表達(dá)重組dsbc并具有降低的tsp活性的細(xì)菌宿主菌株的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，細(xì)胞特征在于：a.包含編碼DsbC的重組多核苷酸；以及b.與野生型細(xì)胞相比其具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。
【專利說明】表達(dá)重組DSBC并具有降低的TSP活性的細(xì)菌宿主菌株
[0001] 本申請是申請日為2011年1月13日、申請?zhí)枮?01180005978. 1、發(fā)明名稱為"表 達(dá)重組DSBC并具有降低的TSP活性的細(xì)菌宿主菌株"的發(fā)明專利申請的分案申請。
[0002] 本本發(fā)明涉及重組細(xì)菌宿主菌株，特別是大腸桿菌（E.Coli)。本發(fā)明還涉及在此 細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法。
[0003] 發(fā)明背景
[0004] 通常將細(xì)菌細(xì)胞，如大腸桿菌，用于生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)。使用細(xì)菌細(xì)胞如大腸桿菌生 產(chǎn)重組蛋白質(zhì)有很多優(yōu)勢，具體而言是因為細(xì)菌細(xì)胞作為宿主細(xì)胞可以使得基因通過質(zhì)粒 插入而具有多樣的屬性。大腸桿菌已經(jīng)用于很多重組蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，包括人胰島素。
[0005] 盡管使用細(xì)菌細(xì)胞產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)有很多優(yōu)勢，但是仍然有顯著的局限性，包括 難以生產(chǎn)蛋白酶敏感型蛋白質(zhì)。蛋白酶在大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)和細(xì)胞質(zhì)中轉(zhuǎn)換老舊、損壞或 折疊錯誤的蛋白質(zhì)上起到重要作用。細(xì)菌蛋白酶起降解目的重組蛋白質(zhì)的作用，因此常常 顯著降低活性蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。
[0006] 已經(jīng)鑒定出大量的細(xì)菌蛋白酶。大腸桿菌中的蛋白酶包括蛋白酶III(ptr)、DegP、 OmpT、Tsp、prlC、ptrA、ptrB、pepA-T、tsh、espc、eatA、clpP和lon〇
[0007]Tsp(也稱為Prc)為一種60kDa的細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶。第一個已知的Tsp底物 為青霉素結(jié)合蛋白質(zhì) _3(PBP3)(Determinationofthecleavagesiteinvolvedin C-terminalprocessingofpenicillin-bindingprotein3ofEscherichiacoli； NagasawaH,SakagamiY,SuzukiA,SuzukiH,HaraH,HirotaY.JBacteriol. 1989Nov； 171 (11):5890-3 和Cloning,mappingandcharacterizationoftheEscherichiacoli TspgenewhichisinvolvedinC-terminalprocessingofpenicillin-binding protein3；HaraH,YamamotoY,HigashitaniA,SuzukiH,NishimuraY.J Bacteriol. 1991Aug;173 (15) :4799-813)，但后來發(fā)現(xiàn)Tsp還能夠裂解噬菌體尾巴蛋白 質(zhì)，因此將其改名為尾特異性蛋白酶（TailSpecificProtease,Tsp) (5;[]^61'等人，？1'〇(3. Natl.Acad.Sci.USA, 89:295-299(1992))。Silber等人（Deletionoftheprc(tsp) geneprovidesevidenceforadditionaltail-specificproteolyticactivityin EscherichiacoliK-12;Silber，K.R.，Sauer,R.T.;MolGenGenet1994242:237-240)描 述了一種prc刪除菌株（KS1000)，其中的突變是通過將包含Kanr標(biāo)記物的片段取代prc基 因的片段而形成的。
[0008]Tsp(prC)活性降低對降低目的蛋白的蛋白水解是可取的。然而，發(fā)現(xiàn) 缺少蛋白酶prc的細(xì)胞在低滲透壓下顯示出熱敏感生長概況。Hara等人分離了 含有基因外抑制子（spr)突變的耐熱性回復(fù)突變株（Hara等人，MicrobialDrug Resistance, 2:63-72(1996))。spr為18kDa的膜結(jié)合細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶，spr的底物為Tsp 以及外膜中參與細(xì)胞分裂中細(xì)胞壁水解的肽聚糖。spr基因標(biāo)記為UniProtKB/Swiss-Prot P0AFV4(SPR_EC0LI) 〇
[0009] 包含有突變spr基因的蛋白酶缺陷菌株已有描述。Chenetal(ChenC,Snedecor B,NishiharaJC,JolyJC,McFarlandN,AndersenDC,BattersbyJE,Champion KM.BiotechnolBioeng. 2004Mar5 ;85 (5) :463-74)描述了攜帶prc(Tsp)及另一種蛋白酶DegP的不同突變組合的大腸桿菌菌株的構(gòu)建，是通過擴增基因上游及下游區(qū)域并將其一起 連接于包含選擇性標(biāo)記物及sprW174R突變的載體上而產(chǎn)生的（重組抗體片段在大腸埃希 式桿菌的細(xì)胞周質(zhì)中高水平積累需要三重突變體（ADegPAprcSprW174R)宿主菌株。發(fā)現(xiàn) ADegP、Aprc和sprW174R突變的組合提供最高水平的抗體輕鏈、抗體重鏈及F(ab'）2-LZ。 EP1341899公開了在編碼蛋白酶DegP和Prc的染色體DegP和prc分別有缺陷的大腸桿菌 菌株，此菌株還具有突變spr基因，其編碼的蛋白質(zhì)抑制了包含prc突變體的菌株表現(xiàn)出的 生長表型。
