)致煙 酸不穩(wěn)定的價(jià)格。
[0005] 為了從化學(xué)合成方法解決這些問(wèn)題，研究了通過(guò)使用來(lái)源于可再生的碳水化合物 的材料生產(chǎn)煙酸的生物方法。主要通過(guò)兩種生物合成途徑完成煙酸的生物學(xué)生產(chǎn)，其中之 一是由色氨酸作為真核生物起始原料開(kāi)始的煙酸生物合成途徑，另一種是由天冬氨酸作為 原核生物起始原料開(kāi)始的。兩種途徑都使用喹啉酸作為中間體，且通過(guò)喹啉酸磷酸核糖基 轉(zhuǎn)移酶（nadC)、煙酸-單核苷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶（nadD)、NAD合成酶（nadE)、煙酰胺-核苷酸腺 苷轉(zhuǎn)移酶（NMN nadR)和煙酰胺酶（pncA)的作用，從喹啉酸生物合成煙酸。
[0006] 經(jīng)由天冬氨酸的途徑使用重組大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌的煙酸的生物合成的 方法已經(jīng)公開(kāi)（韓國(guó)專(zhuān)利號(hào)10-1223904)。本發(fā)明的發(fā)明人研究了從煙酸的這些生物合成 方法解決問(wèn)題并改善喹啉酸或煙酸的產(chǎn)率，發(fā)現(xiàn)了涉及喹啉酸的高產(chǎn)率生產(chǎn)的酶變體，并 完成了本發(fā)明。
[0007]發(fā)明詳述
[0008] 技術(shù)問(wèn)題
[0009] 本發(fā)明提供了 L-天冬氨酸氧化酶的變體，其顯示出由煙酸或煙酰胺腺嘌呤二核 苷酸（NAD)導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)被解除。
[0010] 本發(fā)明提供了生產(chǎn)喹啉酸的微生物，所述微生物包含L-天冬氨酸氧化酶的變體。
[0011] 本發(fā)明提供了通過(guò)培養(yǎng)微生物生產(chǎn)喹啉酸的方法。
[0012] 本發(fā)明提供了通過(guò)培養(yǎng)微生物和喹啉酸的脫羧生產(chǎn)煙酸的方法。
[0013]技術(shù)方案
[0014] 本發(fā)明的一個(gè)方面提供了 L-天冬氨酸氧化酶的變體，其具有在SEQ ID NO: 1所表 示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
[0015] L-天冬氨酸氧化酶具有將L-天冬氨酸氧化成亞氨基琥珀酸的催化活性，如反應(yīng) 式1所示。
[0016]〈反應(yīng)式1>
[0017] L-天冬氨酸+富馬酸〈=> a -亞氨基琥珀酸+琥珀酸+H+
[0018] L-天冬氨酸+氧〈= > 過(guò)氧化氫+ a -亞氨基琥珀酸+H+
[0019] 本發(fā)明的L-天冬氨酸氧化酶可包括表示為SEQ ID N0:1的氨基酸序列。然而，它 并不限于此，因?yàn)槿Q于微生物物種或菌株，蛋白質(zhì)的氨基酸序列可能存在差異。換言之， 它可以是突變體蛋白或人工變體，該突變體蛋白或人工變體具有在由SEQ ID N0 :1所表示 的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位置包含一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代、刪除、插入或添加的氨基 酸序列，只要它可以將L-天冬氨酸氧化成亞氨基琥珀酸。本文中，〃多個(gè)"可依據(jù)蛋白質(zhì)的 氨基酸殘基的三維結(jié)構(gòu)中的位置或類(lèi)型而有所不同，但具體地是指2至20,特別是2至10， 且更具體地2至5。此外，若基于在個(gè)體或微生物的種類(lèi)的差異，氨基酸的取代、刪除、插入、 添加或反轉(zhuǎn)包括由人工變體或天然突變引發(fā)的那些。
[0020] 編碼本發(fā)明的氨基酸序列的多核苷酸可包含編碼具有表示為SEQ ID N0 :1的氨 基酸序列、或與其同源性為80 %或更多的氨基酸序列、特別是90 %或更多的氨基酸序列、 更具體地95 %或更多的氨基酸序列、特別具體地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核 苷酸序列，只要它具有與L-天冬氨酸氧化酶類(lèi)似的活性。最具體地，它可以是由SEQ ID N0: 24所表示的多核苷酸序列。
