一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法
【專利摘要】本發(fā)明一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，屬于遺傳工程涉及的DNA或RNA的純化方法【技術(shù)領(lǐng)域】。包括：將PCR產(chǎn)物置于96孔板中；在96孔板里加磁珠，再加酒精，振蕩混勻；室溫下靜置，然后在磁力架上吸附，使溶液變清后除去酒精；再加入酒精靜置，然后除去酒精；重復(fù)上述步驟一次，然后除去酒精；從磁力架上取下96孔板，放置到50℃的96孔加熱塊上；往96孔板中加入滅菌的去離子水，振蕩混勻，離心后室溫靜置；將96孔板放置到磁力架上，即得磁珠純化產(chǎn)物。本發(fā)明的方法具有把沒有反應(yīng)完的染料去除的更干凈，去離子經(jīng)濟(jì)、方便、實(shí)用，還可有效去掉染料峰的優(yōu)點(diǎn)。
【專利說明】一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于遺傳工程涉及的DNA或RNA的純化方法【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法。

【背景技術(shù)】
[0002]在分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)過程中，通常會(huì)對(duì)質(zhì)?；騊CR產(chǎn)物進(jìn)行常規(guī)測(cè)序，如何對(duì)測(cè)序產(chǎn)物進(jìn)行純化對(duì)測(cè)序結(jié)果速度和質(zhì)量有很重要的影響。目前測(cè)序公司或?qū)嶒?yàn)室常用的純化方法是酒精/醋酸鈉(酒精/NaAc)法或Centricon-1OO純化柱(PN:N930-2119)法，酒精/醋酸鈉法純化時(shí)間長(zhǎng)，大約需120min左右，純化柱法雖然耗時(shí)短，但是價(jià)格昂貴。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003]本發(fā)明的目的在于公開了一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法。
[0004]本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的:
[0005]1、一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，包括下述步驟:
[0006](I)、將10 μ L測(cè)序PCR產(chǎn)物置于96孔板中；
[0007](2)、在96孔板里加10 μ L磁珠，然后再加41 μ L濃度為85%的酒精，振蕩混勻；
[0008](3)、在室溫下靜置3min，然后在磁力架上吸附3min使溶液變清后除去上清液；
[0009](4)、再加入100 μ L濃度為85%的酒精靜置30sec，然后除去上清液；
[0010](5)、重復(fù)步驟⑷一次，然后除去上清液；
[0011](6)、從磁力架上取下96孔板，放置到50°C的96孔加熱塊上30sec到Imin ；
[0012](7)、往96孔板中加入30 μ L滅菌的去離子水，振蕩混勻，離心lOsec，在室溫靜置3min,使DNA片段從磁珠上徹底分離；
[0013](8)、將96孔板放置到磁力架上3min，即得磁珠純化產(chǎn)物。
[0014]上述技術(shù)方案所述的一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，其中，驟
(2)中的磁珠為克勞寧BCB-300。
[0015]上述技術(shù)方案所述的一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，其中，步驟⑶、(6)和(9)中所述的的磁力架為Amb1n，AM10027。
[0016]本發(fā)明中的測(cè)序PCR產(chǎn)物是sanger測(cè)序法(雙脫氧終止法)的產(chǎn)物。
[0017]本發(fā)明具有以下有益效果:
[0018]1、本發(fā)明步驟(3)中混勻后在室溫放置3分鐘，由于磁珠一般在4°C冰箱保存，在室溫靜置的目的主要為了使磁珠和DNA片段充分結(jié)合。
[0019]2、在本發(fā)明的純化步驟(4)和(5)中加10ul 85%酒精洗滌兩次，目的是把沒有反應(yīng)完的染料去除的更干凈，多余的染料會(huì)影響序列讀取結(jié)果，尤其是在80bp處的染料峰。
[0020]3、由于96孔板在空氣中干燥不能徹底干燥，因此在本發(fā)明步驟￠)中將96孔板在50°C金屬浴(即50°C的96孔加熱塊上)干燥30秒，由于金屬浴上能同時(shí)并快速把酒精蒸發(fā)干凈，這樣就解決了 96個(gè)孔無法在短時(shí)間內(nèi)每個(gè)都沒有殘留酒精，如果有酒精殘留會(huì)嚴(yán)重影響序列讀取結(jié)果。
[0021]4、本發(fā)明純化步驟(7)中采用滅菌去離子水；具有用去離子經(jīng)濟(jì)、方便、實(shí)用，還可有效去掉染料峰的優(yōu)點(diǎn)。
[0022]5、本發(fā)明的純化方法采用的磁珠是克勞寧BCB-300，磁力架為Amb1n公司的貨號(hào)為AM10027的產(chǎn)品；不同的磁力架對(duì)磁珠的吸附能力和吸附方式完全不一樣，這款磁力架是柱式磁力架，磁珠被吸附到管壁的側(cè)面，當(dāng)磁珠吸附后，溶液更容易被吸出來。與本發(fā)明采用的磁力架相比，Axygen 一款磁力架，磁珠被吸附到底部，再取溶液時(shí)磁珠容易吸出來，如果磁珠被污染到溶液了，磁珠會(huì)損傷測(cè)序毛細(xì)管。

【專利附圖】

【附圖說明】
:
[0023]1、圖1為酒精/NaAc純化的測(cè)序結(jié)果；
[0024]2、圖2為采用本發(fā)明方法純化的測(cè)序結(jié)果。