[0010] 蛋白質(zhì)-硫鍵異構(gòu)酶為在蛋白質(zhì)折置時，"[隹化其中半胱；氣fe殘基見-硫鍵形成和 斷裂的酶。已知其與催化二硫鍵形成的蛋白質(zhì)共表達(dá)而改善宿主細(xì)胞中的蛋白質(zhì)表達(dá)。 W098/56930公開了一種在細(xì)菌中產(chǎn)生含二硫鍵的異源多肽的方法，其中原核二硫鍵異構(gòu)酶 如DsbC或DsbG與真核多肽共表達(dá)。US6673569公開了包含編碼DsbA、DsbB、DsbC和DsbD 中每種的多肽的人工操縱子，用于產(chǎn)生外源蛋白質(zhì)。EP0786009公開了用于在細(xì)菌中生產(chǎn)異 源多肽的過程，其中在誘導(dǎo)編碼異源多肽的核酸表達(dá)之前誘導(dǎo)編碼DsbA或DsbC的核酸表 達(dá)。
[0011]DsbC是一種發(fā)現(xiàn)于大腸桿菌細(xì)胞周質(zhì)中的原核蛋白質(zhì)，其催化大腸桿菌中二硫 鍵的形成。DsbC的氨基酸序列長度為236(包括信號肽），分子量為25.6KDa(UniProt No.POAEGGhDsbC于 1994年首次發(fā)現(xiàn)（Missiakas等人TheEscherichiacolidsbC(xprA) geneencodesaperiplasmicproteininvolvedindisulfidebondformation,TheEMB0 Journalvol13,no8,p2013-2020, 1994 以及Shevchik等人CharacterizationofDsbC,a periplasmicproteinofErwiniachrysanthemiandEscherichiacoliwithdisulfide isomeraseactivity,TheEMB0Jounralvol13,no8,p2007-2012, 1994)〇
[0012] 出乎意料地發(fā)現(xiàn)在革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞中由重組DsbC過表達(dá)DsbC改善了缺乏蛋 白酶Tsp的細(xì)胞的細(xì)胞裂解表型。因此，本發(fā)明提供了新菌株，其具有用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì) 的優(yōu)勢特性。
[0013] 發(fā)明概述
[0014] 本發(fā)明提供了重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，細(xì)胞的特征在于：
[0015]a)包含編碼DsbC的重組多核苷酸；以及
[0016]b)與野生型細(xì)胞相比，具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性。
[0017] 在一個實施方式中，細(xì)胞包含野生型spr基因。在此實施方式中，優(yōu)選地，除了降 低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾之外，細(xì)胞基因組與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。
[0018] 在一個進(jìn)一步的實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比具有降低的 Tsp蛋白質(zhì)活性，并包含編碼DsbC的重組多核苷酸以及突變spr基因。在此實施方式中，優(yōu) 選地，除了突變spr基因以及相比野生型細(xì)胞降低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾之外，細(xì)胞基 因組與野生型細(xì)菌細(xì)胞是同基因的。
[0019] 具有上述特定遺傳修飾特定組合的革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞顯示出優(yōu)勢的生長以及 蛋白質(zhì)生產(chǎn)表型。
[0020] 本發(fā)明還提供了用于生產(chǎn)目的蛋白質(zhì)的方法，包括在如上文限定的重組革蘭氏陰 性細(xì)菌細(xì)胞中表達(dá)目的蛋白質(zhì)。所述方法包括在能夠有效表達(dá)目的蛋白質(zhì)及編碼DsbC的 重組多核苷酸的條件下，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)如上文限定的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞；以及從 重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中回收目的蛋白質(zhì)。
[0021] 附圖簡述
[0022] 圖1顯示了表達(dá)抗-TNFFab'的菌株MXE001、MXE008以及表達(dá)抗-TNFaFab'和 重組DsbC的菌株MXE001和MXE008的生長概況。
[0023] 圖2顯示了表達(dá)抗-TNFFab'和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE001、MXE008和 MXE009的細(xì)胞周質(zhì)（陰影圖標(biāo)）及上清（空的非陰影圖標(biāo)）中抗-TNFFab'產(chǎn)量。
[0024] 圖3顯示了表達(dá)抗-TNFFab'的大腸桿菌菌株MXE001和MXE008以及表達(dá)抗-TNF Fab'和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE001和MXE008的細(xì)胞周質(zhì)（陰影圖標(biāo)）及上清（空 的非陰影圖標(biāo)）中抗-TNFFab'產(chǎn)量。
[0025] 圖4顯示表達(dá)FabA和FabB的大腸桿菌菌株W3110以及表達(dá)FabA和重組DsbC 或FabB和重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008的細(xì)胞周質(zhì)的抗-TNFFab'產(chǎn)量。
[0026] 圖5a顯示了野生型ptr(蛋白酶III)和敲除突變的ptr(蛋白酶III)的蛋白質(zhì) 及基因序列的5'末端。
