一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型三重pcr檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型，3型和6型三重PCR檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用，該方法包括豬傳染性胸膜肺炎臨床菌株的DNA提取；PCR產(chǎn)物擴(kuò)增，包括在PCR試劑管中加入反應(yīng)液，包括10×PCRbuffer的PCR緩沖液、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs和2型、3型和6型三對特異性異物，以提取的DNA為模板，反應(yīng)液總體積為50μl；最后對擴(kuò)增產(chǎn)物檢測。該方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、操作簡便、省工省時，能同時滿足檢測多種血清型基因的需求，提高了檢測的準(zhǔn)確性和特異性。本發(fā)明能快速、方便的檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型，3型和6型，可用于細(xì)菌鑒定、疾病診斷、臨床疫苗篩選和分子流行病學(xué)調(diào)查與分析，具有廣闊的市場前景和較大的經(jīng)濟(jì)效益。
【專利說明】一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型三重 PCR檢測方法、試劑盒及其應(yīng)用

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明涉及一種放線桿菌血清型的PCR檢測方法，屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及 一種豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型的三重PCR檢測方法、試劑盒及其應(yīng) 用。

【背景技術(shù)】
[0002] 豬接觸性傳染性胸膜肺炎又稱壞死性胸膜肺炎，是由胸膜肺炎放線桿菌引起的一 種急性呼吸道傳染病，以急性出血性纖維素性肺炎和慢性纖維素性壞死性胸膜炎為主要特 征。急性者病死率高，慢性者常能耐過。
[0003] 豬接觸性傳染性胸膜肺炎各種年齡的豬均可感染，通常以2?5月齡、體重為 30?60kg的豬多發(fā)。胸膜肺炎放線桿菌是對豬有高度宿主特異性的呼吸道寄生物，急性感 染不僅可在肺部病理變化和血液中見到，而且在鼻液中也有大量細(xì)菌存在。豬群規(guī)模越大， 發(fā)病危險亦越大。本病有明顯的季節(jié)性，多在4?5月和9?11月發(fā)生。病豬和帶菌豬是本 病的主要傳染源，無臨診癥狀有病理變化豬，或無臨診癥狀無病理變化陰性帶菌豬較常見。 如繼發(fā)或并發(fā)其他疾病，常引起臨診癥狀加劇和死亡率升高。該病近年來在我國發(fā)生呈逐 年上升的趨勢，已成為危害養(yǎng)豬業(yè)最嚴(yán)重的疾病之一，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
[0004] 近年來，由放線桿菌所引起的豬接觸性傳染性胸膜肺炎已成為影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的 一種重要細(xì)菌性疾病。發(fā)病后及時釆用抗生素進(jìn)行治療可顯著降低動物死亡率，同時在生 產(chǎn)過程中適當(dāng)添加抗生素也可在一定程度上降低該病的發(fā)生率。但隨著大量抗菌藥特別是 廣譜抗菌藥在養(yǎng)豬業(yè)中的廣泛使用，細(xì)菌對抗菌藥物的耐藥性問題日趨突出，與此同時也 有研究資料表明亞抑制濃度的抗生素可以影響細(xì)菌的代謝過程而改變細(xì)菌的毒力或細(xì)菌 對環(huán)境的適應(yīng)能力等。
[0005] 目前已報道的豬接觸性傳染性胸膜肺炎有15個血清型，各血清型具有特異性，其 血清型特異性取決于加膜多糖和菌體脂多糖。根據(jù)煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的依賴性可把15 個血清型分為兩個生物型。生物I型為煙酰胺腺嘌呤二核苷酸依賴菌株，包括血清型1? 12型和15型；生物II型的生長不依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸，但需要其他特定嘌呤或嘌呤 前產(chǎn)物以輔助生長，包括血清型13、14。其中血清型1和5型又可分為A和B兩個亞型，即 血清型IAUB和5A、5B。此外，還有一些分離到的放線桿菌依據(jù)現(xiàn)在的分類系統(tǒng)還不能劃分 其血清型。
[0006] 不同血清型間致病力有明顯的差異，血清型間不存在交叉保護(hù)力。放線桿菌分布 廣泛，世界各國均有流行。隨著各國之間引進(jìn)種豬的不斷增多，血清型也趨于復(fù)雜。一些國 家或地區(qū)存在多個血清型同時流行，甚至同一豬場內(nèi)還可能存在不同血清型。我國目前已 發(fā)現(xiàn)并分離到血清型有1、2、3、4、5、7、8和15等多種血清型，主要流行血清型有1、3、5和7 型。
[0007] 目前，常用細(xì)菌血清型鑒定方法主要有血凝實(shí)驗(yàn)、ELISA法、PCR法等，其中血凝法 和PCR法最為常用。但是從細(xì)菌分離培養(yǎng)到純化及DNA提取至少需要3-4天才能做出初步 鑒定，不僅費(fèi)時費(fèi)力，結(jié)果也不準(zhǔn)確，而且敏感性差，容易產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，不利于養(yǎng)殖戶 和規(guī)?；髽I(yè)采取相應(yīng)的血清型疫苗和藥物來進(jìn)行及時的治療。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于：提供一種適于豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6 型三重PCR檢測方法，本方法操作簡便、省工省時，可以一次檢測三種目的基因，為豬傳染 性胸膜肺炎放線桿菌臨床菌株的血清定型及檢測提供技術(shù)支持和理論基礎(chǔ)。
[0009] 在上述檢測方法的基礎(chǔ)上，相應(yīng)提供了豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型 和6型三重PCR檢測的試劑盒，以及所述檢測方法在豬接觸性傳染性胸膜肺炎放線桿菌血 清2型、3型和6型三種血清型細(xì)菌中的單個或多個混合感染的樣品檢測中的應(yīng)用。
[0010] 本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：
[0011] 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型的三重PCR檢測方法，包括以下 步驟：
[0012] (1)豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型臨床菌株的DNA提?。?br> [0013] (2)PCR產(chǎn)物擴(kuò)增：擴(kuò)增體系的建立，在PCR試劑管中加入反應(yīng)液，反應(yīng)液包括 10XPCR buffer的PCR緩沖液、MgCl2、Taq DNA聚合酶、dNTPs以及2型、3型和6型三對特 異性異物，以步驟（1)提取的DNA為模板，反應(yīng)液總體積為50 μ 1，擴(kuò)增體系的具體組成如 下：
[0014]