[0021] 術(shù)語(yǔ)"同源性"是指兩個(gè)氨基酸序列之間的同一性，且其可由本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知 的方法確定，用BLAST2. 0來(lái)計(jì)算參數(shù)，例如得分、同一性和相似性。
[0022] 此外，編碼本發(fā)明的L-天冬氨酸氧化酶的多核苷酸序列可與SEQ ID.N0 :24的 多核苷酸雜交，或"嚴(yán)格條件"下與從所述SEQ ID. N0 :24的多核苷酸制備的探針雜交，并 且可為編碼正常功能的L-天冬氨酸氧化酶的變體修飾的多核苷酸序列。本文所述的"嚴(yán) 格條件"是指允許多核苷酸之間的特異性雜交的條件，并且例如在Molecular Cloning (A Laboratory Manual, J. Sambrook et al. , Editors,2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press, Cold Spring Harbor, New York,1989)或 Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. ,Editors,John ffiley&Sons,Inc. ,New York)中 有具體描述。例如，其描述，雜交是在65°C的雜交緩沖液（3. 5XSSC、0.02%聚蔗糖、0.02% 聚乙烯吡咯烷酮、0.02%牛血清白蛋白、2.5mM NaH2P04(pH 7)、0.5%SDS、2mMEDTA)中進(jìn) 行。SSC是pH = 7的0. 15M氯化鈉/0. 15M檸檬酸鈉。雜交后，DNA被遞送轉(zhuǎn)移達(dá)到的膜在 室溫用2X SSC清潔沖洗，然后在68°C用0. 1至0. 5X SSC/0. IX SDS再次清潔沖洗。
[0023] 本文所述的術(shù)語(yǔ)"其他氨基酸"是指除了在修飾之前最初位于氨基酸序列中的氨 基酸以外的其他氨基酸殘基。具體地，本發(fā)明所述的其他氨基酸可以包括一種選自以下的 氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲 硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和組氨 酸、但不包括賴(lài)氨酸。具體地，所述其他氨基酸可包括一種選自以下的氨基酸：精氨酸、纈氨 酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和組氨酸。例如，所述其他氨基酸可包括精氨酸。
[0024] 本文所述的術(shù)語(yǔ)"第302位"是指從表示為SEQ ID N0 :1的氨基酸序列的甲硫氨 酸開(kāi)始的氨基酸位置，這是由于所述氨基酸序列的甲硫氨酸被計(jì)數(shù)為第一個(gè)氨基酸殘基。
[0025] 通常，L-天冬氨酸氧化酶的活性通過(guò)積聚在微生物中的煙酸或NAD調(diào)節(jié)，換言之， 它的反饋調(diào)節(jié)通過(guò)煙酸或NAD誘導(dǎo)。由煙酸或NAD導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)（feedback regulation by nicotinic acid or NAD)可以在本發(fā)明的L-天冬氨酸氧化酶的變體中解除，這與普通 的L-天冬氨酸氧化酶不同。
[0026] 本發(fā)明的其他方面提供了具有編碼L-天冬氨酸氧化酶變體的核苷酸序列的多核 苷酸。
[0027] 在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方式中，多核苷酸可具有編碼L-天冬氨酸氧化酶的變體的 核苷酸序列，所述L-天冬氨酸氧化酶的變體具有其中由SEQ ID N0:1所表示的氨基酸序列 中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基酸序列。