[0027] 圖5b顯示了野生型Tsp和敲除突變的Tsp的蛋白質(zhì)及基因序列的5'末端。
[0028] 圖5c顯示了野生型DegP及突變DegP蛋白質(zhì)和基因序列的區(qū)域。
[0029] 圖6顯示了用于產(chǎn)生根據(jù)本發(fā)明實施方式的細(xì)胞的載體的構(gòu)建。
[0030] 圖7顯示了表達(dá)抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008的5L和200L 發(fā)酵物的生長概況比較。
[0031] 圖8顯示了表達(dá)抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008哦5L和200L 發(fā)酵物的Fab'滴度比較。
[0032] 圖9顯示了表達(dá)抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008和MXE009的 發(fā)酵物的生長概況的比較。
[0033] 圖10顯示了表達(dá)抗-TNFFab'及重組DsbC的大腸桿菌菌株MXE008和MXE009的 發(fā)酵物的Fab'滴度的比較。
[0034] 序列簡述
[0035]SEQIDNO: 1是野生型Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上游的6個核苷酸 ATGAAC。
[0036] SEQIDN0:2是野生型Tsp蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0037]SEQIDN0:3是突變的敲除Tsp基因的DNA序列，包括起始密碼子上游的6個核苷 酸ATGAAT。
[0038]SEQIDN0:4是野生型蛋白酶III基因的DNA序列。
[0039]SEQIDN0:5是野生型蛋白酶III蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0040]SEQIDN0:6是突變的敲除蛋白酶III基因的DNA序列
[0041]SEQIDN0:7是野生型DegP基因的DNA序列。
[0042] SEQIDN0:8是野生型DegP蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0043]SEQIDN0:9是突變DegP基因的DNA序列。
[0044]SEQIDN0:10是突變DegP蛋白質(zhì)的氨基酸序列。
[0045]SEQIDN0:11是抗-TNF抗體輕鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
[0046]SEQIDNO: 12是抗-TNF抗體重鏈可變區(qū)的氨基酸序列。
[0047]SEQIDNO: 13是抗-TNF抗體輕鏈的氨基酸序列。
[0048]SEQIDN0:14是抗-TNF抗體重鏈的氨基酸序列。
[0049] 3￡〇10勵:15是用于突變!'鄧基因區(qū)域的3'寡核苷酸引物的序列，包含4此1限 制性位點。
[0050] 3￡〇10勵:16是用于突變!'鄧基因區(qū)域的5'寡核苷酸引物的序列，包含4此1限 制性位點。
[0051] SEQIDN0:17是用于突變蛋白酶III基因區(qū)域的3'寡核苷酸引物的序列，包含 AseI限制性位點。
[0052]SEQIDN0:18是用于突變蛋白酶III基因區(qū)域的5'寡核苷酸引物的序列，包含 AseI限制性位點。
[0053] SEQIDN0:19是用于突變DegP基因區(qū)域的5'寡核苷酸引物的序列，包含AseI 限制性位點。
[0054] SEQIDN0:20是用于突變DegP基因區(qū)域的3'寡核苷酸引物的序列，包含AseI 限制性位點。
[0055] SEQIDN0:21是野生型spr基因的序列，包括信號序列，S卩，前26個氨基酸殘基。
[0056] SEQIDN0:22是野生型的spr基因序列，不包括信號序列。
[0057] SEQIDN0:23是突變OmpT序列的核苷酸序列，包括D210A和H212A突變。
[0058] SEQIDN0:24是突變OmpT序列的氨基酸序列，包括D210A和H212A突變。
[0059]SEQIDN0:25是突變敲除OmpT序列的核苷酸序列。
[0060]SEQIDN0:26是帶his標(biāo)簽的DsbC的核苷酸序列。
[0061]SEQIDN0:27是帶his標(biāo)簽的DsbC的氨基酸序列。
[0062]SEQIDN0:28 顯示了hTNF40 的CDRH1 氨基酸序列。
[0063]SEQIDN0:29顯示了hTNF40的CDRH2的氨基酸序列，其為雜合CDR，其中C-端六 個氨基酸來自人亞群3種系抗體（humansubgroup3)的H2⑶R序列，且由此雜合產(chǎn)生的序 列中氨基酸變化由下劃線標(biāo)出，如下：WINITIGEPIYAD^XKG。
[0064]SEQIDN0:30 顯示了 hTNF40 的CDRH3 氨基酸序列。
[0065]SEQIDN0:31 顯示了 hTNF40 的CDRL1 氨基酸序列。
[0066]SEQIDN0:32 顯示了 hTNF40 的CDRL2 氨基酸序列。
[0067]SEQIDN0:33 顯示了 hTNF40 的CDRL3 氨基酸序列。
[0068] SEQIDN0:34 顯示了 hTNF40 的CDRH2 氨基酸序列。
[0069]SEQIDNO: 35顯示了OmpA寡核苷酸轉(zhuǎn)接子的序列。
[0070]SEQIDN0:36顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列1(IGS1)的寡核苷 酸盒。
[0071]SEQIDN0:37顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列2 (IGS2)的寡核苷 酸盒。
[0072]SEQIDN0:38顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列3 (IGS3)的寡核苷 酸盒。
[0073]SEQIDN0:39顯示了編碼用于大腸桿菌Fab表達(dá)的基因間序列4 (IGS4)的寡核苷 酸盒。
[0074] 本發(fā)明優(yōu)選實施方式詳述
[0075] 現(xiàn)在將以更詳細(xì)的方式描述本發(fā)明。
[0076]除非上下文另有說明，術(shù)語"蛋白質(zhì)"和"多肽"在本文交換使用。"肽"意欲指代 10或更少的氨基酸。