【權(quán)利要求】
1. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型的三重PCR檢測方法，其特征在于， 該方法包括以下步驟： (1) 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型臨床菌株的DNA提??； (2) PCR產(chǎn)物擴(kuò)增：擴(kuò)增體系的建立，在PCR試劑管中加入反應(yīng)液，反應(yīng)液包括IOXPCR buffer的PCR緩沖液、MgCl2、TaqDNA聚合酶、dNTPs以及2型、3型和6型三對特異性異 物，以步驟⑴提取的DNA為模板，反應(yīng)液總體積為50μ1，擴(kuò)增體系的具體組成如下：
其中的三對特異性引物如下：
(3) 擴(kuò)增產(chǎn)物檢測：將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下觀察結(jié)果。
2. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR檢測方法，其特征在于：所述豬傳染性胸膜肺炎放 線桿菌血清2型、3型和6型臨床菌株的DNA提取，包括以下步驟： ① 刮取固體培養(yǎng)基表面的菌落，收集到干凈的離心管中； ② 加入I. 5ml裂解液，裂解液的組成為：0· 15mol/L的NaCl，0.lmol/L的Na2EDTA, 15mg/ ml的溶菌酶，pH= 8. 0 ; ③ 37°C水浴 30min; ④ 加入230μ1無水乙醇，溫和翻轉(zhuǎn)離心管混合均勻，離心； ⑤ 將步驟4中的溶液和絮狀物一起倒入DNA置于收集管的吸附柱中，室溫放置2min; ⑥ 12000rpm離心lmin，棄去收集管，將DNA吸附柱放入另一干凈的收集管中； ⑦ 在DNA吸附柱中加入500μIBuffer, Buffer中酚、氯仿、異戊醇的體積比為 25:24:1，室溫放置2min，12000離心lmin，棄去收集管，將DNA吸附柱放入另一干凈的收集 管中； ⑧ 在DNA吸附柱中加入500μIBuffer醋酸鈉，12000離心lmin，棄廢液，將DNA吸附 柱放回收集管中； ⑨ 重復(fù)步驟8 ; ⑩12000rpm離心2min;將DNA吸附柱轉(zhuǎn)入I. 5ml離心管中，向娃膠模的中央加50μI pH> 7. 0的去尚子水，將L5ml尚心管的蓋子扣在DNA吸附柱上，做好標(biāo)記，去除DNA吸附 柱的蓋子；室溫放置2min, 12000rpm離心Imin,離心結(jié)束后再加入50μIpH彡7. 0的去離 子水；重復(fù)此步驟；
3. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR檢測方法，其特征在于：其中PCR擴(kuò)增時的擴(kuò)增程 序如下：95°C預(yù)變性3min，94°C變性lmin，56°C退火lmin，72°C延伸lmin，33個循環(huán)后72°C 延伸lOmin。
4. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR檢測方法，其特征在于：其中豬傳染性胸膜肺炎放 線桿菌血清3型、6型和2型從上到下的擴(kuò)增長度分別為950bp、730bp和500bp。
5. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的三重PCR檢測方法，其特征在于：瓊脂糖凝膠電泳時的凝膠 濃度為1. 5%，其中含有1%的凝膠燃料，220V電泳lh。
6. 豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型三重PCR檢測的試劑盒，其特征 在于：試劑盒組成包括：PCR試劑管、反應(yīng)緩沖液IOXPCRbuffer、MgCl2、TaqDNA聚合酶、 dNTPs和三對特異性異物，以豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型和6型的DNA為陽 性對照，以副豬嗜血桿菌的DNA為陰性對照； 各成分的具體纟日成：
其中三對特異性引物如下：
7. 權(quán)利要求1所述的PCR檢測方法在檢測豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌血清2型、3型 和6型三種細(xì)菌中的一種或多種混合感染樣品中的應(yīng)用。
【文檔編號】C12Q1/04GK104313163SQ201410593890
【公開日】2015年1月28日 申請日期:2014年10月28日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月28日
【發(fā)明者】李海利, 王克領(lǐng), 朗利敏, 徐引弟, 張立憲, 朱文豪, 張青嫻, 游一, 焦文強(qiáng), 許峰, 鄭萬錄, 施巧婷, 寧忠山 申請人:河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所