[0028] 所述第302位氨基酸可包括一種選自以下的氨基酸：精氨酸、甘氨酸、丙氨酸、絲 氨酸、蘇氨酸、半胱氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、 色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺和組氨酸。相應(yīng)的，對(duì)應(yīng)于第302位氨基酸 的核苷酸序列可以被適當(dāng)取代。在【具體實(shí)施方式】中，在SEQIDN0 :24表示的核苷酸序列中 的第904位至第906位核苷酸可以被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以外的任何核苷酸組合 適當(dāng)取代。
[0029] 本發(fā)明的其它方面提供了包括可操作地連接至調(diào)控序列的上述多核苷酸的載體。
[0030] 所述多核苷酸可以具有在SEQ ID N0 :24表示的核苷酸序列中的第904位至第906 位核苷酸被適當(dāng)取代的核苷酸序列。在【具體實(shí)施方式】中，所述多核苷酸可以具有在SEQ ID NO :24表示的核苷酸序列中的第904位至第906位核苷酸被除AAG、AAA、TAA、TAG和TGA以 外的任何核苷酸組合取代的核苷酸序列。該多核苷酸可以可操作地連接至調(diào)控序列。該調(diào) 控序列可調(diào)節(jié)L-天冬氨酸氧化酶的表達(dá)，并包括啟動(dòng)子、終止子或增強(qiáng)子。
[0031] 本發(fā)明的載體沒(méi)有具體限制，并且可以是本領(lǐng)域中已知的任何載體。例如，該載體 可以是 pCR2. 1-T0P0 載體（Invitrogen，USA)或 pECCG117(KFCC-10673)，但不限于此。
[0032] 本發(fā)明的啟動(dòng)子可以是入PL啟動(dòng)子、trp啟動(dòng)子、lac啟動(dòng)子、17啟動(dòng)子、pPro啟 動(dòng)子、PCJ1啟動(dòng)子或pCJ7啟動(dòng)子（韓國(guó)專(zhuān)利10-0620092)。在【具體實(shí)施方式】中，所述啟動(dòng) 子可以為pCJl啟動(dòng)子，但不限于此。
[0033] 該啟動(dòng)子可以可操作地連接到編碼基因的核苷酸序列。本文所述的術(shù)語(yǔ)"可操作 地連接"是指核酸表達(dá)調(diào)控序列（例如，啟動(dòng)子、信號(hào)序列、轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子結(jié)合位點(diǎn)的陣列、 終止子或增強(qiáng)子）與其他核苷酸序列之間的功能性連接。因此，該調(diào)控序列可調(diào)節(jié)編碼該 基因的核苷酸序列的轉(zhuǎn)錄和/或翻譯。
[0034] 本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了包含上述多核苷酸的微生物，其中所述多核苷酸可以 包含編碼在SEQ ID NO: 1表示的氨基酸序列中的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的氨基 酸序列的核苷酸序列。
[0035] 在【具體實(shí)施方式】中，根據(jù)SEQ ID N0 :1的氨基酸序列中的第302位氨基酸，SEQ ID NO :24的部分核苷酸序列可以被取代。例如多核苷酸可包含在SEQ ID NO :24的核苷酸序 列中的第904位至第906位核苷酸被其他核苷酸取代的多核苷酸。
[0036] 所述多核苷酸可以通過(guò)隨機(jī)突變或基因工程操作獲得。其中的SEQIDN0:1的氨 基酸序列的一部分被部分取代的微生物可以通過(guò)獲得的多核苷酸的轉(zhuǎn)化來(lái)構(gòu)建。