【具體實(shí)施方式】
:
[0025]為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗(yàn)例對(duì)本發(fā)明一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法作進(jìn)一步的說明。
[0026]實(shí)施例1:一種高通量的簡(jiǎn)便怏諫的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法:
[0027](I)、將10 μ L測(cè)序PCR產(chǎn)物置于96孔板中；
[0028](2)、在96孔板里加1yL克勞寧BCB-300磁珠，然后再加41 μ L濃度為85%的酒精，振蕩混勻；
[0029](3)、在室溫下靜置3min，然后在Amb1n公司的AM10027磁力架上吸附3min使溶液變清后除去上清液；
[0030](4)、再加入100 μ L濃度為85%的酒精靜置30sec，然后除去上清液；
[0031](5)、重復(fù)步驟(4) 一次，然后除去上清液；
[0032](6)、從Amb1n公司的AM10027磁力架上取下96孔板，放置到50°C的96孔加熱塊上 30sec 到 Imin ；
[0033](7)、往96孔板中加入30 μ L滅菌的去離子水，振蕩混勻，離心lOsec，在室溫靜置3min,使DNA片段從磁珠上徹底分離；
[0034](8)、將96孔板放置到Amb1n公司的AM10027磁力架上3min，即得磁珠純化產(chǎn)物。
[0035]在上述步驟(4)中應(yīng)盡可能地去掉酒精，因?yàn)樵诰凭杏卸嘤嗟娜玖虾推渌廴疚?；在上述步驟(6)中采用放置到50°C的96孔加熱塊上30sec到Imin的原因在于這一步干燥時(shí)的溫度不能太高或時(shí)間太長(zhǎng)，避免帶熒光的產(chǎn)物信號(hào)衰減。
[0036]在測(cè)序時(shí)直接將所得磁珠純化產(chǎn)物20 μ L上機(jī)進(jìn)行測(cè)序。
[0037]上述步驟中的測(cè)序PCR產(chǎn)物可以通過下述方法制備:
[0038]測(cè)序PCR反應(yīng)體系:DNA(當(dāng)DNA為質(zhì)粒時(shí)為100_150ng，當(dāng)DNA為PCR產(chǎn)物時(shí)為1ng), BigDye Terminator 0.5mL, BigDyeSeq Buffer 1.75mL,濃度為 lpmol/μ L 的引物
1.6mL,滅菌去離子水4.75L,總體積1L ；
[0039]測(cè)序PCR熱循環(huán)條件:96°CImin ； (96°C 1sec，50°C 5sec，60°C 4min) X 25 個(gè)循環(huán)；4 C保溫。
[0040]通過對(duì)相同的測(cè)序PCR產(chǎn)物用傳統(tǒng)的酒精/NaAc純化(常規(guī)方法)和本發(fā)明所述的方法進(jìn)行純化，結(jié)果如圖1和圖2所示，其中圖1為酒精/NaAc純化的測(cè)序結(jié)果，圖2為本發(fā)明方法純化的測(cè)序結(jié)果；由圖1可以看出由于酒精/NaAc純化的測(cè)序產(chǎn)物，不能完全去掉多余的染料，在70bp左右會(huì)出現(xiàn)染料峰，而圖2中本發(fā)明方法純化的產(chǎn)物能把多余染料去除干凈，在70bp左右沒有染料峰，多余的染料峰會(huì)影響測(cè)序結(jié)果。
[0041]以上所述，僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并非對(duì)本發(fā)明作任何形式上和實(shí)質(zhì)上的限制，凡熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案范圍內(nèi)，當(dāng)可利用以上所揭示的技術(shù)內(nèi)容，而作出的些許更動(dòng)、修飾與演變的等同變化，均為本發(fā)明的等效實(shí)施例；同時(shí)，凡依據(jù)本發(fā)明的實(shí)質(zhì)技術(shù)對(duì)以上實(shí)施例所作的任何等同變化的更動(dòng)、修飾與演變，均仍屬于本發(fā)明的技術(shù)方案的范圍內(nèi)。
【權(quán)利要求】
1.一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，包括下述步驟: (1)、將10μ L測(cè)序PCR產(chǎn)物置于96孔板中； (2)、在96孔板里加10μ L磁珠，然后再加41 μ L濃度為85%的酒精，振蕩混勻； (3)、在室溫下靜置3min，然后在磁力架上吸附3min使溶液變清后除去上清液； (4)、再加入100μ L濃度為85%的酒精靜置30sec，然后除去上清液； (5)、重復(fù)步驟(4)一次，然后除去上清液； (6)、從磁力架上取下96孔板，放置到50°C的96孔加熱塊上30sec到Imin； (7)、往96孔板中加入30μ L滅菌的去離子水，振蕩混勻，離心lOsec，在室溫靜置3min,使DNA片段從磁珠上徹底分離； (8)、將96孔板放置到磁力架上3min，即得磁珠純化產(chǎn)物。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，其特征在于:步驟(2)中的磁珠為克勞寧BCB-300。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種高通量的簡(jiǎn)便快速的測(cè)序產(chǎn)物磁珠純化方法，其特征在于:步驟(3)、(6)和(9)中所述的的磁力架為Amb1n，AM10027。
【文檔編號(hào)】C12N15/10GK104293771SQ201410592951
【公開日】2015年1月21日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】董志, 李桂瀾 申請(qǐng)人:北京大學(xué)