一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法
【專利摘要】本發(fā)明提供一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法，本發(fā)明利用一組原產(chǎn)地海產(chǎn)品的 線粒體基因中的細(xì)胞色素氧化酶基因CO1序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)提取的不同的海產(chǎn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生不同的PCR片段的核酸序列。通過不同的基因序列與原產(chǎn)地海產(chǎn)品的CO1基因序列比較，經(jīng)過生物學(xué)分析就可以確定產(chǎn)品的真?zhèn)巍１景l(fā)明建立一種快速、準(zhǔn)確和敏感的認(rèn)證方法來保護(hù)地理標(biāo)志產(chǎn)品。通過水產(chǎn)品中的一組保守基因的收集和擴(kuò)增比對(duì)，給地理標(biāo)志水產(chǎn)品打上分子條形碼從而辨別出原產(chǎn)地，保護(hù)當(dāng)?shù)貪O業(yè)資源，提高當(dāng)?shù)貪O業(yè)競爭力和知名度。
【專利說明】—種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明屬于海產(chǎn)品檢測(cè)，涉及一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法。
技術(shù)背景
[0002]地理標(biāo)志證明商標(biāo)是國際通行的一項(xiàng)制度，對(duì)產(chǎn)地、產(chǎn)品提供質(zhì)量證明，能提高商品對(duì)消費(fèi)者的吸引力。換句話說，地理標(biāo)志就意味著品質(zhì)遠(yuǎn)非其他同類產(chǎn)品可比。運(yùn)用地理標(biāo)志證明商標(biāo)，既能保護(hù)當(dāng)?shù)鬲?dú)有的自然資源、產(chǎn)品和文化遺產(chǎn)，也有助于當(dāng)?shù)貙?shí)施品牌漁業(yè)發(fā)展戰(zhàn)略，提高當(dāng)?shù)貪O業(yè)競爭力，大大提升當(dāng)?shù)氐闹?。而在?shí)際生活中，貼錯(cuò)地理標(biāo)簽的商業(yè)水產(chǎn)品并不少見，尤其是對(duì)那些利潤豐厚的水產(chǎn)品。一些不法商販常以其他地方的水產(chǎn)品假冒當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品，嚴(yán)重?fù)p害了當(dāng)?shù)厮a(chǎn)品的商譽(yù)，破壞了當(dāng)?shù)氐男蜗蟆?br> [0003]按照慣例，帶有地理標(biāo)志證明商標(biāo)的農(nóng)產(chǎn)品價(jià)格普遍比同類產(chǎn)品價(jià)格高出15%?80%，甚至更多，安吉白茶、臨海蜜橘就是最好的例子。如舟山帶魚年捕撈量還有13.6萬噸；稀缺資源大黃魚去年捕撈量也比前些年有所增加；而養(yǎng)殖的三疣梭子蟹總面積達(dá)5萬多畝，產(chǎn)值達(dá)5億多元。如果應(yīng)用分子條形碼技術(shù)快速識(shí)別地理標(biāo)志，將保護(hù)當(dāng)?shù)貪O業(yè)資源，提高當(dāng)?shù)貪O業(yè)競爭力和知名度。
[0004]因此，有必要建立一種快速、準(zhǔn)確和敏感的認(rèn)證方法來保護(hù)地理標(biāo)志產(chǎn)品。通過水產(chǎn)品中的一組保守基因的收集和擴(kuò)增比對(duì)，給地理標(biāo)志水產(chǎn)品打上分子條形碼從而辨別出原產(chǎn)地。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005]本發(fā)明的目的是提供一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法，具體步驟如下:
1.樣品預(yù)處理，取5條新采集來的魚類產(chǎn)品，各取其魚體樣品后，提取總DNA:
Cl)取海產(chǎn)品樣品約0.0lg,放入1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎，加入400 μ LSDS提取緩沖液和8 μ L20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55°C水浴鍋中水浴2 h或者37°C過夜，中間震蕩數(shù)次；
(2)上清液加入300μ L的6M/L NaCl溶液，充分搖均，10000g/min離心30 min ；
(3)上清液移入新管加入等體積的氯仿:異戍醇(24:1)混合液,搖均，10000g/min離心 1min ；
(4)上清液移入新管加入等體積異丙醇，_20°C下沉淀Ih以上，1000g/min離心10
min ；
(5)棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次；
(6)室溫下晾干，加入50μ L TE溶液溶解。_20°C保存，備用。
[0006]2.PCR擴(kuò)增、測(cè)序