[0037] 本文所述的術(shù)語(yǔ)"轉(zhuǎn)化"是指將基因?qū)胨拗骷?xì)胞中以在其中表達(dá)。轉(zhuǎn)化的基因 可以是任何基因，例如，被插入到宿主細(xì)胞的染色體中的基因，或者宿主細(xì)胞的染色體中不 存在的基因，只要導(dǎo)入的基因是在宿主細(xì)胞內(nèi)可表達(dá)的。該基因包含編碼多肽的多核苷酸， 如DNA和RNA。例如，該基因可以表達(dá)盒的形式導(dǎo)入宿主細(xì)胞，所述表達(dá)盒是多核苷酸結(jié)構(gòu)， 其包括所述基因的自我表達(dá)所需要的元素。通常，表達(dá)盒可以包括可操作地連接到基因的 啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)、核糖體結(jié)合位點(diǎn)和翻譯終止信號(hào)。該表達(dá)盒可以是可自我復(fù)制的表 達(dá)載體形式。該基因也可以自身被導(dǎo)入宿主細(xì)胞或以多核苷酸結(jié)構(gòu)的形式導(dǎo)入宿主細(xì)胞， 并且可操作地連接到宿主細(xì)胞中表達(dá)所需的序列。
[0038] 本文所述的術(shù)語(yǔ)"具有生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物"是指能夠從培養(yǎng)基中的碳源 生產(chǎn)喹啉酸并積累喹啉酸的微生物。
[0039] 為提高生產(chǎn)喹啉酸的能力，需要微生物生產(chǎn)大量的喹啉酸，且生產(chǎn)的喹啉酸可累 積而不用于其他途徑。因此，在本發(fā)明的一些實(shí)施方式中，可以通過(guò)去除或削弱涉及喹啉酸 的分解途徑的喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性，或通過(guò)增強(qiáng)涉及喹啉酸的合成途徑的喹啉 酸合成酶的表達(dá)或活性，或通過(guò)它們的組合，獲得具有改善的生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物。
[0040] 在【具體實(shí)施方式】中，具有改善的生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物還可以被修飾以增強(qiáng) 喹啉酸合成酶的活性。具體地，喹啉酸合成酶的活性增強(qiáng)可以通過(guò)額外導(dǎo)入喹啉酸合成酶 以增加其在微生物中表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。喹啉酸合成酶的活性增強(qiáng)也可以通過(guò)用強(qiáng)啟動(dòng)子替換微 生物中連接到喹啉酸合成酶的啟動(dòng)子來(lái)實(shí)現(xiàn)。此外，喹啉酸合成酶的活性增強(qiáng)可以通過(guò)增 加喹啉酸合成酶本身的活性來(lái)實(shí)現(xiàn)。
[0041] 在將異源喹啉酸合成酶導(dǎo)入的情況下，可以導(dǎo)入編碼該酶的多核苷酸，以增加該 多核苷酸的表達(dá)。編碼喹啉酸合成酶的多核苷酸可以表達(dá)于微生物的質(zhì)粒中，或可被插入 到所述微生物的染色體中，并在其中表達(dá)。
[0042] 喹啉酸合成酶可以具有由SEQ ID N0 :29所表示的氨基酸序列，或者可以具有與 其同源的氨基酸序列。換言之，它不局限于此，因?yàn)槿Q于微生物物種或菌株，蛋白質(zhì)的氨 基酸序列可能存在差異。它可以是具有下述氨基酸序列的突變體蛋白或人工變體，所述氨 基酸序列在由SEQ ID N0 :29所表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、刪除、插 入或添加一個(gè)或多個(gè)氨基酸，只要它可以從亞氨基琥珀酸合成喹啉酸。編碼該酶的基因 nadA的序列可以通過(guò)大腸桿菌的基因組序列（gi :GI :89109380)獲得，該序列披露于文章 (MolSystBiol.，2006;2:2006.0007.，Epub 2006 年 2 月 21 日），或可從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù) 信息中心（NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（DDBJ)獲得。另外，編碼本發(fā)明的氨基酸序 列的多核苷酸可包含編碼具有表示為SEQ ID N0 :29的氨基酸序列、或與其同源性為80% 或更多的氨基酸序列、特別是90 %或更多的氨基酸序列、更具體地95 %或更多的氨基酸序 列、特別具體地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有與L-天冬氨 酸氧化酶類(lèi)似的活性。最具體地，它可以是由SEQ ID N0 :26所表示的多核苷酸序列。