[0077] 除非上下文另有說明，術(shù)語"多核苷酸"包括基因、DNA、cDNA、RNA、mRNA等。
[0078] 如本文所使用的，術(shù)語"包含"在本說明書的上下文中應(yīng)解釋為"包括"。
[0079] 在本發(fā)明的上下文中，非突變的細(xì)胞或?qū)φ占?xì)胞指的是與本發(fā)明重組革蘭氏陰性 細(xì)胞相同類型的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞未修飾以降低Tsp蛋白質(zhì)活性或攜帶重組DsbC基因和 任選的突變spr基因。例如，非突變細(xì)胞可為野生型細(xì)胞，并可與本發(fā)明細(xì)胞進(jìn)行修飾引入 任何所述突變之前衍生自相同的宿主細(xì)胞群體。
[0080] 詞句"細(xì)胞"、"細(xì)胞系"、"細(xì)胞培養(yǎng)物"及"菌株"可交換使用。
[0081] 詞句"包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型"在本發(fā)明上下文中指的是帶有突變Tsp基 因的細(xì)胞表現(xiàn)出的表型。一般地，包含突變Tsp基因的細(xì)胞會裂解，尤其是在高細(xì)胞密度下 裂解。這些細(xì)胞的裂解引起任何重組蛋白質(zhì)滲漏入上清。攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞還可以 顯示出低滲透壓下的熱敏型生長。例如，細(xì)胞顯示不出生長速率或生長速率降低，或在高溫 (如40°C或更高）下，細(xì)胞在低滲培養(yǎng)基中死亡。
[0082]術(shù)語"同基因的"在本發(fā)明的上下文中指的是與所述細(xì)胞來源的野生型細(xì)胞相比， 本發(fā)明細(xì)胞的基因組除了與野生型細(xì)胞相比降低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾和任選的突 變spr基因外具有幾乎相同或相同的核算序列。在此實施方式中，細(xì)胞基因組不包含其他 非天然發(fā)生的或遺傳工程改造的突變。在一個實施方式中，與野生型細(xì)胞相比，本發(fā)明的細(xì) 胞的基因組除了與野生型細(xì)胞相比降低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾和任選的突變spr基因 外具有基本上相同或相同的基因組序列。在一個實施方式中，考慮到任何可以天然發(fā)生的 突變，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞與野生型細(xì)胞相比除了與野生型細(xì)胞相比降低Tsp蛋白質(zhì)活性所 需的修飾和任選的突變spr基因外有幾乎相同的基因組序列，包含任何可以發(fā)生的天然發(fā) 生的突變。在一個實施方式中，與野生型細(xì)胞相比，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞除了與野生型細(xì)胞相 比降低Tsp蛋白質(zhì)活性所需的修飾（任選地為突變spr基因）外可以具有完全相同的基因 組序列。
[0083]編碼DsbC的重組多核苷酸可存在于轉(zhuǎn)化入細(xì)胞和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的 合適的表達(dá)載體上。在編碼DsbC的重組多核苷酸插入到宿主基因組的實施方式中，由于 具有插入的編碼DsbC的重組多核苷酸，本發(fā)明的細(xì)胞也與野生型細(xì)胞不同。優(yōu)選地，編碼 DsbC的重組多核苷酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體上，因此對宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。
[0084]在一個實施方式中，本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸。在此實施方 式中，編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸可包含于轉(zhuǎn)化入細(xì)胞和/或整合入宿主細(xì)胞基因組的合 適的表達(dá)載體內(nèi)。在編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸插入宿主基因組的實施方式中，由于插入 的編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸，本發(fā)明的細(xì)胞也與野生型細(xì)胞不同。優(yōu)選地，編碼目的蛋白 質(zhì)的多核苷酸是在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)載體上，因此對宿主細(xì)胞基因組造成破壞最小。
[0085]術(shù)語"野生型"在本發(fā)明的上下文中指的是可以在自然中發(fā)生或可分離自環(huán)境 而不攜帶任何遺傳工程改造突變的革蘭氏陰性細(xì)胞菌株。大腸桿菌野生型菌株的實例為 W3110,如W3110K-12 菌株。
[0086] 本發(fā)明的
【發(fā)明者】提供了適合于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，其與 野生型細(xì)胞相比具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性并包含編碼DsbC的重組多核苷酸。
[0087] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包括編碼DsbC的重組多核苷酸。如本文所使用的，"重組多肽" 指的是使用重組DNA技術(shù)構(gòu)建或產(chǎn)生的蛋白質(zhì)。編碼DsbC的多核苷酸序列可與細(xì)菌細(xì)胞中 發(fā)現(xiàn)的編碼DsbC的內(nèi)源序列同一。備選地，編碼DsbC的重組多核苷酸序列為野生型DsbC 序列的突變形式，例如，其有移除的限制性位點，如EcoRI位點，和/或具有編碼his標(biāo)簽的 序列。用于本發(fā)明的修飾DsbC核苷酸序列的一個實例顯不于SEQIDN0:26,其編碼帶his 標(biāo)簽的DsbC氨基酸序列，顯示于SEQIDNO: 27。
