一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株及其在海藻降解中的應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，分類命名為膠質(zhì)芽孢桿菌(Bacillus mucilaginosus)，已于2013年11月15日保藏于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏編號(hào)為CGMCC No.8478。本發(fā)明還涉及膠質(zhì)芽孢桿菌在海藻降解中的應(yīng)用。本發(fā)明所述膠質(zhì)芽孢桿菌菌株具有較強(qiáng)的海藻降解能力，利用該菌株降解海藻，所得降解液中海藻酸的含量≥15g/l，與現(xiàn)有生物降解技術(shù)相比明顯提高。此外，該菌株還具有強(qiáng)降解纖維素、蛋白質(zhì)和海藻膠的能力，發(fā)酵液中維素酶活≥48.5U/ml，蛋白酶活≥4.5U/ml，海藻膠裂解酶活≥0.855U/ml。CGMCC No847820131115
【專利說(shuō)明】一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株及其在海藻降解中的應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株及其在海藻降解中的應(yīng)用，屬于生物技術(shù)（微 生物）領(lǐng)域。

【背景技術(shù)】
[0002] 海藻（Alga)是生長(zhǎng)在海中的藻類，是植物界的隱花植物。它們一般被認(rèn)為是簡(jiǎn)單 的植物，主要特征為：無(wú)維管束組織，沒(méi)有真正根、莖、葉的分化現(xiàn)象；不開(kāi)花，無(wú)果實(shí)和種 子；生殖器官無(wú)特化的保護(hù)組織，常直接由單一細(xì)胞產(chǎn)生孢子或配子；以及無(wú)胚胎的形成。 海藻屬低等植物，種類繁多。根據(jù)海藻中所含色素的不同，可將其分為綠藻（如石莼）、褐藻 (如海帶、馬尾藻、海藻、巨藻等）、藍(lán)藻（如束毛藻）、黃藻（如海球藻）、金藻（如鈣板藻） 等。
[0003] 海藻中除含有大量的非含氮有機(jī)物和一定數(shù)量的氨基酸、蛋白質(zhì)和微量元素外， 還含有海洋生物所特有的海藻多糖、海藻酸以及陸生植物稀有的鋅、溴、碘等礦質(zhì)元素。
[0004] 海藻酸是一種優(yōu)質(zhì)的農(nóng)業(yè)增產(chǎn)劑，它是以海藻為原料，用降解技術(shù)提取制得的。海 藻的降解方法一般可分為化學(xué)水解法、物理提取法和生物發(fā)酵法。目前國(guó)內(nèi)外絕大部分廠 家主要采用化學(xué)水解法降解海藻，采用化學(xué)水解法最大的劣勢(shì)在于強(qiáng)堿高溫會(huì)破壞海藻內(nèi) 源物質(zhì)的活性。生物發(fā)酵法的原理是利用微生物在以海藻等為養(yǎng)分的代謝過(guò)程中產(chǎn)生的多 種酶，將構(gòu)成海藻的大分子物質(zhì)降解成小分子、水溶性的物質(zhì)，因?yàn)榘l(fā)酵過(guò)程沒(méi)有化學(xué)法的 強(qiáng)堿和高溫，也沒(méi)有物理法的高壓和低溫，因此最大限度完整地保留了海藻中的生物活性 物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。
[0005] 中國(guó)發(fā)明專利CN98101040中公開(kāi)了一種功能型海藻肥料的生產(chǎn)方法。該方法采 用海洋生物褐藻為主要原料，以氫氧化鉀為消化劑，消化溫度為70°C?KKTC，可使褐藻 中所含的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、微量元素和天然生長(zhǎng)調(diào)節(jié)物質(zhì)，成為利于被植物吸收的可溶性狀態(tài)。 該發(fā)明以氫氧化鉀為消化劑會(huì)破壞海藻內(nèi)源物質(zhì)的活性，降低海藻肥的使用效果。
[0006] 中國(guó)發(fā)明專利CN103689266中公開(kāi)了一種含有海洋生物成分的寵物飼料添加物。 該發(fā)明公開(kāi)了一種含有海藻多糖、殺菌肽、甲殼素和海藻粉的寵物飼料添加物，該添加物可 增加寵物動(dòng)物的抵抗力，減少腸道疾病的發(fā)生。該發(fā)明中的添加物為混合物，沒(méi)有突出某種 成分的作用，且成本比較高。