[0043] 喹啉酸合成酶具有從亞氨基琥珀酸合成喹啉酸的活性，如反應(yīng)式2所示。
[0044]〈反應(yīng)式2>
[0045] a -亞氨基琥珀酸+二羥基丙酮磷酸〈= > 喹啉酸+磷酸+2H20
[0046] 因此，編碼該喹啉酸合成酶的基因的表達(dá)增強(qiáng)或這種酶的活性增強(qiáng)時(shí)，喹啉酸在 細(xì)胞中的產(chǎn)率會(huì)增加。
[0047] 在一些實(shí)施方式中，在具有生產(chǎn)喹啉酸能力的微生物中，天冬氨酸氧化酶和喹啉 酸合成酶的活性可以通過(guò)用強(qiáng)啟動(dòng)子取代內(nèi)源性啟動(dòng)子增強(qiáng)，或通過(guò)誘導(dǎo)啟動(dòng)子的突變 增強(qiáng)，或通過(guò)增加基因的拷貝數(shù)增強(qiáng)。對(duì)于強(qiáng)啟動(dòng)子的取代，可以使用通常已知的強(qiáng)啟動(dòng) 子，其包括 pTac、pTrc、pPro、pR、pL、pCJl、pCysK 等。
[0048] 在【具體實(shí)施方式】中，提供了具有改善的生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物，其中，喹啉酸 磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可以額外降低或消除。
[0049] 喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性可通過(guò)修飾編碼喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的基 因，或通過(guò)使用抑制轉(zhuǎn)錄的microRNA被降低或去除。
[0050] 喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶可具有由SEQ ID N0 :30所表示的氨基酸序列或與其高 度同源的氨基酸序列。換言之，它不局限于此，因?yàn)槿Q于微生物物種或菌株，蛋白質(zhì)的氨 基酸序列可能存在差異。它可以是具有下述氨基酸序列的突變體蛋白或人工變體，所述氨 基酸序列在由SEQ ID N0 :30所表示的氨基酸序列的一個(gè)或多個(gè)位置包含取代、刪除、插入 或添加一個(gè)或幾個(gè)氨基酸，只要它可以從喹啉酸合成煙酸單核苷酸。
[0051] 喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶可具有從喹啉酸合成煙酸單核苷酸的活性，如反應(yīng)式3 所示。因此，通過(guò)刪除具有合成煙酸單核苷酸的活性的基因或通過(guò)削弱該基因活性，喹啉酸 在細(xì)胞的產(chǎn)率可以增加。
[0052]〈反應(yīng)式3>
[0053] 5-磷酸基-a -D-核糖-1-二磷酸+喹啉酸+2H+〈 = >C02+二磷酸+煙酸核糖核 苷酸
[0054] 可以通過(guò)將編碼喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的內(nèi)源基因取代為修飾的基因以降低 或去除酶的活性，或通過(guò)用弱啟動(dòng)子取代內(nèi)源性基因的啟動(dòng)子，或者通過(guò)從染色體上刪除 編碼酶的內(nèi)源基因，從而降低或去除喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性。