[0088] 我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在與野生型細(xì)胞相比具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性的細(xì)菌細(xì)胞中表 達(dá)編碼DsbC的重組多核苷酸這樣的特定組合和在在優(yōu)選的實施方式中再組合突變spr基 因，提供了用于表達(dá)目的蛋白質(zhì)的改良的宿主。上述遺傳突變的特定組合提供了新菌株，其 相比于攜帶敲除突變Tsp基因的細(xì)胞具有改善的細(xì)胞健康和生長表型。攜帶突變Tsp基因 的細(xì)胞可以具有良好的細(xì)胞生長速率，但是這些細(xì)胞的一個限制在于其易于裂解，尤其是 在高的細(xì)胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細(xì)胞表型為易于裂解，尤其在高的細(xì)胞密度 下。然而，本發(fā)明細(xì)胞中DsbC的表達(dá)抑制了Tsp降低的表型，因此細(xì)胞顯示出降低的裂解 情況。
[0089] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞相比于攜帶敲除突變Tsp基因的細(xì)胞顯示出提高的蛋白質(zhì)生 產(chǎn)產(chǎn)量。提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以為細(xì)胞中蛋白質(zhì)生產(chǎn)速率和/或蛋白質(zhì)生產(chǎn)的持續(xù)時間。 所述提高的蛋白質(zhì)產(chǎn)量可以為細(xì)胞周質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量和/或上清蛋白質(zhì)產(chǎn)量。在一個實施方 式中，由于從細(xì)胞的滲漏減少，相比于攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞，本發(fā)明的細(xì)胞顯示出提高 的細(xì)胞周質(zhì)蛋白質(zhì)產(chǎn)量。所述重組細(xì)菌細(xì)胞可以能夠以更快的速率產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)，因此， 相比于包含突變Tsp基因的細(xì)胞，相同量的目的蛋白質(zhì)可在更短的時間內(nèi)產(chǎn)生。所述產(chǎn)生 目的蛋白質(zhì)的更快速率可以在細(xì)胞生長的起始階段內(nèi)表現(xiàn)尤其顯著，例如在誘導(dǎo)蛋白質(zhì)表 達(dá)后的前5、10、20或30小時內(nèi)。
[0090] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選地在細(xì)胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中表達(dá)目的蛋白質(zhì)的最大產(chǎn) 量為大約 1. 〇g/L、l. 5g/L、l. 8g/L、2. 0g/L、2. 4g/L、2. 5g/L、3. 0g/L、3. 5g/L或 4.Og/L。
[0091] 與野生型細(xì)胞相比，本發(fā)明提供的細(xì)胞具有降低的蛋白酶活性，其可降低目的重 組蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)裂解，尤其對于對Tsp蛋白酶具有蛋白質(zhì)裂解敏感型的目的蛋白質(zhì)。因 此，與野生型細(xì)菌細(xì)胞相比，由本發(fā)明提供的細(xì)胞提供了完整蛋白質(zhì)優(yōu)選目的蛋白質(zhì)的更 高產(chǎn)量以及蛋白質(zhì)優(yōu)選目的蛋白質(zhì)的的更低產(chǎn)量或優(yōu)選地不產(chǎn)生蛋白質(zhì)裂解片段。
[0092] 本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠使用本領(lǐng)域熟知的方法容易地測試候選的細(xì)胞克隆以確 定其是否具有想要的目的蛋白產(chǎn)量，所述方法包括發(fā)酵方法、ELISA以及蛋白質(zhì)GHPLC。 合適的發(fā)酵方法描述于HumphreysDP等人（1997)。FormationofdimericFabsin E.coli:effectofhingesizeandisotype,presenceofinterchaindisulphide bond,Fab,expressionlevels,tailpiecesequencesandgrowthconditions. J.IMMUNOL.METH. 209:193-202;BacklundE.ReeksD.MarklandK.WeirN.Bowering L.LarssonG.FedbatchdesignforperiplasmicproductretentioninEscherichia coli,JournalArticle.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tJournalofBiotechnology. 1 35 (4) : 358-65, 2008Jul31；ChampionKM.NishiharaJC.JolyJC.ArnottD.Similarity oftheEscherichiacoliproteomeuponcompletionofdifferentbiopharmaceutical fermentationprocesses.[JournalArticle]Proteomics. 1 (9):1133-48,2001Sep；and HornU.StrittmatterW.KrebberA.KnupferU.KujauM.WenderothR.MullerK.Matzku S.PluckthunA.RiesenbergD.Highvolumetricyieldsoffunctionaldimeric miniantibodiesinEscherichiacoli，usinganoptimizedexpressionvectorand high-cell-densityfermentationundernon-limitedgrowthconditions,Journal Article.ResearchSupport,Non-U.S.Gov'tAppliedMicrobiology&Biotechnology. 46(5 -6) :524-32, 1996Dec。技術(shù)人員還可容易地使用本領(lǐng)域熟知方法，如蛋白質(zhì)GHPLC、圓二色 譜、匪R、X-光晶體成像及表位親和力測量方法，測試分泌蛋白質(zhì)以確定蛋白質(zhì)是否正確折 疊。