利用 COl 基因的通用引物:LCO1409:5 — GGTCAACAAATCATAAAGATATAGG 一 3 和LC02198:5—AAACTTCAGGGTGAC—CAAAAAATCA一 3 進(jìn)行PCR擴(kuò)增。50ul 體系 PCR緩沖液:DNA模版 100 ng, dNTP 0.2 umol/L,引物 I umol/L,續(xù)離子濃度 2 umol/L, Taq 聚合酶 2 umol/L，超純水補(bǔ)至50 uL。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上經(jīng)94°C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性I min，51°C退火90 S，72°C延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸10 min。將擴(kuò)增出的片段進(jìn)行電泳驗(yàn)證，然后測(cè)序；
3.遺傳距離測(cè)定
將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過人工校對(duì)及拼接后，與原產(chǎn)地海產(chǎn)品COl基因庫進(jìn)行比對(duì)，得出相似度。相似度結(jié)果在99.0%以上的即為同一產(chǎn)地海產(chǎn)品。
[0007]本發(fā)明利用一組原產(chǎn)地海產(chǎn)品的線粒體基因中的細(xì)胞色素氧化酶基因COl序列設(shè)計(jì)特異性引物，對(duì)提取的不同的海產(chǎn)品進(jìn)行PCR擴(kuò)增，產(chǎn)生了不同的PCR片段的核酸序列。通過不同的基因序列與原產(chǎn)地海產(chǎn)品的COl基因序列比較，經(jīng)過生物學(xué)分析就可以確定廣品的真?zhèn)巍?br>
【專利附圖】

【附圖說明】
[0008]圖1是實(shí)施例1電泳圖。從左到右條帶是樣品1-5，最后是marker。
[0009]圖2是實(shí)施例2電泳圖。從左到右條帶是樣品1-5，最后是marker。

【具體實(shí)施方式】
[0010]本發(fā)明結(jié)合實(shí)施例作進(jìn)一步的說明。
[0011]實(shí)施例1
一、樣品預(yù)處理(DNA提取)
1、取5條帶魚樣品背部肌肉約0.0lg,編號(hào)dyl, dy2, dy3, dy4, dy5,放入
1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎,加入400 μ L SDS提取緩沖液和8 μ L 20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55°C水浴鍋中水浴2 h或者37°C過夜，中間震蕩數(shù)次。
2、上清加入300μ L的6M/L NaCl溶液，充分搖均，10000g/min離心30 min。
[0012]3、上清移入新管加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混合液，搖均，10000g/min離心 1min0
4、上清移入新管加入等體積異丙醇,_20°C下沉淀Ih以上，10000g/min離心10 min。
[0013]5、棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次。
6、室溫下晾干，加入50 μ L TE溶液溶解。-20°c保存，備用。
[0014]二、PCR 擴(kuò)增
引物序列:LC01409:5 — GGTCAACAAATCATAAAGATATrGG 一 3 和 LC02198:5—71，AAACTTCAGGGTGAC— CAAAAAATCA 一 3
PCR 反應(yīng)體系:50ul 體系，DNA 模版 100 ng, dNTP 0.2 umol/L，引物 I umol/L，鎂離子濃度2 umol/L, Taq聚合酶2 umol/L，超純水補(bǔ)至50 uL。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上經(jīng)94°C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性I min，51°C退火90 S，72°C延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。
[0015]取8 -10 μ I基因組DNA，并加入2 μ I上樣緩沖液，混勻，加樣到1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，IlOv下電泳。條帶如下，大小約為700bp。隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得樣品序列如SEQ ID No:3_7所示。
[0016]三、遺傳距離測(cè)定利用MEGA軟件根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算帶魚樣品與舟山帶魚個(gè)體間的遺傳距離，并根據(jù)遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)樹，個(gè)體間的遺傳距離差異不大，相似范圍在99.85%-100%之間。確定樣品為舟山帶魚。
[0017]實(shí)施例2
一、.樣品預(yù)處理(DNA提取)