[0007] 中國(guó)發(fā)明專利CN103039696公開(kāi)了一種海藻發(fā)酵生物飼料的制備方法：采用放線 菌、酵母菌、枯草芽孢桿菌和乳酸菌制備復(fù)合菌劑，對(duì)海藻進(jìn)行發(fā)酵。該技術(shù)的缺點(diǎn)是工藝 復(fù)雜，需要多菌種復(fù)配。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的是提供一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，利用篩選到 的一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株降解海藻，所得降解液中海藻酸的含量> 15g/l，與現(xiàn)有生物降 解技術(shù)相比明顯提高，另外，其它營(yíng)養(yǎng)成分如海藻低聚糖> 5g/l，還原糖> 2g/l，氨基酸 彡lg/1，海藻殘?jiān)闕 %，也有了進(jìn)一步的改善。
[0009] 為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案之一，是提供一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，所述菌 株的分類命名為膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus)，已于2013年11月15日在中國(guó) 微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8478。
[0010] 優(yōu)選地，所述膠質(zhì)芽孢桿菌菌株的菌落大小為10-18mm，無(wú)色透明，圓形，邊緣整 齊，表面光滑濕潤(rùn)，顯微鏡下觀察菌體為桿狀，芽孢中生，有莢膜，革蘭氏反應(yīng)陰性。
[0011] 本發(fā)明的技術(shù)方案之二，是提供一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在降解海藻中的應(yīng)用。
[0012] 優(yōu)選地,所述海藻為泡葉藻、馬尾藻或海帶中的任意一種。
[0013] 優(yōu)選地，所述海藻降解后所得海藻降解液中海藻酸的含量> 15g/l。
[0014] 優(yōu)選地，所述海藻降解后所得海藻降解液中海藻低聚糖> 5g/l，還原糖> 2g/l， 氨基酸彡lg/1，海藻殘?jiān)?lt; 1%。
[0015] 更進(jìn)一步的，所述降解海藻的培養(yǎng)基為海藻50-100重量份，蛋白胨6-10重量份， 氯化鈉1-2重量份，KH 2PO4 0. 5-1重量份，MgSO4 0. 1-0. 5重量份，加水至1000重量份，調(diào)節(jié) pH 至 7-8。
[0016] 所述海藻降解液可作為一種飼料添加劑用于動(dòng)物飼養(yǎng)。
[0017] 本發(fā)明的有益效果：
[0018] (1)本發(fā)明所述膠質(zhì)芽孢桿菌菌株具有較強(qiáng)的海藻降解能力，利用該菌株降解海 藻，所得降解液中海藻酸的含量> 15g/L，與現(xiàn)有生物降解技術(shù)相比明顯提高；
[0019] ⑵海藻降解后的其它營(yíng)養(yǎng)成分海藻低聚糖彡5g/l，還原糖彡2g/l，氨基酸彡Ig/ 1，海藻殘?jiān)?lt; 1%，還含有赤霉素、脫落酸、乙烯、甜菜堿、多胺等生物活性物質(zhì)和鋅、溴、碘 等礦質(zhì)元素；
[0020] (3)本發(fā)明分離篩選得到一株膠質(zhì)芽孢桿菌，該菌株具有強(qiáng)降解纖維素、蛋白質(zhì) 和海藻膠的能力，發(fā)酵液中維素酶活> 48. 5U/ml，蛋白酶活> 4. 5U/ml，海藻膠裂解酶活 ^ 0. 855U/ml ；
[0021] (4)將海藻降解液添加到動(dòng)物飼料中，可改善飼料的營(yíng)養(yǎng)結(jié)構(gòu)，提高飼料的利用 率，調(diào)節(jié)養(yǎng)殖動(dòng)物的機(jī)體代謝，提高免疫力和抗病力，促進(jìn)生長(zhǎng)。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 下面結(jié)合【具體實(shí)施方式】對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)的說(shuō)明。
[0023](一）膠質(zhì)芽孢桿菌的分離篩選