[0093] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞還表達(dá)如下的一種或多種蛋白質(zhì)：
[0094] ?一種或多種能夠促進(jìn)細(xì)胞折疊的蛋白質(zhì)，如FkpA、Skp、SurA、PPiA和PPiD;和/ 或
[0095] ?-種或多種能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌或易位的蛋白質(zhì)，如SecY、SecE、SecG、SecYEG、 SecA、SecB、FtsY和Lep;和 / 或
[0096] ?-種或多種能夠促進(jìn)二硫鍵形成的蛋白質(zhì)，如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0097] 可將一種或多種以上蛋白質(zhì)整合入細(xì)胞基因組和/或插入表達(dá)載體。
[0098] 在一個實施方式中，根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含編碼以下一種或多種其他蛋白質(zhì)的重 組多核苷酸：
[0099] ?一種或多種能夠促進(jìn)細(xì)胞折疊的蛋白質(zhì)，如？1^^、51^、511^、？?14和？?10;和
[0100] ?-種或多種能夠促進(jìn)蛋白質(zhì)分泌或易位的蛋白質(zhì)，如SecY、SecE、SecG、SecYEG、 SecA、SecB、FtsY和Lep;和
[0101] ?-種或多種能夠促進(jìn)二硫鍵形成的蛋白質(zhì)，如DsbA、DsbB、DsbD、DsbG。
[0102] 在本發(fā)明的實施方式中，細(xì)胞還包含突變spr基因。Spr蛋白質(zhì)為大腸桿菌膜結(jié)合 細(xì)胞周質(zhì)蛋白酶。
[0103]spr蛋白質(zhì)的野生型氨基酸序列顯示于SEQIDN0:21 (包含N-端信號序列）及 SEQIDN0:22 (不含26個氨基酸的信號序列）（根據(jù)UniProt登記號P0AFV4)。本發(fā)明中 Spr蛋白質(zhì)序列的氨基酸編號包括信號序列。因此，spr蛋白質(zhì)的1號氨基酸為顯不于SEQ IDN0:21中的第一個氨基酸（Met)。
[0104] 在根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞包含突變spr基因的實施方式中，突變spr基因優(yōu)選地為細(xì) 胞的染色體spr基因。突變spr基因編碼能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞表型的spr蛋 白質(zhì)。攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞可以具有良好的細(xì)胞生長速率，但是這些細(xì)胞的一個限制 在于其易于裂解，尤其是在高的細(xì)胞密度下。因此，包含突變Tsp基因的細(xì)胞表型為易于裂 解，尤其在高的細(xì)胞密度下。攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞還顯示出在低滲條件下的熱敏感型 生長。然而，本發(fā)明細(xì)胞攜帶的spr突變在引入具有降低的Tsp活性的細(xì)胞中抑制了Tsp 降低的表型，因此細(xì)胞顯示出降低的裂解情況，尤其在高的細(xì)胞密度下。細(xì)胞生長表型可由 本領(lǐng)域技術(shù)人員在搖瓶培養(yǎng)或高細(xì)胞密度發(fā)酵技術(shù)中容易地進(jìn)行測量。對細(xì)胞裂解表型的 抑制可見于改善的生長速率和/或重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)尤其是細(xì)胞周質(zhì)中，由攜帶spr突變體 并具有降低Tsp活性的細(xì)胞相比于攜帶Tsp突變體及野生型spr的細(xì)胞所表現(xiàn)出的。
[0105] 根據(jù)本發(fā)明的細(xì)胞優(yōu)選地包含編碼spr蛋白質(zhì)的突變spr基因，其在選自N31、 R62、170、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144、H145、G147、H157和W174的一個或多個氨基酸處具有突變，優(yōu)選地，在選自C94、S95、V98、Y115、 D133、V135、H145、G147、H157和W174的一個或多個氨基酸處具有突變。優(yōu)選地，突變spr基 因編碼的spr蛋白質(zhì)在選自N31、R62、I70、Q73、C94、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、 V135、L136、G140、R144、H145、G147和H157的一個或多個氨基酸處具有突變，優(yōu)選地，在選 自C94、S95、V98、Y115、D133、V135、H145、G147和H157的一個或多個氨基酸處具有突變。 在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。優(yōu)選地，突變spr基因編碼的spr 蛋白質(zhì)選自N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、 R144和G147的在一個或多個氨基酸處具有突變，優(yōu)選地，在選自S95、V98、Y115、D133、V135 和G147的一個或多個氨基酸處具有突變。在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何 其他突變。
[0106] 本發(fā)明的
【發(fā)明者】已鑒定出能夠抑制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的生長表型的spr突 變。
[0107] 出乎意料地，本