1、取5條大黃魚樣品背部肌肉約0.0lg,編號(hào)dhyl , dhy2 , dhy3, dhy4, dhy5,放入1.5mlBuffer管中用無菌小剪刀剪碎,加入400 μ L SDS提取緩沖液和8 μ L20mg/mL的蛋白酶K，混均，放在55°C水浴鍋中水浴2 h或者37°C過夜，中間震蕩數(shù)次。
2、上清加入300μ L的6M/L NaCl溶液，充分搖均，10000g/min離心30 min。
[0018]3、上清移入新管加入等體積的氯仿:異戊醇(24:1)混合液，搖均，10000g/min離心 1min0
4、上清移入新管加入等體積異丙醇,_20°C下沉淀Ih以上，10000g/ min離心10 min。
[0019]5、棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次。
6、室溫下晾干，加入50 μ L TE溶液溶解。-20°c保存，備用。
[0020]二、PCR 擴(kuò)增
引物:LC01409:5 一 GGTCAACAAATCATAAAGATATrGG 一 3 和 LC02198:5—71，AAACTTCAGGGTGAC— CAAAAAATCA 一 3
PCR 反應(yīng)體系:50ul 體系，DNA 模版 100 ng, dNTP 0.2 umol/L，引物 I umol/L，鎂離子濃度2 umol/L, Taq聚合酶2 umol/L，超純水補(bǔ)至50 uL。反應(yīng)在PCR擴(kuò)增儀上經(jīng)94°C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)；94°C變性I min，51°C退火90 S，72°C延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)；72°C延伸 10 min。
[0021 ] 取8 -10 μ I基因組DNA，并加入2 μ I上樣緩沖液，混勻，加樣到1%瓊脂糖凝膠點(diǎn)樣孔中，IlOv下電泳。條帶如下，大小約為700bp。隨后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，獲得樣品序列如SEQ ID No:10-14所示。
[0022]三、遺傳距離測(cè)定
利用MEGA軟件根據(jù)Kimura雙參數(shù)模型計(jì)算帶魚樣品與舟山帶魚個(gè)體間的遺傳距離，并根據(jù)遺傳距離構(gòu)建系統(tǒng)樹，個(gè)體間的遺傳距離差異不大，相似范圍在99.15%-100%之間。確定樣品為舟山大黃魚。
【權(quán)利要求】
1.一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法，其特征在于，通過以下步驟實(shí)現(xiàn): (1)樣品預(yù)處理: (a)取海產(chǎn)品樣品，放入Buffer管中用無菌小剪刀剪碎，加入SDS提取緩沖液和蛋白酶K，混均，放在55°C水浴鍋中水浴2 h或者37°C過夜，中間震蕩數(shù)次， (b)上清液加入6M/LNaCl溶液,充分搖均，10000g/min離心30 min, (c)上清液移入新管加入等體積的24:1氯仿:異戍醇混合液,搖均，10000g/min離心1min, Cd)上清液移入新管加入等體積異丙醇，_20°C下沉淀Ih以上，1000g/ min離心10min, Ce)棄去上清液，沉淀用70%的酒精沖洗兩次，無水乙醇洗一次， (f)室溫下晾干，加入50 μ L TE溶液溶解，-20°C保存，備用； (2)PCR擴(kuò)增、測(cè)序: 利用 COl 基因的通用引物:LC01409:5 — GGTCAACAAATCATAAAGATATAGG 一 3 和LC02198:5—AAACTTCAGGGTGAC— CAAAAAATCA 一 3 進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)在 PCR 擴(kuò)增儀上經(jīng)94°C預(yù)變性5 min，然后進(jìn)入循環(huán)，94°C變性I min，51°C退火90 S，72°C延伸45 S，共35個(gè)循環(huán)，72°C延伸10 min，將擴(kuò)增出的片段進(jìn)行電泳驗(yàn)證，然后測(cè)序； (3)遺傳距離測(cè)定: 將測(cè)序結(jié)果經(jīng)過人工校對(duì)及拼接后，與原產(chǎn)地海產(chǎn)品COl基因庫進(jìn)行比對(duì)，得出相似度，當(dāng)相似度結(jié)果在99.0%以上的即為同一產(chǎn)地海產(chǎn)品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種同一產(chǎn)地海產(chǎn)品檢測(cè)方法，其特征在于，步驟PCR擴(kuò)增用 PCR 緩沖液:DNA 模版 100 ng’dNTP 0.2 umol/L，引物 I umol/L,鎂離子濃度 2 umol/L,Taq聚合酶2 umol/L，超純水補(bǔ)至50 uL。
【文檔編號(hào)】C12Q1/68GK104313165SQ201410596028
【公開日】2015年1月28日 申請(qǐng)日期:2014年10月30日 優(yōu)先權(quán)日:2014年10月30日
【發(fā)明者】鄭剛, 胡富強(qiáng), 楊志堅(jiān), 泮紅文, 陳作國, 蔡勇, 肖金星, 陳磊, 李靜靜 申請(qǐng)人:浙江大學(xué)舟山海洋研究中心