一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法
【專利摘要】本發(fā)明一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，屬于質(zhì)粒擴增【技術(shù)領(lǐng)域】。包括：將10×phi29 DNA聚合酶緩沖液、Hexamer引物、待測樣品和去離子水混合均勻，在95℃加熱3分鐘，然后置于冰上冷卻，得到反應(yīng)液(Ⅰ)；在反應(yīng)液(Ⅰ)中加入濃度為dNTP、100×BSA和phi29 DNA聚合酶，將其混合均勻，在30℃溫育8小時，最后在65℃加熱10分鐘，得到反應(yīng)液(Ⅱ)；將反應(yīng)液(Ⅱ)用滅菌去離子水稀釋3-6倍后，得到用于測序的DNA。本發(fā)明具有可以利用混合質(zhì)粒庫或單一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落作為模板，省去大量提取質(zhì)粒的時間和人力消耗的優(yōu)點。
【專利說明】一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于質(zhì)粒擴增【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方 法。

【背景技術(shù)】
[0002] 在常規(guī)質(zhì)粒sanger測序過程中，一般的方法須準(zhǔn)備測序模板，由過夜培養(yǎng)增菌、 傳統(tǒng)堿裂解法提取質(zhì)粒，搖菌和提質(zhì)粒的過程至少需要16小時以上，如果是低拷貝的質(zhì)粒 提取的產(chǎn)量和質(zhì)量都比較低，這樣直接影響測序結(jié)果。如果大量提取質(zhì)粒（超過1〇〇個樣 本）需要的時間更長，并且消耗更多的人力和成本。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0003] 為了快速大量的得到質(zhì)粒，并且避免大規(guī)模提取質(zhì)粒，滾環(huán)擴增（Rollingcircle amplication,RCA)技術(shù)可用于擴增大的環(huán)狀DNA模板，比如質(zhì)粒DNA。該技術(shù)是借鑒自然 界中環(huán)狀病原生物體DNA分子滾環(huán)式復(fù)制方式建立的核酸擴增技術(shù)，可在室溫下進行，使 用一個隨機引物便可實現(xiàn)線性滾環(huán)擴增，具有快速、靈敏、特異的特點。該技術(shù)擴增得到的 DNA直接可用于sanger測序。
[0004] 本發(fā)明的目的在于公開了一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法。
[0005] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：
[0006] -種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，包括下述步驟：
[0007] (1)、將 10Xphi29DNA聚合酶緩沖液 1.OilL、濃度為lOOiiM的Hexamer引物 2. 5iiL、待測樣品0. 5iiL和去離子水4. 9iiL混合均勻，在95°C加熱3分鐘，然后置于冰上 冷卻，得到反應(yīng)液（I);
[0008] (2)、在反應(yīng)液（I)中加入濃度為 10mM的dNTP0.5iiL、100XBSA0?liiL和 phi29DNA聚合酶0. 5iiL，使總反應(yīng)體系為10. 0iiL，將其混合均勻，在30°C溫育8小時，最 后在65°C加熱10分鐘，得到反應(yīng)液（II );
[0009](3)、將步驟（2)中得到的反應(yīng)液（II )用滅菌去離子水稀釋3-6倍后，得到可直 接用于測序的DNA。
[0010] 上述技術(shù)方案所述的一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，其中，步驟（1)中 的待測樣品選自通過轉(zhuǎn)化獲得陽性菌落、凍存的甘油菌液或細胞培養(yǎng)液中的一種。
[0011] 上述技術(shù)方案所述的一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，其中，步驟（3)中 所述測序為sanger測序。
[0012] 本發(fā)明具有以下有益效果：
[0013] 1、與傳統(tǒng)的以提取所得的DNA為模板的技術(shù)相比，本發(fā)明的方法可以利用混合質(zhì) 粒庫或單一質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌落作為模板；
[0014] 2、與傳統(tǒng)的利用特異的雙引物擴增，只能擴增特異DNA，利用了phi29DNA聚合酶 的鏈替換活性和聚合活性的技術(shù)相比，本發(fā)明的方法利用phi29DNA聚合酶的滾環(huán)復(fù)制特 點，利用隨機的引物可以擴增任何菌落的質(zhì)粒DNA，尤其是低拷貝的質(zhì)粒，在菌落里數(shù)目較 少，如果利用質(zhì)粒小提法不能提取出來的DNA濃度不能滿足測序要求，而利用RCA擴增可以 放大質(zhì)粒的濃度達到測序目的；
[0015] 3、本發(fā)明的方法可以利用96孔板高通量的擴增質(zhì)粒，省去大量提取質(zhì)粒的時間 和人力消耗；
[0016] 4、本發(fā)明的方法擴增出來的DNA主要用于測序反應(yīng)；
[0017] 5、本發(fā)明的方法在在PCR儀或沙浴中30°C下反應(yīng)8小時即可，與傳統(tǒng)的PCR儀中 30攝氏度反應(yīng)10-15小時方法相比，縮短了反應(yīng)時間。

【專利附圖】

【附圖說明】：
[0018] 1、圖1為采用本發(fā)明方法擴增后的DNA產(chǎn)物；
[0019] 2、圖2為圖1中擴增產(chǎn)物列2的測序結(jié)果。

【具體實施方式】：
[0020] 為使本發(fā)明的技術(shù)方案便于理解，以下結(jié)合具體試驗例對本發(fā)明一種用于測序的 高通量擴增質(zhì)粒的方法作進一步的說明。
[0021] 試驗例1 :一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法:
[0022] 1、待測樣品為通過轉(zhuǎn)化獲得陽性菌落，或凍存的甘油菌液，或細胞培養(yǎng)液等；
[0023] 2、按照表1中的組成配置反應(yīng)體系，將反應(yīng)體系中各物質(zhì)混合均勻，在95°C加熱3 分鐘，然后置于冰上冷卻，得到反應(yīng)液（I);其中phi29DNA聚合酶為克勞寧公司或NEB公 司產(chǎn)品；Hexamer引物序列為NNNN*N*N，其中N=A、G、C或T，并且*表示硫代磷酸酯鍵，由 上海生工合成；
[0024] 表1反應(yīng)體系
[0025]
[0026]

【權(quán)利要求】
1. 一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，包括下述步驟： (1) 、將 10Xphi29 DNA 聚合酶緩沖液 1. 0 ii L、濃度為 100 ii M 的 Hexamer 引物 2. 5 ii L、 待測樣品〇. 5 ii L和去離子水4. 9 ii L混合均勻，在95°C加熱3分鐘，然后置于冰上冷卻，得 到反應(yīng)液（I ); (2) 、在反應(yīng)液（1)中加入濃度為10禮的(1階130.51^、100\85六0.11^和？1^29 DNA聚合酶0. 5 ii L，使總反應(yīng)體系為10. 0 ii L，將其混合均勻，在30°C溫育8小時，最后在 65°C加熱10分鐘，得到反應(yīng)液（II ); (3) 、將步驟（2)中得到的反應(yīng)液（II )用滅菌去離子水稀釋3-6倍后，得到可直接用 于測序的DNA。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟 (1)中的待測樣品選自通過轉(zhuǎn)化獲得陽性菌落、凍存的甘油菌液或細胞培養(yǎng)液中的一種。
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種用于測序的高通量擴增質(zhì)粒的方法，其特征在于：步驟 (3)中所述測序為sanger測序。
【文檔編號】C12Q1/68GK104328111SQ201410593687
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月29日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月29日
【發(fā)明者】董志, 李桂瀾 申請人:北京大學(xué)