【發(fā)明者】發(fā)現(xiàn)相比相比于包含突變Tsp基因的細(xì)胞，攜帶重組DsbC 基因、新的突變spr基因并與野生型細(xì)胞具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性的細(xì)胞顯示出增加的 細(xì)胞生長速率及增加的細(xì)胞存活時間。具體地，相比于攜帶突變Tsp基因的細(xì)胞，攜帶重組 DsbC基因、spr突變以及具有降低的Tsp蛋白質(zhì)活性的細(xì)胞顯示出降低的細(xì)胞裂解表型。
[0108] 對一個或多個以上spr氨基酸的突變可為對編碼所述氨基酸的一個、兩個或三個 核苷酸的任何合適的錯義突變。突變將氨基酸殘基變成任何合適的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制 包含突變Tsp基因表型的突變spr蛋白質(zhì)。錯義突變可將氨基酸變?yōu)橄啾扔谝吧桶被?不同大小和/或具有不同化學(xué)特性的氨基酸。
[0109] 在一個實施方式中，突變是對C94、H145和H157構(gòu)成的催化三分子中的一個、兩 個或三個氨基酸殘基進(jìn)行的突變（SolutionNMRStructureoftheNlpC/P60Domainof LipoproteinSprfromEscherichiacoliStructuralEvidenceforaNovelCysteine PeptidaseCatalyticTriad,Biochemistry, 2008, 47, 9715-9717)〇
[0110] 因此，突變spr基因可包含：
[0111] ?對C94的突變；或
[0112] ?對H145的突變；或
[0113] ?對H157的突變；或
[0114] ?對C94和H145的突變；或
[0115] ?對C94和H157的突變；或
[0116] ?對H145和H157的突變；或
[0117] ?對C94、H145 和H157 的突變。
[0118] 在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。
[0119]C94、H145和H157中的一個、兩個或三個可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑 制包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。例如，C94、H145和H157中的一個、兩個 或三個可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。因此，spr蛋白質(zhì)可具有C94A、H145A和H157A突 變中的一個、兩個或三個。優(yōu)選地，spr基因包含錯義突變H145A、已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其產(chǎn)生能夠抑制 包含突變Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。
[0120] 對本文的置換突變體的標(biāo)記由字母+數(shù)字+字母構(gòu)成。第一個字母標(biāo)記野生型蛋 白質(zhì)中的氨基酸。數(shù)字指的是進(jìn)行氨基酸置換的位置，第二個字母標(biāo)記用于置換野生型氨 基酸的氨基酸。
[0121] 在一個優(yōu)選的實施方式中，突變spr蛋白質(zhì)包含在選自N31、R62、170、Q73、S95、 V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、G140、R144 和G147 的一個或多個氨基酸處 的突變，優(yōu)選地為選自S95、V98、Y115、D133、V135和G147的一個或多個氨基酸處的突變。 在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。因此，突變spr基因可包含：
[0122] ?對N31的突變；或
[0123] ?對R62的突變；或
[0124] ?對170的突變；或
[0125] ?對Q73的突變；或
[0126] ?對S95的突變；或
[0127] ?對V98的突變；或
[0128] ?對Q99的突變；或
[0129] ?對R100的突變；或
[0130] ?對L108的突變；或
[0131] ?對Y115的突變；或
[0132] ?對D133的突變；或
[0133] ?對V135的突變；或
[0134] ?對L136的突變；或
[0135] ?對G140的突變；或
[0136] ?對R144的突變；或
[0137] ?對G147的突變。
[0138] 在一個實施方式中，突變spr蛋白質(zhì)包含氨基酸的多重突變：
[0139] .595和丫115;
[0140] ?N31、Q73、R100 和G140;
[0141] ?Q73、R100 和G140;
[0142].RIOO和G140;
[0143] .Q73 和G140;或
[0144] .Q73 和R100;或
[0145] ?R62、Q99 和R144;或
[0146] .Q99 和R144。
[0147] 氨基酸N31、R62、170、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、Y115、D133、V135、L136、 G140、R144和G147中的一個或多個可突變?yōu)槿魏魏线m的氨基酸，產(chǎn)生能夠抑制包含突變 Tsp基因的細(xì)胞的表型的spr蛋白質(zhì)。例如，N31、R62、I70、Q73、S95、V98、Q99、R100、L108、 Y115、D133、V135、L136、G140和R144中的一個或多個可突變?yōu)樾“被崛鏕ly或Ala。
[0148] 在一個優(yōu)選的實施方式中，spr蛋白質(zhì)包含以下突變中的一個或多個：N31Y、 R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C。優(yōu)選地，spr蛋白質(zhì)包含以下突變中的一個或多個：S95F、V98E、 Y115F、D133A、V13?或V135G和G147C。在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不含有任何其 他突變。
[0149] 在一個實施方式中，spr蛋白質(zhì)具有選自N31Y、R62C、I70T、Q73R、S95F、V98E、 Q99P、R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D或V135G、L136P、G140C、R144C和G147C的一個突 變。在此實施方式中，spr蛋白質(zhì)優(yōu)選地不具有任何其他突變。