[0055] 在【具體實(shí)施方式】中，在具有改善的生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物中，喹啉酸磷酸核 糖基轉(zhuǎn)移酶將喹啉酸轉(zhuǎn)化為煙酸單核苷酸的活性可以被去除。為此，編碼喹啉酸磷酸核糖 基轉(zhuǎn)移酶的nadC基因可以從該微生物的基因組中通過(guò)同源重組刪除。所述基因nadC的序 列可以通過(guò)大腸桿菌的基因組序列（gi :GI :89109380)獲得，該序列披露于文章（Mol Syst Biol.，2006 ;2 :2006. 0007.，Epub 2006年2月21日），或可從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心 (NCBI)的數(shù)據(jù)庫(kù)或日本DNA數(shù)據(jù)庫(kù)（DDBJ)獲得。另外，編碼本發(fā)明的氨基酸序列的多核苷 酸可包含編碼具有表示為SEQ ID N0 :30的氨基酸序列、或與其同源性為80%或更多的氨 基酸序列、特別是90 %或更多的氨基酸序列、更具體地95 %或更多的氨基酸序列、特別具 體地97 %或更多的氨基酸序列的蛋白的多核苷酸序列，只要它具有與L-天冬氨酸氧化酶 類(lèi)似的活性。最具體地，它可以是由SEQ ID N0 :25所表示的多核苷酸序列。
[0056] 在【具體實(shí)施方式】中，具有生產(chǎn)喹啉酸能力的微生物可以是原核微生物或真核微生 物。
[0057] 在一些實(shí)施方式中，具有生產(chǎn)喹啉酸的能力的微生物的實(shí)例可以屬于以下：腸桿 菌屬（Enterbacter)、埃希桿菌屬（Escherichia)、歐文氏菌屬（Erwinia)、沙雷氏桿菌屬 (Serratia)、普羅維登斯菌屬（Providencia)、棒狀桿菌屬（Corynebacterium)和短桿菌屬 (Brevibacterium)，但不限于此。
[0058] 在【具體實(shí)施方式】中，具有生產(chǎn)喹啉酸能力的微生物可屬于埃希桿菌屬 (Escherichia)〇
[0059] 具體地，具有生產(chǎn)喹啉酸能力的微生物可以是大腸桿菌（E.coli)。
[0060] 本發(fā)明的其他方面提供了生產(chǎn)喹啉酸的方法，其包括：培養(yǎng)含有編碼其中SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多 核苷酸的微生物；并從培養(yǎng)溶液中回收喹啉酸。
[0061]微生物的培養(yǎng)可使用合適的培養(yǎng)基在本領(lǐng)域熟知的合適的培養(yǎng)條件下進(jìn)行。這 樣的培養(yǎng)方法，可以被本領(lǐng)域普通技術(shù)人員使用，并且可根據(jù)所選擇的微生物容易地調(diào) 整。培養(yǎng)方法可包括分批培養(yǎng)型、連續(xù)培養(yǎng)型和加料分批培養(yǎng)型，但并不限于此。培養(yǎng)方 法的多種實(shí)例公開(kāi)在，例如，"Biochemical Engineering"（James M. Lee，Prentice-Hall International Editions, pp 138-176)〇
[0062]在培養(yǎng)過(guò)程中使用的培養(yǎng)基應(yīng)滿(mǎn)足針對(duì)所選擇的微生物的適當(dāng)?shù)臈l件。各種微生 物培養(yǎng)基被公開(kāi)在，例如，"Manual of Methods for General Bacteriology (the American Society for Bacteriology，Washington D.C.，U.S. A，1981)"。例如，培養(yǎng)基中可包含多種 碳源、氮源和微量元素。
[0063]可用于培養(yǎng)基的碳源的實(shí)例可包括碳水化合物，如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、麥芽 糖和淀粉；油和脂肪，如大豆油、葵花油、蓖麻油和椰子油；脂肪酸，如棕櫚酸、硬脂酸和亞 油酸；醇，如乙二醇和乙醇；和有機(jī)酸，如乙酸，它們可以單獨(dú)使用或組合使用，但并不局限 于此。
[0064]可用于培養(yǎng)基的氮源的實(shí)例可包括有機(jī)氮源，例如蛋白胨、酵母提取物、肉提取 物、麥芽提取物、玉米漿（CSL)、大豆粉和尿素；以及無(wú)機(jī)氮源，如硫酸銨、氯化銨、磷酸銨、 碳酸銨和硝酸銨，它們可以單獨(dú)使用或組合使用，但并不限于此。