[0024] 2013年7月份從山東膠南蔬菜大棚中共取樣10份，分別取IOg樣品懸浮在IOOml 生理鹽水中，180rpm，振蕩30min。分別取100 μ 1樣品懸浮液均勻涂布平板，本發(fā)明實(shí)施例 中以泡葉藻勻漿培養(yǎng)基為無(wú)菌營(yíng)養(yǎng)液，以克每升計(jì)算，其成分是泡葉藻10. 0、瓊脂15. 0、水 1000ml，pH值7. 5，121 °C滅菌20min，培養(yǎng)溫度為32°C，培養(yǎng)時(shí)間為48小時(shí)。用劃線法接種 到新的泡葉藻平板上，通過(guò)反復(fù)多次劃線得到純菌，共篩選出18株純菌。
[0025] 所得菌株挑取單菌落進(jìn)行搖瓶復(fù)篩，搖瓶培養(yǎng)基選用液體泡葉藻勻漿培養(yǎng)基， 180rpm，32°C，培養(yǎng)64h，對(duì)生長(zhǎng)速度及菌數(shù)進(jìn)行比較，菌株J-2在1%泡葉藻培養(yǎng)基中生長(zhǎng) 穩(wěn)定且菌數(shù)較高，1 %泡葉藻液體培養(yǎng)基中，40h后，顯微鏡下觀察泡葉藻細(xì)胞，細(xì)胞壁被降 解。
[0026] (二）膠質(zhì)芽孢桿菌的分類鑒定
[0027] 菌株J-2形態(tài)特征：菌落大小10-18mm，無(wú)色透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)， 顯微鏡下觀察菌體為桿狀，芽孢中生，有莢膜，革蘭氏反應(yīng)陰性。
[0028] 菌株J-2生理生化特性：見(jiàn)表1。
[0029] 分子遺傳學(xué)分類鑒定：提取菌株J-2的DNA，以該DNA為模板，16S rDNA通用引物 為引物，對(duì)16S rDNA全序列擴(kuò)增，PCR產(chǎn)物進(jìn)行1 %瓊脂糖凝膠電泳，檢測(cè)擴(kuò)增效果。將克 隆后的樣品進(jìn)行測(cè)序。將所得序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行Blast分析比對(duì)，并選取 相似性較高的菌株，利用Mega 4.0軟件采取Neighbor Joining法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。結(jié)果 顯示，菌株J-2與膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus)親緣關(guān)系最近。同時(shí)結(jié)合菌株 的形態(tài)學(xué)特征和生理生化特性，將其歸類為膠質(zhì)芽孢桿菌。
[0030] 表 1
[0031]
[0032]

【權(quán)利要求】
1. 一種膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，其特征在于：其分類命名為膠質(zhì)芽孢桿菌（Bacillus mucilaginosus)已于2013年11月15日在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中 心保藏，保藏編號(hào)為CGMCC No. 8478。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株，其特征在于：所述膠質(zhì)芽孢桿菌菌株的 菌落大小為1〇_18_，無(wú)色透明，圓形，邊緣整齊，表面光滑濕潤(rùn)，顯微鏡下觀察菌體為桿狀， 芽孢中生，有莢膜，革蘭氏反應(yīng)陰性。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在降解海藻中的應(yīng)用。
4. 根據(jù)權(quán)利要求3所述的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在降解海藻中的應(yīng)用，其特征在于，所述 海藻為泡葉藻、馬尾藻或海帶中的任意一種。
5. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在降解海藻中的應(yīng)用，其特征在于，海藻 降解后所得海藻降解液中海藻酸的含量> 15g/l。
6. 根據(jù)權(quán)利要求4所述的膠質(zhì)芽孢桿菌菌株在降解海藻中的應(yīng)用，其特征在于，海 藻降解后所得海藻降解液中海藻低聚糖> 5g/l，還原糖> 2g/l，氨基酸> lg/1，海藻殘?jiān)?d
【文檔編號(hào)】C12N1/20GK104388341SQ201410593441
【公開(kāi)日】2015年3月4日 申請(qǐng)日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】李園園, 劉露, 趙宏濤, 鞠瑞成, 張鵬鵬, 王海鵬 申請(qǐng)人:青島明月藍(lán)海生物科技有限公司