[0150] 在一個進(jìn)一步的實施方式中，spr蛋白質(zhì)具有多重突變，選自：
【權(quán)利要求】
1. 重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞，特征在于所述細(xì)胞： a. 包含含有編碼DsbC的重組多核苷酸的表達(dá)載體； b. 具有突變的Tsp基因，其編碼與野生型非突變Tsp相比，具有50%或更低蛋白酶活 性的Tsp蛋白質(zhì)；并且 c. 具有除了突變的Tsp基因外，與野生型大腸桿菌W3110菌株同基因的基因組。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含編碼突變spr蛋白質(zhì)的突變spr 基因，所述突變 spr 蛋白質(zhì)具有選自 H157A、N31Y、R62C、I70T、Q73R、C94A、S95F、V98E、Q99P、 R100G、L108S、Y115F、D133A、V135D、V135G、L136P、G140C、R144C、H145A 和 G147C 的一個或 多個突變。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述spr蛋白質(zhì)的一個或多個突變選自S95F、V98E、 Y115F、D133A、V135D、V135G 和 G147C。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3的細(xì)胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有突變S95F和 Y115F。
5. 根據(jù)權(quán)利要求2的細(xì)胞，其中所述突變spr基因編碼的spr蛋白質(zhì)具有選自C94A、 D133A、H145A 和 H157A 的突變。
6. 根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞進(jìn)一步包含一種或多種以下突變基因： a. 編碼具有分子伴侶活性和降低的蛋白酶活性的DegP蛋白質(zhì)的突變DegP基因； b. 突變ptr基因，其中所述突變ptr基因編碼具有降低的蛋白酶活性的蛋白酶III或 其為敲除突變ptr基因；以及 c. 突變OmpT基因，其中所述突變OmpT基因編碼具有降低的蛋白酶活性的OmpT蛋白質(zhì) 或其為敲除突變OmpT基因。
7. 根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含的突變Tsp基因編碼與野生型非突變 Tsp相比，具有50%或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)或為敲除突變Tsp基因。
8. 根據(jù)權(quán)利要求6的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含的突變Tsp基因編碼與野生型蛋白質(zhì) Tsp相比，具有50%或更低的蛋白酶活性的Tsp蛋白質(zhì)或為敲除突變Tsp基因。
9. 根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞具有敲除突變基因，其包含對基 因起始密碼子的突變和/或位于基因起始密碼子下游和基因終止密碼子上游的一個或多 個終止密碼子。
10. 根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述敲除突變Tsp基因包含由對基因起 始密碼子的錯義突變和任選地一個或多個其它點突變產(chǎn)生的限制性標(biāo)記物位點。
11. 根據(jù)權(quán)利要求7或權(quán)利要求9的細(xì)胞，其中所述敲除突變Tsp基因包含SEQ ID N0:3。
12. 根據(jù)權(quán)利要求1或6的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列。
13. 根據(jù)權(quán)利要求1的細(xì)胞，其中所述細(xì)胞包含含有編碼DsbC的重組多核苷酸以及編 碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的載體。
14. 根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)胞，其中所述載體包含控制編碼DsbC的重組多核苷酸以及編 碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列的表達(dá)的啟動子。
15. 根據(jù)權(quán)利要求14的細(xì)胞，其中所述目的蛋白質(zhì)為抗體或其抗原結(jié)合片段。
16. 根據(jù)權(quán)利要求15的細(xì)胞，其中所述抗體或其抗原結(jié)合片段對TNF具有特異性。
17. 用于產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的方法，其包括： a. 在能夠有效表達(dá)目的重組蛋白質(zhì)及編碼DsbC的重組多核苷酸的條件下，在培養(yǎng)基 中培養(yǎng)根據(jù)權(quán)利要求1-16中任何一項限定的重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞；以及 b. 從重組革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞的細(xì)胞周質(zhì)和/或培養(yǎng)基中回收目的蛋白質(zhì)。
18. 根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中編碼目的蛋白質(zhì)的多核苷酸序列與編碼DsbC的重組 多核苷酸的表達(dá)是通過向培養(yǎng)基中添加誘導(dǎo)子而進(jìn)行誘導(dǎo)的。
19. 根據(jù)權(quán)利要求17或18的方法，其中所述方法進(jìn)一步包括將目的蛋白質(zhì)與DsbC分 離。
【文檔編號】C12N1/21GK104328079SQ201410591520
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2011年1月13日 優(yōu)先權(quán)日:2010年1月14日
【發(fā)明者】M·埃里斯, D·P·哈姆費雷斯 申請人:Ucb醫(yī)藥有限公司