[0065]可用于該培養(yǎng)基的磷源的實(shí)例可包括磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀和相應(yīng)的含鈉鹽。 在一些實(shí)施方式中，培養(yǎng)基還可以包括金屬鹽，如硫酸鎂或硫酸鐵。在一些實(shí)施方式中，除 了上面列出的組分，培養(yǎng)基還可以包括氨基酸、維生素和適當(dāng)?shù)那绑w?？梢砸苑峙蜻B續(xù)的 方式，向培養(yǎng)溶液中添加用于培養(yǎng)微生物的培養(yǎng)基或單個(gè)組分。
[0066] 在一些實(shí)施方式中，在培養(yǎng)過(guò)程中，培養(yǎng)溶液的pH可以通過(guò)以適當(dāng)?shù)姆绞郊尤牖?合物調(diào)整，例如，氫氧化銨、氫氧化鉀、氨水、磷酸或硫酸。另外，在培養(yǎng)過(guò)程中，可以使用如 脂肪酸的消泡劑（例如，聚乙二醇酯）抑制培養(yǎng)溶液形成泡沫。為了保持培養(yǎng)溶液在需氧 條件下，氧或含氧氣體（例如空氣）可被供給到培養(yǎng)溶液中。培養(yǎng)溶液的溫度可以維持在 約20°C至約45°C的溫度范圍內(nèi)，特別是約25°C至約40°C?？梢猿掷m(xù)培養(yǎng)，直到得到目標(biāo)量 的喹啉，具體地，時(shí)間可為約10小時(shí)至160小時(shí)。
[0067]本發(fā)明的另一個(gè)方面提供了制備煙酸的方法，其包括：培養(yǎng)含有編碼其中SEQ ID NO :1所表示的氨基酸序列的第302位氨基酸被其他氨基酸取代的L-天冬氨酸氧化酶的多 核苷酸的微生物；并通過(guò)添加酸至培養(yǎng)的產(chǎn)物進(jìn)行脫羧反應(yīng)。
[0068] 本文所述的術(shù)語(yǔ)"脫羧反應(yīng)"指的是通過(guò)從喹啉酸除去羧基并釋放二氧化碳的反 應(yīng)以產(chǎn)生煙酸。
[0069]特別地，培養(yǎng)微生物后，所得到的含有喹啉酸的培養(yǎng)溶液可以進(jìn)行離心或膜過(guò)濾 以除去微生物。然后，為了加速脫羧反應(yīng)，提供氫基的酸可以被添加至含有喹啉酸的培養(yǎng)溶 液。可使用任何酸而沒(méi)有限制，只要它能夠提供氫基至培養(yǎng)溶液中。
[0070]在一個(gè)實(shí)施方式中，含有喹啉酸的培養(yǎng)溶液可以無(wú)需純化即使用。
[0071] 在一個(gè)實(shí)施方式中，被添加到培養(yǎng)溶液中的酸可以是鹽酸或硫酸。
[0072] 在一個(gè)實(shí)施方式中，在加入酸后，培養(yǎng)溶液可以具有為約5或更低的pH值，或具體 地可在約2至約3的范圍。
[0073] 在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)溶液的脫羧反應(yīng)可以在約KKTC至約150°C的溫度下進(jìn) 行，或具體地可以在約120°C至約135°C的范圍。
[0074] 在一個(gè)實(shí)施方式中，培養(yǎng)溶液的脫羧反應(yīng)可以在約0. IMPa至約0. 5MPa的壓力下 進(jìn)行，或具體地可以在約〇.2Mpa至約0. 4Mpa的壓力下進(jìn)行。
[0075] 在向含有喹啉酸的培養(yǎng)溶液中加入酸后，緊接著在高溫和高壓的條件下進(jìn)行脫羧 約1小時(shí)至3小時(shí)，在培養(yǎng)溶液中的喹啉酸可轉(zhuǎn)化成煙酸，如反應(yīng)式4所示。
[0076]〈反應(yīng)式4>
[0077]喹啉酸+2H+〈=>C02+煙酸
[0078] 在一個(gè)實(shí)施方式中，生產(chǎn)煙酸的方法還可以包括回收和純化煙酸。
[0079] 在一個(gè)實(shí)施方式中，煙酸的回收可以通過(guò)本領(lǐng)域中通常已知的方法進(jìn)行，包括培 養(yǎng)溶液的過(guò)濾和結(jié)晶方法。
[0080] 有益效果
[0081] 根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式，通過(guò)培養(yǎng)包含L-天冬氨酸氧化酶（其中由煙酸或NAD導(dǎo) 致的反饋調(diào)節(jié)被解除）變體的微生物，有效生產(chǎn)喹啉酸。這些使用微生物的方法可以解決 傳統(tǒng)化學(xué)合成方法的問(wèn)題，該問(wèn)題是關(guān)于由于生成催化劑副產(chǎn)物、高能量消耗和使用不可 再生的資源產(chǎn)生的環(huán)境問(wèn)題，以及傳統(tǒng)生物合成方法產(chǎn)率低的問(wèn)題。因此，這些方法可以有 效地以環(huán)境友好的方式生產(chǎn)喹啉酸和煙酸。

【專(zhuān)利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0082] 附圖1示例了在根據(jù)本發(fā)明的實(shí)施方式生產(chǎn)煙酸的方法中，生產(chǎn)煙酸的途徑。
[0083]發(fā)明方法
[0084] 本發(fā)明將參照下面的實(shí)施例進(jìn)行進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。這些實(shí)施例僅用于說(shuō)明目的， 并不意欲限制本發(fā)明的范圍。
[0085] 實(shí)施例1.制備解除NAD反饋調(diào)節(jié)的L-天冬氨酸氧化酶變體
[0086] 〈1_1>構(gòu)建表達(dá)L-天冬氨酸氧化酶的質(zhì)粒
[0087] 為制備L-天冬氨酸氧化酶變體，將編碼野生型L-天冬氨酸氧化酶的源自大腸桿 菌的nadB基因克隆至表達(dá)載體中。為此目的，大腸桿菌K12 W3110菌株的染色體被用作模 板。該菌株購(gòu)自 American Type Culture Collection(ATCC No. 23257)?；讷@自美國(guó)國(guó) 立衛(wèi)生研究院的GenBank(NIH GenBank)的由SEQ ID NO :24表示的nadB基因的核苷酸 序列（NCBI登記號(hào)"GI :89109380"），構(gòu)建具有限制酶Ndel和BamHI的識(shí)別位點(diǎn)的SEQ ID NO :2和3的引物，以擴(kuò)增nadB基因的0RF區(qū)域，用于基因克隆。
[0088][表1]
[0089]

【權(quán)利要求】
1. L-天冬氨酸氧化酶變體，其具有在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中的第302位氨 基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
2. 權(quán)利要求1的L-天冬氨酸氧化酶變體，其中所述其它氨基酸選自：精氨酸、纈氨酸、 亮氨酸、異亮氨酸、甲硫氨酸、色氨酸和組氨酸。
3. 權(quán)利要求1的L-天冬氨酸氧化酶變體，其中了由煙酸或NAD導(dǎo)致的反饋調(diào)節(jié)被解 除。
4. 多核苷酸，其包含下述的核苷酸序列，所述核苷酸序列編碼在SEQ ID NO :1所示的 氨基酸序列中的第302位氨基酸被其它氨基酸取代的氨基酸序列。
5. 載體，其包含與調(diào)控序列可操作地連接的權(quán)利要求4的多核苷酸。
6. 包含權(quán)利要求4的多核苷酸的微生物。
7. 權(quán)利要求6的微生物，其中該微生物屬于埃希桿菌屬（Escherichia)。
8. 權(quán)利要求6的微生物，其中喹啉酸合成酶的活性是增強(qiáng)的。
9. 權(quán)利要求6的微生物，其中內(nèi)源性喹啉酸磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶的活性是降低的。
10. 生產(chǎn)喹啉酸的方法，該方法包括： 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6的微生物；和 從所述培養(yǎng)基中回收喹啉酸。
11. 生產(chǎn)煙酸的方法，該方法包括： 在培養(yǎng)基中培養(yǎng)權(quán)利要求6的微生物；和 通過(guò)向所述培養(yǎng)基中添加酸，進(jìn)行脫羧反應(yīng)。
【文檔編號(hào)】C12R1/185GK104450638SQ201410588148
【公開(kāi)日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年7月25日 優(yōu)先權(quán)日:2013年7月25日
【發(fā)明者】金素影, 申容旭, 許仁庚, 金朱恩, 羅光鎬, 徐昌一, 孫晟光, 李在熙 申請(qǐng)人:Cj第一制糖株式會(huì)社